单继宽[1]2001年在《白血病抑制因子受体细胞内区结构与白血病细胞HL-60内分化、增殖信号的关系》文中提出白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor,LIF）是一种多功能的细胞因子，它能够抑制白血病细胞，如HL-60、U937、M1等的增殖。LIF的生物学效应是通过结合靶细胞膜上的LIF受体完成的。LIF首先与LIF受体α亚基（gp190）结合，并使之与另一受体亚基β亚基（gp130）结合形成异源性二聚体，从而启动细胞内信号转导使胞外的信号传入核内，调控特定基因的表达，使细胞产生一系列的生理和病理变化。研究LIF的胞内信号转导对了解LIF发挥生物学功能的分子机制有重要意义。在LIF抑制白血病细胞的增殖的过程中，JAK-STATS通路是LIF产生活性的重要途径，而在众多的STATS中STAT3的激活与白血病细胞的分化关系最为密切，LIF抑制白血病细胞增殖与JAK1和STAT3的激活的关系也已被确定。有关LIF与有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）p42/44的关系，在1994年被Schiemann证实。然而，LIFR两个亚基在启动JAK-STATS途径以及MAPK p42/44的激活中，进而在抑制白血病细胞的增殖中各自有何作用？对这一问题，学者们观点不一。因而，有必要对白血病抑制因子两个亚基在启动信号中的作用做进一步的研究。研究LIF在白血病细胞的信号启动，对了解白血病细胞的分化、增殖异常机理及其调控机制，为白血病的临床治疗提供基础理论依据有重要意义。 本研究利用pAlter突变系统，通过基因重组技术将两受体亚基细胞内区互换构建了两个嵌合受体亚基基因130/190和190/130：130/190由gp130的细胞外区、跨膜区和gp190的细胞内区组成；190/130由gp190的细胞外区、跨膜区和gp130的细胞内区组成。在此基础上，将130/190和190/130装入真核表达载体pEDα，构建了表达载体pED130/190和pED190/130，并用 第二军医大学硕士学位论文 脂质体转染法将其转入HL－60细胞内，并使之分别在HL－60细胞内成功表 达。在LIF 的诱导下，HL60细胞内形成受体亚基细胞内区同源性二聚体 190＊卜190＊t和门0叮卜130。yi：转染昨D13o门go的＊L6o细胞，在＊F的 诱导下，因存在数量上的优势，130／190取代HL－60细胞膜上的野生受体亚 基 gp 30并同另一野生受体亚基 gp 90一起与 LIF结合，所以，受体复合 物的细胞外区仍由一个gp 30和一个gpl90组成，而细胞内区则由gpl90 的细胞内区同源性二聚体启动信号转导；同理，转染pED 90／1 30的HL七0 细胞，则由gp 30细胞内区二聚体传递LIF的信号。通过检测同源性二聚 体引发信号转导后的 HL－60细胞内的 JAK 磷酸化水平、STAT3磷酸化水 平、MpPKp42几4磷酸化水平以及白血病细胞的增殖状况，观察gpl90和 gp 30亚基在LIF引发的信号转导中及其在白血病细胞增殖和分化中各起何 作用。 首先，我们采用免疫沉淀的方法获得 HL60细胞内总 JAK 蛋白，利用 磷酸化抗体通过免疫印迹杂交的方法检测了野生型、转染130／190、转染 190／130叁组细胞 LIF诱导前后的 JAKI的磷酸化水平，结果显示：JAKI的 磷酸化水平在LIF诱导后的野生型细胞组和转染130／190的细胞组较各组诱 导前及190／130组诱导后高。采用免疫组化方法检测了LIF诱导omin、smin、 10min、15min、20min、30min后的叁组细胞的 STAT3 Tyr705磷酸化水平， 并用生物显微图象分析系统量化染色结果，绘制了STAT3磷酸化水平与LIF 诱导的时间依赖性曲线，结果显示：野生组和130／190组细胞的STAT3磷 酸化水平smin起上升，10min时达到顶点，15min时开始下降，20min、30min 基本恢复诱导前水平，而190／130组变化趋势不明显。我们还采用免疫印迹 杂交技术对＊F诱导 10min后的叁组细胞的 SM3 Tyr705磷酸化水平进行 了检测，结果显示：130／190组最高，野生组次之，190／！30组最低。利用 免疫印迹杂交技术检测了LIF诱导6h后的叁组细胞的STAT3的表达水平， 结果显示：野生组和130／190组STAT3较190／130组高。实验表明：gpl90 的细胞内区同源性二聚体具有了与野生型 LIF 受体相同的激活 JAK 和 STAT3的作用。 Jiklm1lSbo．w－－－OfHiedyya’l’1EmbryOlyy．twndMilharyMwhcalUaive’sityShenpe2（XX33 4 第二军医大学颀士学位论文 同样，我们利用免疫组化方法检测了 LIF 诱导 omin、smin、10min、 15min、20min、30min后的叁组细胞的MAPKp42／44 Thr202 Tyr204磷酸化 水平，并用生物显微图象分析系统量化染色结果，绘制了MAPK磷酸化水 平与LIF诱导的时间依赖性曲线，结果发现：LIF诱导10min后，190／130
