蔚变云[1]2003年在《番茄果实乙烯信号转导组分EREBPs基因克隆和表达研究》文中认为乙烯对植物的生长发育起重要的调控作用，随着乙烯信号转导研究的不断深入，许多乙烯信号转导组分已被分离和鉴定，并在模式植物拟南芥中已建立乙烯信号传递过程中的核内级联反应：EIN3→ERF1(EREBPs)→病原相关蛋白，但在番茄中还没有建立EIN3→EREBPs→果实成熟相关基因的相似路径。EREBPs(乙烯反应元件结合蛋白)是一个转录因子家族，通过与乙烯调节的目标基因的启动子区结合而调节目标基因的表达。番茄是研究果实成熟的模式植物，对番茄EREBPs基因的研究，将使我们对乙烯调控果实成熟相关基因表达的机制更加明确，进一步丰富和完善乙烯信号转导理论。 本课题根据GenBank中的拟南芥、烟草、番茄EREBPs家族成员的序列比较，在保守区(ERF结构域)设计简并引物(degenerate primer)，以破色期普通番茄果实RNA为模板，进行RT-PCR扩增，获得114 bp的同源片段，以此片段为探针筛选破色期普通番茄果实cDNA噬菌体文库，获得两个包含全长编码区的阳性克隆。序列分析表明这两个基因都属于EREBPs家族，依次命名为LeERF1、LeERF2。LeERF1 cDNA为1041 bp，开放阅读框编码204个氨基酸；LeERF2 cDNA为2898 bp，开放阅读框编码210个氨基酸。LeERF1与EREBP4、DDTFR10／A在氨基酸水平上的序列相似性为33％，LeERF2与EREBP3、pti5在氨基酸水平上的序列相似性为46％，是新的基因。LeERF1、LeERF2的核酸序列已在GenBank登录，登录号分别为AY077626、AY275554。 Northern杂交分析表明：LeERF1、LeERF2、pti4(已发表的番茄EREBPs成员)基因在普通番茄果实的成熟过程及果实的不同部位都有差异表达，表现出与成熟进程的相关性。在转反义ACS和Nr番茄果实中，LeERF1、LeERF2、pti4基因表达总体水平上比普通番茄中的低，但仍然表现出与成熟进程的相关性。 乙烯处理(100μl／L)绿熟期普通番茄果实0.5h后，LeERF1、LeERF2基因表达明显增强，pti4基因在乙烯处理后12h表达增强；而用乙烯受体抑制剂1-MCP(1μl／L)处理普通番茄破色期果实10h后，LeERF1、LeERF2、pti4基因表达都受到了抑制，表明LeERF1、LeERF2、pti4基因表达受到乙烯的正调控。 激素和化学试剂处理结果表明：0.1 mM ABA处理绿熟期普通番茄果实8h后，乙烯生成增加，LeERF1、LeERF2基因表达增强；1 mM SA处理绿熟期普通番茄果实8h后，乙烯的生成稍有抑制，LeERF1基因表达受到抑制，LeERF2基因表达与对照基本相近；而ABA和SA处理对pti4基因的表达没有影响，表明果实中pti4基因表达不受ABA和SA的诱导。0.1 mM ABA处理番茄幼苗，随着处理时间的延长，LeERF1、LeERF2、pti4基因表达都逐渐增强；1 mM SA处理番茄幼苗0.5h后，LeERF1、LeERF2，pti4基因表达明显增强，然后随着处理时间的延长逐渐下降，表明ABA和SA对LeERF1、LeERF2、pti4基因表达的诱导具有组织特异性。CaCl_2渗透处理绿熟期番茄整果，随着CaCl_2处理浓度的增加，LeERF1、LeERF2、pti4基因表达逐渐减弱，表明钙可调控乙烯信号转导组分。 构建了正义植物表达载体pGA643-LeERF1、pGA643-LeERF2和反义植物表达载体pBI121-LeERF1、pBI121-LeERF2，并转入农杆菌菌株EHA105。
