张振峰[1]2004年在《小鼠肝脏耐热蛋白的初步研究》文中研究表明肝脏在生物体代谢中具有极其重要的作用，如调节葡萄糖的含量，调节血液中多种蛋白的合成，分泌胆汁，生物降解有毒物质等，另外肝脏还具有几乎无限的再生能力，因此研究肝脏蛋白质的性质对于揭示肝脏的生物学功能具有重要的意义。与肝脏功能相关的蛋白质中有许多是耐热蛋白，如肝细胞刺激因子(Hepatic Stimulator Substance，HSS)、肝脏再生增强因子(Augmentor of Liver Regeneration，ALR)、表皮生长因子(Epidermal Growth Factor，EGF)等。本课题目的是研究小鼠肝脏中的耐热蛋白，尤其是与肝功能、肝脏再生有关的耐热蛋白，通过实验来发现新的耐热蛋白或者蛋白质新的耐热特性，对耐热蛋白进行结晶及晶体结构解析，探讨蛋白质结构与耐热性、结构与功能之间的关系。 本文的创新之处是首次研究小鼠肝脏中的耐热蛋白质组，发现并研究谷胱苷肽过氧化物酶和regucalcin新的耐热特性，利用生物学信息学的方法对其进行结构与功能分析，为从晶体结构解析耐热蛋白质的耐热机制与蛋白质工程改造奠定一定的基础。 本课题研究的主要内容包括：(1)小鼠肝脏组织样品的制备及二维电泳分离耐热蛋白；(2)MALDI-TOF-MS肽质量指纹谱鉴定耐热蛋白并对其进行生物信息学分析；(3)耐热蛋白克隆、表达载体的构建以及耐热蛋白的表达与纯化；(4)耐热蛋白的耐热活性检测。 本文研究结果如下： 1．二维电泳共分离出约50个蛋白，我们选取其中分离效果较好、相对分子质量在10-90kD的5个蛋白斑点做MALDI-TOF-MS肽质量指纹谱鉴定。这5个蛋白质经鉴定分别为：谷胱苷肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、蛋白酶体亚单位(AF060087)、烟酰胺核苷酸焦磷酸化酶(nicotinate-nucleotide pyrophosphorylase)、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumarylacetoacetate hydrolase)和regucalcin。由于谷胱苷肽过氧化物酶是一种抗氧化酶，能清除体内的自由基，保护机体免于氧化损伤，在机体内的作用非常重要；另外regucalcin还与肝脏再生有关，所以本文决定对谷胱苷肽过氧化物酶和regucalcin进行克隆表达、晶体解析及耐热性分析。华东师范大学硕士学位论文小鼠肝脏耐热蛋白的初步研究 2.构建的克隆载体pUCm/GSH一Px、pUCm/reguealein和表达载体pGEX/G SH一Px、pGEX/reguealein经过BamHI、Xhol;EeoRI、Xhol双酶切及DNA测序，证实GSH一Px和regucalcin基因序列插入质粒且读码框正确。由于GSH一Px活性中心的硒代半胧氨酸是由终止密码子TGA编码的，本文利用TaKaRaMutaBest点突变试剂盒将TGA突变为TGc(编码半肤氨酸)进行表达，DNA测序证实突变成功。 3.GSH一Px菌株经IPTG诱导3h后，表达出相对分子质量为48kD的GSH一Px融合蛋白，约占细菌总蛋白的30%。菌体超声破碎高速离心后的上清经过Glutathione Sepharose 4B亲和层析柱进行纯化，得到纯化的GST融合蛋白.