孙擎[2]2011年在《分泌型多肽TAT-CT3-cMyc对白血病HL-60细胞的生长调节》文中提出白血病是造血系统的恶性疾病。近几年,研究人员提出,应该从分子角度重新认识白血病,开展针对信号分子激活/抑制的研究,为白血病的防治提供新的思路和方法。白血病抑制因子(Leukemia inhibitory factor, LIF)是一种多功能的、作用广泛的细胞因子,为IL– 6细胞因子家族的一员,能够在体外抑制粒系白血病细胞(如人HL-60、U937、小鼠M1系等)的增殖。然而,由于白血病细胞增长快速并对LIF感应能力很差,机体内有限的LIF无法有效抑制白血病细胞的生长[1]。而外源性、非生理剂量的LIF对脂肪细胞、生殖细胞和内分泌细胞等正常细胞具有显着的细胞毒性,同时干扰了细胞因子间的正常协调作用,所以LIF目前还无法直接用于疾病治疗。进一步研究显示,LIF的生物学效应是通过结合靶细胞膜上的LIF受体(LIFR)来实现的。LIFR包括两个亚基--LIFRα(gp190)和LIFRβ(gp130)。其中,LIFRα含有1239个氨基酸,胞外区由789个氨基酸构成,跨膜区由26个疏水氨基酸组成,胞内区由238个氨基酸构成。LIFRα的胞内区共有三个功能域(Box1、Box2和Box3),其主要作用结构为YXXQ(Y为酪氨酸,X为任意氨基酸,Q为谷氨酰胺),是激活细胞内信号分子的必须序列[2]。本教研室前期工作中已证实,通过脂质体转染的方式,将LIFRα细胞内区全长序列(LIFRα-CT)和含Box3功能域的C末端序列(LIFRα-CT3)分别富集于人类急性早幼粒白血病细胞HL-60胞质中,可促进该系白血病细胞的粒细胞方向分化,并有效抑制其增殖潜力[4-9]。但无论是脂质体还是病毒等转染方式,均只能应用于体外试验,因此,研发可用于体内将LIFRα-CT3安全、高效地导入白血病细胞的方法显得非常有意义。近年研究发现,蛋白质转导结构域(Protein Transduction Domain, PTD)可将全长蛋白质、DNA、化学药物、寡核苷酸、40 nm磁珠和200 nm脂质体等[10]携带入细胞/核。目前最常用的PTD是人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)来源的TAT蛋白片段(TAT-PTD),它具有短小、高效、无毒、快速、不影响下游分子生理功能的优良特性,但常用的原核表达体系得到的融合蛋白因缺乏转录后的剪切、翻译修饰,存在低/无生物活性的可能性[11-14]。因此,要获得有活性的TAT-PTD融合蛋白需用真核表达系统。本课题的目的就是利用真核表达系统制备有活性的LIFRα-CT3融合蛋白,并通过蛋白质转导结构域(PTD)将LIFRα-CT3携带入白血病胞内/核内,观察其对白血病细胞系HL-60的作用,并探讨其机制。为此,我们采用基因重组的方法,将LIFRα-CT3、TAT-PTD、出胞信号肽(Signal Sequence,ss)和融合标签cMyc克隆入真核表达载体pcDNA3.0中,成功构建了pcDNA3.0-ss-TAT-CT3-cMyc重组表达载体和对照载体pcDNA3.0-ss-CT3-cMyc;通过FuGENE 6非脂质体转染法将两种载体分别转染入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中,RT-PCR、免疫印迹和免疫荧光检测显示,TAT-CT3-cMyc可在CHO细胞中转录和表达,表明TAT-CT3-cMyc的真核表达系统已建立成功;进一步利用Realtime-PCR筛选获得了高表达的CHO-TAT-CT3-cMyc细胞系。