王文雅[2]2004年在《钙对番茄乙烯生物合成和信号转导的调控机理及果实软化的影响》文中研究说明Ca~(2+)和乙烯在植物体中发挥着重要作用，它们共同调控着植物体内的多种生理生化过程，尤其是果实的成熟衰老。因此Ca~(2+)与乙烯的关系成为采后生理学者关注的焦点。本文以番茄整果、外果皮圆片、番茄黄化苗为试材，采用果实圆片活体培养的方法，开展了以下几个方面的研究：Ca~(2+)对绿熟期番茄果实乙烯生物合成和信号转导的影响；脱落酸和钙调素与Ca~(2+)调控乙烯生物合成的关系；Ca~(2+)与果实软化因子(多聚半乳糖全酸酶(PG)、脂氧合酶(LOX)、伸展蛋白(EXP))的关系；Ca~(2+)对番茄“黄化苗”中乙烯生物合成关键酶基因(LEACS1A、LEACO1)和信号转导组分(NR、LEERF2)表达的影响，旨在揭示Ca~(2+)对乙烯生物合成和信号转导过程的调控机理及Ca~(2+)对果实软化的影响。 本文利用Ca~(2+)处理野生型和乙烯受体突变体(Nr)番茄果实圆片，结果显示Ca~(2+)对二者乙烯释放量、乙烯生物合成关键酶及乙烯生物合成代谢产物的影响相似，这表明Ca~(2+)对乙烯的生物合成调控在绿熟期野生型和Nr突变体番茄果实中相同，即Ca~(2+)对乙烯的生物合成的调控不依赖于乙烯受体。 在野生型番茄果实圆片中，Ca~(2+)的细胞化学定位研究结果显示Ca~(2+)处理果实圆片的细胞壁和细胞膜上的Ca~(2+)含量明显的高于对照果实。同时，Ca~(2+)处理抑制番茄果实圆片乙烯释放量，降低番茄果实圆片细胞膜的通透性提高ACC含量，但对于合成ACC的关键酶——ACS活性及其基因表达无明显影响，表明Ca~(2+)可能通过降低细胞膜的透性，阻碍了ACC氧化酶(ACO)对ACC的利用。向果实圆片施加外源ACC的研究结果，进一步确认了Ca~(2+)降低细胞膜的通透性，将ACC阻隔在胞内，阻碍了ACO对ACC的利用，抑制乙烯的生物合成。同时研究表明，Ca~(2+)处理还能够抑制番茄果实圆片中ACC氧化酶基因的表达，从而抑制乙烯的产生。 为了探讨ABA在Ca~(2+)调控乙烯生物合成中的作用，利用1 mmol.L~(-1) ABA、50 μmol.L~(-1)Fluridone(ABA生物合成抑制剂)处理野生型、乙烯受体突变体(Nr)及乙烯生物合成缺陷型(反义ACS)番茄果实圆片，并测定了Ca~(2+)处理对野生型、乙烯受体突变体(Nr)番茄果实圆片内源ABA含量的影响，结果表明，Ca~(2+)通过抑制内源ABA的含量降低番茄果实乙烯生物合成，且ABA通过乙烯信号转导过程来调控乙烯的生物合成。 100μmol.L~(-1)W5,100μ mol.L~(-1) W7和CaCl_2一同处理野生型番茄果实圆片，结果表明钙调素抑制剂(W5、W7)能够抵消Ca~(2+)对番茄果实圆片乙烯生成的抑制作用，降低ACC的含量，改变了Ca~(2+)对LEACO1基因表达的抑制作用，而LEACS2基因表达在不同处理条件下无明显变化，这表明Ca~(2+)可能是通过钙调素来抑制LEACO1基因的表达，调控乙烯的生物合成过程。 为了探讨Ca~(2+)与多聚半乳糖全酸酶(PG)、脂氧合酶(LOX)、伸展蛋白(EXP)的关系，利用不同浓度CaCl_2溶液处理野生型和Nr突变体番茄果实圆片，结果表明在野生型番茄果实圆片中，Ca~(2+)能明显抑制PG、LOX活性和PG、LELOXB、LEEXP1基因的表达；但在Nr突变体中，Ca~(2+)对LOX活性和LELOXB基因表达的抑制作用消失，而PG活性及PG、LEEXP1基因的表达仍对Ca~(2+)处理不敏感。进一步利用乙烯处理番茄果实圆片，结果表明乙烯处理12h后LOX活性显着提高，活性上升81.26％，而PG酶活性仅上升23％。同时，LELOXB基因的表达量增加量也明显高于PG和LEEXP1。这表明，在绿熟期番茄果实中，LOX比PG和EXP对乙烯诱导望婴髻粤尝尝旨~一一一~一一更敏感。 CaZ’处理番茄“黄化苗”的实验结果表明，在。一3.smm。l.L一’的caZ’浓度范围内，乙EA‘万j月、乙酬‘口了、解、L石夕萨召基因的表达量随caZ‘浓度上升逐渐增加。当利用AoA、coz+和Ag‘性抑制乙烯的生理作用后，Caz+浓度变化还能引起L州‘万了月、乙别‘口2、NR、L石诬砰李基因的表达发生相似的变化。在AoA和Ag‘存在或不存在条件下，EGTA均抑制 LEAC岁zA、乙酬切了、朋、乙斑邢召的表达。
