【摘要】目的：探讨谷氨酰胺对急性肺损伤（ALI）小鼠肺内血素加氧酶-1（HO-1）的影响，及其对ALI 的保护作用。方法：30 只昆明小鼠随机分为正常组、ALI 组和谷氨酰胺治疗组（简称治疗组），每组10 只。采用腹腔注射LPS（10 mg/kg）复制小鼠ALI 动物模型，尾静脉注射谷氨酰胺（0.75 g/kg）进行干预治疗。HE 染色观察小鼠肺组织病理改变，ELISA 法检测肺组织炎症因子TNF-α和IL-8 含量，real-time PCR法和western blot 法分别检测HO-1 的mRNA 和蛋白含量，采用试剂盒检测HO-1 的活性，比色法检测小鼠肺组织CO 含量。结果：与正常组相比，ALI 组小鼠肺组织形态学发生明显损伤性改变，TNF-α和IL-8 含量显著增加（均P<0.01），而治疗组上述改变较ALI 组显著减轻（均P<0.01）。
而与正常组相比，ALI 组小鼠肺组织HO-1 mRNA、蛋白和活性，以及CO 含量应激性增加（均P<0.01），而治疗组小鼠肺组织HO-1 mRNA、蛋白和活性，以及CO 含量较ALI 组增加更为明显（均P<0.01）。结论：谷氨酰胺可通过上调HO-1 表达减轻LPS 诱导的小鼠ALI。
【关键词】谷氨酰胺；急性肺损伤；红血素加氧酶-1；一氧化碳；小鼠【中图分类号】 R2 【文献标号】 A 【文章编号】 2095-7165（2015）11-0016-03
急性肺损伤（acute lung injury, ALI）是临床常见急危重症，主要病理及临床表现在有肺水肿、过度炎症反应和呼吸功能衰竭。ALI的常见病因有肺内感染、肺部创伤和急性胰腺炎等，经过多年的临床治疗和科学研究，ALI 的病死率依然很高。因此开发ALI 的新型治疗策略具有重要的临床意义。
血红素加氧酶（heme oxygenase, HO）是机体内催化生成新型气体信号分子CO 的关键酶和限速酶，其中HO-1 是分布最为广泛的亚型，并且在多种应激情况下，可诱导表达增加，发挥内源性的保护作用。研究表明远端肢体缺血预适应可通过上调HO-1 等表达减轻大脑缺血/再灌注损伤[1]；最新研究表明Z-藳本内酯可减轻紫外线诱导的人类角质细胞氧化应激反应和炎症因子的表达，其机制与上调HO-1 的表达进而抑制转录因子NF-κB 的活性有关[2]；而对于疼痛，外源性诱导HO-1 的表达，可以减轻长春新碱诱导的神经病理性疼痛[3]。以上研究提示外源性增加HO-1 的表达对治疗ALI具有一定的前景。
谷氨酰胺是人体内非必需氨基酸，可参与调节炎症反应的多个环节。已有研究表明谷氨酰胺可减轻通气诱导的大鼠ALI[4]，亦可通过上调热休克蛋白72 的表达而减轻LPS 诱导的大鼠ALI[5]。但谷氨酰胺能否通过上调肺内重要的内源性保护因子HO-1/CO 系统而发挥保护作用，目前尚未见相关报道。本研究即通过整体动物实验，探讨谷氨酰胺对HO-1/CO 的调节作用，以及对LPS 诱导的ALI 的保护作用，以期为谷氨酰胺的临床运用提供实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物与分组30 只SPF 级雄性昆明小鼠（18-22 g）购自长沙斯莱克景达实验动物有限公司。适应性喂养1 周后，随机分为3 组，分别为正常组、ALI 组和ALI+谷氨酰胺治疗组（简称治疗组）。ALI 组和治疗组采用腹腔注射LPS（10 mg/kg）复制小鼠ALI 模型，而治疗组于造模前30 min 尾静脉注射谷氨酰胺（0.75 g/kg），正常组均给予相当剂量的生理盐水处理。于注射LPS 后6 h 处死小鼠，进行后续检测。