接着,我们将构建好的CHO-CT3-cMyc和CHO-TAT-CT3-cMyc两个细胞系大量扩增后,更换为无血清培养液,72h后,回收培养液和超声粉碎CHO细胞后的上清, 0.45μm滤器过滤后,利用抗cMyc标签凝胶包被的蛋白层析柱纯化目的蛋白,SDS-PAGE电泳检测显示,纯化获得的目的蛋白正确,且纯度高(大于95%),BCA定量检测得知,共获得732μg的TAT-CT3-cMyc多肽和569μg的CT3-cMyc多肽。最后,将获得的TAT-CT3-cMyc多肽和CT3-cMyc多肽分别按终浓度10μg/ml、30μg/ml和50μg/ml加入到人早幼粒白血病细胞系HL-60的培养基中,观察其对细胞生长和分化的影响,并探索可能涉及的信号转导通路。免疫荧光检测显示,作用时间1h时,TAT-CT3-cMyc多肽组HL-60细胞内可见明显阳性反应,但10μg/ml组荧光强度较弱,30μg/ml组和50μg/ml组可见强阳性反应。灰度分析提示,30μg/ml组和50μg/ml组的荧光强度无明显差别,这表明TAT-CT3-cMyc确可将融合蛋白片段带入HL-60细胞内,并富集于胞核,且作用时间1h,剂量30μg/ml是较理想的条件。免疫荧光检测还证实,TAT融合多肽进行转导时,其阳性率在80%以上,荧光强度在30min~1h内即可达到峰值,此后随时间延长而下降,至8h左右时,荧光强度已非常弱,但仍可检测到。流式细胞术检测显示,30μg/ml TAT-CT3-cMyc多肽作用8h的HL-60细胞,CD14和CD11b的表达在72h时明显增高,表明TAT-CT3-cMyc多肽确有促进HL-60细胞朝成熟粒细胞方向分化的功能。CCK-8细胞增殖检测显示,与野生型和添加了CT3-cMyc多肽的HL-60细胞相比,添加了TAT-CT3-cMyc多肽(30μg/ml,连续暴露4天,每天8h)的HL-60细胞增殖明显下降,表明TAT-CT3-cMyc多肽的连续应用对HL-60细胞的增殖有明显抑制作用。免疫印迹检测显示,在不添加Jak2抑制剂(AG-490)的情况下,TAT-CT3-cMyc多肽组的HL-60细胞中,pSTAT3的水平最高;添加了Jak2抑制剂后,TAT-CT3-cMyc多肽组的HL-60细胞中,pSTAT3分子仍有较清晰的表达,表明TAT-CT3-cMyc组的pSTAT3是由TAT融合多肽在不依赖于Jak2分子的情况下独立激活的。为了证实TAT-CT3-cMyc组HL-60细胞的分化确实是由STAT3分子激活引起的,我们在各组添加了STAT3抑制剂,并再次在蛋白水平检测了CD14/CD11b的表达。结果显示,3组细胞的CD14/CD11b表达量均有一定程度的减低但TAT无差别,表明pSTAT3的表达量与HL-60细胞的分化程度呈正相关。激光共聚焦显微镜观察发现,与野生型和CT3-cMyc多肽组HL-60细胞相比,TAT-CT3-cMyc多肽组HL-60细胞中tSTAT3和荧光pSTAT3的表达明显增强,表明TAT-CT3-cMyc多肽可以促进HL-60细胞内信号分子STAT3的聚集和激活,启动STATs相应的信号转导通路。总之,本研究构建了pcDNA3.0-ss-TAT-CT3-cMyc真核表达载体,首次建立了TAT-CT3-cMyc融合蛋白真核表达系统,纯化获得了高纯度且有生物学活性的TAT-CT3-cMyc融合蛋白,并首次发现,TAT-CT3-cMyc融合蛋白可以在短时间内(<1h)高效进入白血病细胞HL-60内,并通过不依赖Jak2的途径激活STAT3磷酸化,促进急性髓系白血病细胞向成熟细胞方向分化并抑制其增殖。这为进一步利用TAT-CT3-cMyc融合蛋白靶向治疗白血病提供了技术支持和理论依据。关键词:白血病抑制因子,信号转导,STAT3,中国仓鼠卵巢细胞,cMyc标签蛋白,TAT蛋白转导结构功能域小结1、TAT-CT3-cMyc融合蛋白可以高效进入白血病细胞HL-60内,促进急性髓系白血病细胞向成熟细胞方向分化。2、TAT-CT3-cMyc融合蛋白在白血病细胞HL-60内游离存在时,可以以独立于Jak2分子的情况下,激活STAT3磷酸化信号通路,影响其增殖与分化进程。3、通常情况下只能用原核表达系统制备的TAT融合蛋白在本试验中采用真核表达体系CHO也能大量制备,且在额外添加了信号肽序列后可以分泌出胞,纯化后仍有生物学活性。
参考文献：
[1]. 白血病抑制因子受体细胞内区结构与白血病细胞HL-60内分化、增殖信号的关系[D]. 单继宽. 第二军医大学. 2001
[2]. 分泌型多肽TAT-CT3-cMyc对白血病HL-60细胞的生长调节[D]. 孙擎. 第二军医大学. 2011
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