赵相娟[3]2009年在《桃果实几个乙烯信号转导相关基因的克隆及其表达》文中研究表明乙烯是调控植物生长发育重要的气态植物激素,其生理作用最终是通过其信号转导途径实现的。肥城桃(Prunus persica‘Feicheng’)为一地方特色名产,是典型的呼吸跃变型果实,对乙烯作用极为敏感。本实验从肥城桃果实中成功克隆了与乙烯信号转导有关的4个全长基因,并在转录水平上研究了PpEILs和PpEBF1的表达特性,主要结果如下:1.根据植物乙烯转录因子EIL(EIN3-like)家族的氨基酸和核苷酸保守区序列,设计简并引物,采用RT-PCR从成熟桃果实中分离了两个571 bp的EIL同源基因片段。随后运用RACE技术,分别扩增得到了两个包含完整开放阅读框(ORF)及非编码区序列(UTR)的乙烯转录因子的cDNA,即PpEIL1和PpEIL2。它们分别为2 086 bp和2 557 bp,编码蛋白大小均为601个氨基酸。虽然PpEIL1和PpEIL2在氨基酸水平上的同源性仅为42%,但在N末端DNA结合功能域可高达86%。聚类分析结果表明,两者分别属于EIN3/EIL家族两类不同乙烯转录因子成员。2.在GenBank中获得的EST序列基础上,分别通过5′RACE和3′RACE技术结合得到全长为3 057 bp的PpEBF1,包含1 941 bp的ORF、248 bp的5′UTR和868 bp的3′UTR,编码蛋白的分子量为68.96 kD,推测等电点为7.41。根据EST库中的核苷酸序列,设计特异引物进行PCR扩增,结果得到了1 263 bp的PpERF1全长基因,包含一个708 bp的ORF。序列分析表明,PpERF1与番茄、拟南芥、苹果和葡萄等在DNA结合功能域的约58个氨基酸中,同源性可达68.4%—100%,且在该区域中存在1个α-螺旋和3个反平行链构成的β-折迭结构。该序列与拟南芥、葡萄、豌豆等植物的氨基酸同源性为58.8%—67.5%,属于同一类ERF家族成员。3.实时荧光定量PCR表明,在花器官及花后40天的幼果中,PpEILs和PpEBF1表达量较高,随着果实的成熟,表达量有增高的趋势;20℃时,1μl/L外源乙烯明显促进PpEILs和PpEBF1的表达,且随时间延长表达量增加;而1μl/L 1-MCP处理则抑制PpEILs和PpEBF1的表达。
晏瑾[4]2007年在《超级杂交稻两优培九EREBP cDNA的生物信息学分析与克隆》文中研究指明超级杂交稻是在我国种植面积极广的一种粮食作物，目前我国的超级杂交稻在超高产育种领域已取得了令世界瞩目的成就。乙烯反应元件结合蛋白与植物生长发育、抗病和抗逆性等一些重要生理生化反应的基因调控有着密切的关系，近年来已成为研究的热点，并取得了一定进展。生物信息学结合分子生物学、遗传学等生物技术手段，为研究乙烯反应元件结合蛋白提供了帮助。本研究以生物信息学的分析为基础，利用模式植物拟南芥中编码乙烯反应元件结合蛋白的cDNA，对现有的水稻基因组数据库进行搜索，获得一条高同源的未知序列。通过对这条未知序列的核酸序列和蛋白质序列、结构、性质、功能等方面的一系列生物信息学分析，表明未知序列应为水稻中编码乙烯反应元件结合蛋白的cDNA。以超级杂交稻为材料，提取总RNA并反转录成cDNA，用未知序列设计一对简并引物，经PCR扩增出编码乙烯反应元件结合蛋白的cDNA片段，cDNA片段经T-A克隆后进行测序，获得一条长915bp的cDNA片段，BLAST表明未知序列的部分核酸序列与AK119885的同源性达到了99％。提交NCBI的GenBank后接收，登录号为EF507537。
参考文献：
[1]. 番茄果实乙烯信号转导组分EREBPs基因克隆和表达研究[D]. 蔚变云. 中国农业大学. 2003
[2]. 钙对番茄乙烯生物合成和信号转导的调控机理及果实软化的影响[D]. 王文雅. 中国农业大学. 2004
[3]. 桃果实几个乙烯信号转导相关基因的克隆及其表达[D]. 赵相娟. 山东农业大学. 2009
[4]. 超级杂交稻两优培九EREBP cDNA的生物信息学分析与克隆[D]. 晏瑾. 湖南农业大学. 2007