凝血酶(Thrombin)酶切后，聚丙烯酞胺凝胶电泳(SDS一以GB)显示两个条带，一条为谷脱昔肤S转移酶(GST)，另一条为谷脱昔肤过氧化物酶;Regucalcin菌株经IPTG诱导3h后，表达出相对分子质量为59kD的regucalcin融合蛋白，以包涵体形式存在，约占细菌总蛋白的30%。 4.耐热活性检测:将酶切后的GSH一Px蛋白溶液65℃处理30分钟，1 20O0rpm离心20min后，取上清进行SDS一PAGE检测，加热后GST变为沉淀，结果显示只有GSH一Px一条带，证明GSH一Px具有耐热性。另外把GSH一Px在65℃下分别处理O、5、 10、20、40min，然后用谷胧昔肤过氧化物酶活力测试盒对加热处理后的GSH--Px进行活性检测，结果显示GSH一Px活性没有明显变化，进一步说明了GSH一Px是具有耐热特性的酶。 利用二维电泳技术分离出小鼠肝脏中的耐热蛋白，并对其中的谷脱昔肤过氧化物酶和regucalcin进行克隆表达，对谷脱普肤过氧化物酶进行耐热活力检测，证实GSH一Px是具有耐热特性的蛋白质.目前关于GSH一Px的耐热特性国内外还未见相关报道，本文下一步将对其结晶及晶体解析，以分析GSH一Px耐热机制。Regucalcin是以包涵体形式存在，且其分子量很大以及二硫键的缘故，很难复性，无法进行耐热活力检测，所以只有更换一种更加促进蛋白质可溶的表达系统进行表达。
张振峰, 高红亮, 蔡在龙, 毛积芳, 焦炳华[2]2004年在《小鼠肝脏部分耐热蛋白的初步研究》文中进行了进一步梳理目的:研究小鼠肝脏中具有耐热特性的蛋白质,尤其是与肝功能、肝脏再生有密切关系的耐热蛋白。方法:将小鼠肝脏蛋白在65℃处理30 min,去除热变性蛋白,剩余耐热蛋白进行二维电泳,经过考马斯亮蓝染色,得到小鼠肝脏耐热蛋白二维电泳图谱,共约50个蛋白斑点。其中选取5个相对分子质量在10 000-50 000、分离效果较好的斑点进行MALDI-TOF-MS肽质量指纹谱分析及生物信息学处理。结果:这5个蛋白分别为:谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase)、蛋白酶体亚单位(AF060087)、尼克酰胺乙酰乙酸水解酶(nicotinate-nucleotide pyrophosphorylase)、延胡索酰乙酰乙酸水解酶(fumary-lacetoacetate hydrolase)和regucalcin。结论:初步证明肝脏中谷胱甘肽过氧化物酶、尼克酰胺乙酰乙酸水解酶、延胡索酰乙酰乙酸水解酶和regucalcin具有较强的耐热特性。
段玉峰[3]2005年在《蝗虫营养价值与生物学功能研究》文中提出本文以食品新资源开发,食品功能成分分离、理化性能研究及功能表征为目的,利用等离子发射光谱、氨基酸自动分析仪、气相色谱、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、动物试验等分析、分离、功能表征技术对10种蝗虫体内蛋白质、油脂、矿物元素等营养成分的种类、含量、组成及营养价值进行了分析和初步评价;对蝗虫体内所含的必需脂肪酸、磷脂、黄酮类功能成分进行了组成及含量、提取工艺、分离纯化、理化性质、生理功能等方面的研究;并利用酶解技术,初步探索了通过蝗虫蛋白水解获得功能肽的途径。其主要成果表现在: 一、分析测定了10种蝗虫体内的蛋白质含量、氨基酸组成及含量、油脂含量及16种矿物元素的含量。