赵智凝, 童明庆, 潘世扬, 黄佩珺, 赵旺胜[1]2002年在《Eu标记RT-PCR检测丙型肝炎病毒RNA》文中研究表明目的 采用一种新的铕螯合物BHHCT ,制备高灵敏度荧光标记物 ,建立检测丙型肝炎病毒 (HCV)RNA的方法。方法 采用柱层析纯化的方法抽提血清中HCVRNA。以 5′端带有生物素的引物进行RT PCRTth酶一步法扩增 ,通过固定于微孔板上的捕获探针与带有生物素的PCR扩增产物杂交后 ,利用标记有铕的链霉亲合素与生物素的特异性结合 ,将铕连接到待测核酸上 ,在特定波长的激发光激发下发出荧光 ,进行检测。结果 铕标记检测法与酶标法的变异系数、敏感性、特异性分别为10 .43%、10 0 %,10 0 %与 16 .2 5 %,94%,10 0 %。结论 Eu标记RT PCRTth酶一步法检测HCVRNA ,具有敏感、特异、快速、重复性好、不受环境因素影响和无溴乙锭污染等优点 ,可望取代酶标法及电泳法。
赵智凝[2]2002年在《Eu标记RT-PCR检测丙型肝炎病毒RNA》文中认为背景：丙型肝炎病毒(hepatits C virus，HCV)是丙型肝炎的病原。1990年Weiner等首先建立了逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HCV RNA，近几年来已被广泛应用于HCV的研究。目前，丙型肝炎病毒的检测主要依赖于聚合酶链反应，检测方法主要有两类：一是实时荧光检测，即在扩增的同时进行产物的检测；另一类是对扩增后产物的检测，主要是酶标法检测。镧系元素时间分辨荧光免疫分析(time-resolved fluoroimmunoassay，TRFIA)技术是一种非放射性标记检测技术，在检测的灵敏度、特异性、测量范围、检测速度以及标记物稳定性方面显示出很大的优越性。国内外许多作者已系统论述了其原理、特点、成就和发展前景。我们将该技术引入HCV RNA的检测，利用生物素-链霉亲和素系统以及一种新型铕螯合物BHHCT[4,4′-bis(1″，1″，1″，2″，2″，3″，3″-heptafluoro-4″，6″-hexanedion-6″-y1)-chlorosulfo-o-terphenyl]制备了标记探针，对扩增产物进行检测。不仅提高了检测的敏感度和特异性，而且简化了操作，节省了时间，有潜在的推广应用价值。 目的： 采用一种新型铕螯合物BHHCT，作为高灵敏度荧光标记物，建立一种检测丙型肝炎病毒(HCV)RNA的方法。并将该方法与酶标法在反应性、灵敏度、特异性、重复性等方面进行比较。 材料与方法： 1．病例选择：17份丙型肝炎患者(不复合其他肝炎病毒的感染)血清及13份正常人血清标本，采用无菌带盖试管空腹采血5ml，离心分离血清后置-80℃贮存备用。 市京【科人学M十学位论义 2．SA与 BHHCT的标记 1 mg SA溶于 6．6 ＂ilo．lmol／L NaHCO； 中，以 lino 1／L Na0H调 PH值至 9．1（＄液 A人 0．8 mg BHHCT溶 于 0．2 ml 无水乙醇中（溶液 B）；将溶液 B与溶液 A混合，并不停 地搅拌lh；用 1升 0．lmol／L NaHCO；（含0．25 g NaN；）一℃透析 24 h。将透析袋取出，换液，再透析 7 h，于透析袋内的溶液中加 入10 mg BSA和4nlg NaN；，用lmol／L HCI调PH值至6．2（保存 于习0℃）。标记好的溶液于33O urn处测溶液的吸光度。配制好的 SA干HHCT摩尔浓度计算公式如下：摩尔浓度－吸光度／摩尔消 光系数（SA－BHHCT白摩尔消 光系数为 3．41‘）；习溶液按 lml／支 分装。取 linl 标卡己液力。入与 SA－BHHCT等摩尔量的 EuC；，以制备 SA一BHHCT一Etl’”鳌和物；用0．05 mol／L Tris一HCI（含2 g／LBSA、ig／L NaN；、9 g／L NaC，PH 7．8）稀释 5倍；5 6℃力。热 2 h；分装后， －20℃保存。使用时用 0．口5 mol／L Tris－HCI（含 2 s／L BSA、ig／L NaN；、 9 g／L Na CI，pH 7．8）稀释 10 0倍，立即使用。 3．样品处理 以柱层析纯化的方法抽提血清中HCV RNA。（具 体步骤参照上海浩源公司试剂盒） 4．叮R扩增 每个反应管中分别加入盯千R反应液（含反应 缓冲液、Tth酶、洲叩、晚CI；、生物素标记弓物，RM酶抑制剂） 10yi，去离子水10VI 和处理后的样品svl（阴、阳性对照可直 接加入SVI），滴加液体石蜡油IOVI。按以下条件进行代R扩增： 5 0 C 保温 2 nl… 6 0 aC 保温 3 0 m i n；9 4 CIS s，5 8 C 3 0 s， 3个循环；90℃ 20 s，61aC 30 s，45个循环；72℃延伸 15 min； 扩增结束后，加入等量 0．25 mol儿 Na0H K性。 5．荧光检测仪器与条件 使用美国拍金埃尔默生命科学有限公 司＊ c t o rl竹 0型荧光检测仪进行检测。检测条件为延迟时间 0．ZO n1s，窗时 间0．40 ms，照射率乙OO ffis；检坝1］板为％孔FIU0fo Nunc微孔板。 6．产物的销标记检测 取捕获探针液和等量变性液（0．25 mol／L Na0H）混匀，于杂交微孔条每孔内力入上述混 合液 25 pl 和 杂交液IO0／11，混匀后，置于n℃lh，进行预杂交，然后弃杂交 南京医科大学咂上学位论义 液；经预杂交的微孔条每孔内加入杂交液 100 UI，吸取变性后的 PCR 反应液25卜1，加入到盛有杂交液的孔中，轻敲微孔板条的边缘， 使其充分混匀，然后置于37℃lh，进行杂交；吸尽微孔板条内的 液体，每了力。n PH 7．4 PBS 300 PI；静止 30 S后弃洗板液，在 厚迭吸水纸上拍干，重复 5次；每孔内力。入 10口 pl SA－BHHCT－Eu’”， 37℃下放置lh，洗涤同上Z 在荧光检测仪上检测荧光值Z 结果判 定：先用空白孔校零点，然后读取各孔荧光值。样品荧光值大于2000 判断为阳性；否则为阴性。 7．产物的酶标记检测 预杂交、杂交、洗板同销标记检测法。 在每孔内加入IOOlll标记有辣根过?
参考文献：
[1]. Eu标记RT-PCR检测丙型肝炎病毒RNA[J]. 赵智凝, 童明庆, 潘世扬, 黄佩珺, 赵旺胜. 临床检验杂志. 2002
[2]. Eu标记RT-PCR检测丙型肝炎病毒RNA[D]. 赵智凝. 南京医科大学. 2002