1.2 小鼠肺组织HE 染色及损伤评分取小鼠左肺上叶经4%多聚甲醛固定后，脱水、常规石蜡包埋，采用连续切片，切片厚度为4 μm。切片经常规方法HE 染色，然后采用普通显微镜观察小鼠肺组织形态学改变，并拍摄照片。根据文献报道[6]从肺泡充血、出血、中性粒细胞浸润和肺泡间隔增厚中透明膜形成4 个方面按轻重进行0~4 分半量评分，各面评分均值作为ALI 的病理损伤评分，并进行统计学分析。
1.3 ELISA 法检测小鼠肺组织TNF-α和IL-8 含量取小鼠肺组织置冰上充分匀浆，根据小鼠TNF-α和IL-8 ELISA检测试剂盒说明书进行操作，最后检测450 nm 波长吸光度值，依据标准曲线计算各小鼠肺组织TNF-α和IL-8 蛋白含量。
1.4 real-time PCR 法检测小鼠肺组织HO-1 mRNA 表达采用TRIzol 裂解小鼠肺组织，经酚-氯仿淬取法提取小鼠肺组织总RNA，采用逆转录试剂盒合成cDNA。以cDNA 为模型，检测肺组织HO-1 mRNA 表达，体系如下：cDNA 2 μL，引物1 μL，Mix 10 μL，水7 μL。其中引物序列为HO-1：上游序列：5’-CACGCATATACCCGCT ACCT-3 ’， 下游序列： 5 ’-CCAGAGTGTTCATTCGAGCA-3’，产物大小175 bp；内参为GAPDH，上游序列：5’-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3’，下游序列：5’-CACATTGGGGGTAGGAA CAC-3’，产物大小171 bp。
结果采用2-△△ct 法计算。
1.5 western blot 法检测小鼠肺组织HO-1 蛋白含量小鼠肺组织经液氮研磨后采用RIPA 提取总蛋白，随后进行SDS-PAGE 凝胶电泳，电泳后将蛋白转至PVDF 膜。采用5% BSA室温封闭2 h，将一抗稀释后（HO-1 一抗稀释比例为1：500，GPADH内参稀释比例为1：2000）4℃孵育过夜。次日TBST 洗膜后孵育二抗（稀释比例为1：1000），室温2 h。洗膜后滴加ECL 发光液，于暗室内X 胶片曝光，条件扫描后与内参的灰度值比值即为其相对表达量。
1.6 小鼠肺组织HO-1 活性检测严格按着试剂盒说明操作。简言之取肺组织经匀浆，采用BCA法检测总蛋白浓度。取200 μL 匀浆液加入等体积反应液（含2mmol/L MgCl2、1 U/mL 肝胆绿素还原酶、1 mmol/L 正铁血红素和2.75 mmol/L NADPH），置37 ℃暗箱中孵育1 h。之后加1 mL 氯仿终止反应。最后取300 μL 采用多功能酶标仪检测400 nm 和650 nm双波长吸光度值，并计算胆红素生成量。
1.7 小鼠肺组织CO 含量检测组织内源性CO 检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所（A101-2），严格按照说明书操作，最后根据计算公式得出小鼠肺组织CO 含量。
1.8 统计学处理计量资料采用SPSS17.0 统计软件进行分析，实验结果以均数±标准差（?X±S）表示，采用单因素方差分析。P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 谷氨酰胺对ALI 小鼠肺组织病理改变的影响正常组小鼠肺组织肺泡腔内无渗出液，肺泡隔完整，无增厚，无炎症细胞浸润。而ALI 小鼠可见肺泡隔增厚，部分肺泡塌陷，可
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论文作者:马玲
论文发表刊物:《医师在线》2015年6月第11期供稿
论文发表时间:2015/8/12
标签：小鼠论文; 组织论文; 酰胺论文; 诱导论文; 肺泡论文; 含量论文; 蛋白论文; 《医师在线》2015年6月第11期供稿论文;