结果表明,蝗虫体内含有丰富的蛋白质资源,其蛋白含量均超过了50g/100g干物质,其中7种超过了60g/100g干物质;蝗虫蛋白中7种必需氨基酸(色氨酸因仪器原因未测定)含量与氨基酸总含量的比值均在35%左右;蝗虫为低脂含量的食品资源,其油脂显示了独特的脂肪酸组成特点,含有丰富的不饱和脂肪酸,其人体必需脂肪酸(亚油酸、亚麻酸)的含量超过了脂肪酸总含量的50%;蝗虫体内含有丰富且较均衡的矿物元素,其中Ca、Cu、Mn、Mo、Ni、Se等必需元素均有较高的含量。 二、首次将蛋白分类技术应用于蝗虫蛋白研究并用FAO/WHO的蛋白标准模式对10种蝗虫的蛋白成分进行了营养价值的初步评价。结果显示,在蝗虫的蛋白组分中,水溶性蛋白的比例超过了40%;必需氨基酸的含量及氨基酸的总指数均超过了蛋白标准模式中的判断指标,说明蝗虫蛋白是优质的食品蛋白资源,具有广阔的开发利用前景。 叁、研究了蝗虫蛋白、油脂、磷脂、SOD、黄酮类成分的提取分离工艺,并将超声技术应用在一些物质的提取中,取得了明显的效果。中华蚱蜢水溶性蛋白的提取条件为料液比(g/mL)1∶15、提取液pH7.6、NaCl浓度1.0%、提取时间4h;中华稻蝗脂类提取条件为超声波处理(强度500W、提取次数120次、每次处理时间3s)、氯仿—甲醇改良法提取;由中华稻蝗脂类成分中分离磷脂的条件为丙酮浸提、温度30℃、时间3h、料液比1∶500(g/mL);中华稻蝗SOD的提取条件为提取液pH7.66,加热时间40min,加热温度45℃;黄胫小车蝗黄酮提取的条件是甲醇浸泡、料液比1∶30(g/mL)、时间24h、提取次数3次。 四、首次对蝗虫磷脂类化合物开展了提取、分离及组成研究。结果显示,中
佚名[4]2010年在《基础免疫》文中认为脂筏在tmTNF-α反向信号传递中的作用陈克清刘涛于敏胡雪娜冯玮姜小丹王晶李卓娅华中科技大学同济医学院免疫学系,武汉430030背景及目的:脂筏是位于细胞膜上的富含胆固醇和鞘磷脂的微结构域,目前认为脂筏作为信号转导的平台发挥重要的生物学功能。前期工作证明跨膜TNF-α(tmTNF-α)不仅可以传递正向信号,也能作为受体向自身胞内传递信号,即反向信号。tmTNF-α的反向信号表现为NF-κB持续性活化。有
陈静[5]2014年在《富硒女贞子防治小鼠热应激作用及其机制初探》文中研究说明热应激是指动物在受到超过机体本身体温调节能力的过高温度刺激时,引起机体的非特异性防御反应和特异性障碍在内的全身性适应症。为了科学研究动物热应激机制,许多研究者通过建立试验动物热应激模型,如鸡、猪、大鼠和小鼠等,观察检测模型动物的血液生化指标,激素水平,细胞因子(如IL-2、IL-6、TNF等)水平和组织器官病理变化等。研究还发现热应激条件下,动物热休克蛋白水平也发生相应的变化,如HSP70、HSP60和HSP90等,并认为机体的热休克蛋白水平是动物抗热应激指标之一。本研究以富硒女贞子缓解奶牛热应激为目标,在建立小鼠热应激模型的基础上,以富硒女贞子滋阴补肾,保护肝脏,免疫调节等功能为切入点,通过统计热应激小鼠死亡率,检测生长指标、血液生化,激素水平,免疫器官指数及血清IL-2水平,并利用实时荧光相对定量法检测肝脏HSP70mRNA表达的相关热应激指标,来探索评价富硒女贞子的抗热应激作用,并初步探讨其抗热应激机制。试验一富硒女贞子对小鼠急性热应激的预防作用研究富硒女贞子对急性热应激小鼠存活率的影响,将126只ICR小鼠随机分成：常温对照组(C)、热应激组(HS)、普通女贞子组(CLL)、富硒女贞子高剂量组(HSLL)、富硒女贞子中剂量组(MSLL)、富硒女贞子低剂量组(LSLL);除了C组,其他组均置于温度(T)43±1℃,湿度(RH)50-60%的环境中急性热应激2h,观察小鼠临床状态,统计小鼠死亡率并进行肝组织切片病理观察。结果显示：富硒女贞子各组小鼠的死亡率均明显降低,其中0.75g/kg剂量的富硒女贞子组死亡率为38.1%,极显着低于最低HS组的79.2%(P<0.01),且显着低于CLL的61.9%(P<0.05)；病理观察发现,LSLL组小鼠肝细胞水肿和颗粒变性等损伤明显减轻。提示0.75g/kg剂量富硒女贞子对急性热应激小鼠的预防作用最佳。试验二富硒女贞子对热应激小鼠生长性能、血清生化及其肝组织变化的影响为观察富硒女贞子对小鼠的抗热应激作用及其生长性能、血清生化及其肝组织变化的影响,将108只小鼠随机分成常温对照组(C)、热应激组(HS)、普通女贞子组(CLL)、富硒女贞子高剂量组(HSLL)、富硒女贞子中剂量组(MSLL)、富硒女贞子低剂量组(LSLL);除C组外,其他各组于T为40±1℃,RH为40-50%人工气候室中,11：00-13：00热应激2h,应激期间不间断供水；其余时间置于白天T为35±4℃,RH为45-50%环境下,夜晚T为28±5℃,RH为30-40%环境下,连续应激7天。结果发现：在高温应激条件下,热应激各组的增重率(WG)和生长率(SGR)均较C组有不同程度的降低,热应激处理组之间,LSLL组的WG和SGR分别显着和极显着高于HS组(P<0.05、P<0.01)；各处理组血清ALT和AST性均呈上升趋势,其中女贞子组(CLL)和富硒女贞子组(HSLL、MSLL、LSLL)血清ALT和AST活性较HS组有不同程度的降低。血清蛋白在热应激3d,LSLL组TP、ALB和GLO均高于HS、CLL、HSLL和MSLL组,在热应激7d,LSLL组明显高于CLL组,表明0.75g/kg富硒女贞子组比1.5g/kg普通女贞子组具有更好的提高血清蛋白的作用。试验结果提示,富硒女贞子和女贞子对热应激造成小鼠生长不良及肝脏损伤均具有明显的缓解作用。尤以0.75g/kg剂量富硒女贞子在热应激过程中能更好地降低血清ALT和AST,提高血清TP、ALB和GLO的浓度,从而提高小鼠的抗热应激能力。试验叁富硒女贞子对热应激小鼠免疫器官指数、血清IL-2和激素动态水平的影响为研究富硒女贞子对热应激小鼠免疫调节的作用,在上述热应激动物模型试验,通过剖检观察了热应激小鼠免疫器官指数,酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞因子IL-2和ACTH、CORT、T4、T3等激素在热应激期间的动态变化水平。结果发现：CLL组、MSLL组、LSLL组免疫器官指数均显着高于HS组(P<0.05)：热应激前期(1-3d),HS组血清中ACTH浓度显着增高(P<0.01),CLL、HSLL、MSLL组均没有显着差异；HS组的CORT浓度较C组显着升高(P<0.05),女贞子各组均有降低,其中MSLL组与C组没有显着差异(P>0.05)；HS组血清中的T3、T4浓度总体上呈现下降的趋势,但是CLL、LSLL组的T3、T4浓度均显着高于HS组(P<0.01)；IL-2方面,在热应激前期(1-3d),富硒女贞子HSLL组、LSLL组的IL-2显着高于HS组和C组(P<0.05、P<0.01)。结果表明：富硒女贞子能够增强热应激小鼠免疫调节功能,并通过机体的内分泌-免疫调节网络系统,改善机体的内环境稳态,发挥提高动物耐热能力的作用,且以低剂量(0.75g/kg)富硒女贞子组作用最佳。试验四富硒女贞子对热应激小鼠肝脏HSP70及其mRNA表达的影响试验分别采用ELISA法和荧光相对定量PCR法检测小鼠肝脏热应激休克蛋白(HSP70)及其mRNA的表达量,观察其在热应激期间的动态水平,以探讨富硒女贞子抗热应激的作用机制。结果表明：在热应激期间,处理组HSP70的表达量呈上升趋势,且热应激初期(1-3d)富硒女贞子各组均显着高于HS组(P<0.05),热应激7d,女贞子组和HS组HSP70显着高于C组(P<0.05),而富硒女贞子各组与C组无显着差异(P>0.05)。热应激各组小鼠肝脏中HSP70mRNA表达均呈先降后升,总体上升的趋势,且在热应激7d,CLL、MSLL、LSLL组HSP70mRNA表达量均显着低于HS组(P<0.05)。结果表明：富硒女贞子和女贞子都具有明显促进热应激早期小鼠肝组织中HSP70mRNA的表达和HSP70的合成,从而使应激小鼠机体更快速地适应应激性环境,减少应激损伤性肝脏病理性蛋白的合成,其综合作用效果尤以0.75g/kg富硒女贞组最佳。结论：富硒女贞子能有效降低急性热应激小鼠的死亡率,对小鼠热应激具有显着的防治作用,尤以0.75g/kg体重剂量的富硒女贞作用最佳。既能减少热应激造成的小鼠生长抑制,提高其血清总蛋白、白蛋白和球蛋白的含量,又能提高免疫。其作用机理：与提高血清T4、T3水平,调节ACTH的热应激性过度升高,调控内分泌-免疫网络和促进热应激早期小鼠肝组织中HSP70mRNA的表达和HSP70的合成,减少肝损伤等应激病变,维持机体内环境稳态有关。
王凯[6]2017年在《五种来源石斛对小鼠肝脏细胞色素P450酶表达的影响及对肝损伤的保护作用》文中研究指明石斛为兰科多年生草本植物,是我国一种稀有的传统中药,至今已有上千年的用药历史,具有抗氧化、抗肿瘤和增强免疫等多种药理作用。目前已有研究报道霍山石斛对酒精性肝损伤有保护作用,但其他来源石斛对不同肝损伤模型的研究尚无文献报道。因此,本研究选用五种来源石斛鲜品,分别是霍山石斛、铁皮石斛(云南)、铁皮石斛(霍山)、河南石斛和铜皮石斛,通过建立两种急性肝损伤模型评价石斛的保肝活性,并对比研究不同来源石斛的保肝疗效,为合理使用石斛提供实验依据。此外,本课题还研究了不同来源石斛对细胞色素P450酶蛋白表达的影响,为石斛临床安全用药提供参考。主要研究内容和结论如下:1.五种来源石斛对小鼠肝脏细胞色素P450酶蛋白表达的影响采用Western blot法测定五种来源石斛对小鼠肝脏8种主要细胞色素P450酶蛋白表达的影响,同时对石斛进行了安全性评价,考察石斛在本实验所选剂量下是否具有毒性作用。结果显示,霍山石斛对CYP1A1、CYP1A2和CYP2B蛋白表达有显着诱导作用;铁皮石斛(云南)对CYP2A、CYP2B、CYP3A、CYP2C19和CYP2E1蛋白表达有显着诱导作用;铁皮石斛(霍山)对CYP2A蛋白表达有显着的诱导作用;河南石斛对CYP1A1、CYP2A、CYP2B和CYP2D6蛋白表达有抑制作用;铜皮石斛对CYP1A1和CYP3A蛋白表达有显着诱导作用。此外,血清生化指标、脏器指数和病理组织切片结果显示,与正常对照组小鼠相比,石斛给药组小鼠并未产生任何损伤,表明在本实验所用剂量下服用石斛是安全无毒的。2.五种来源石斛对CCl_4致小鼠肝损伤的保护作用CCl_4急性肝损伤模型是目前常用的肝损伤模型,其损伤机制与脂质过氧化有关,本章建立了CCl_4急性肝损伤模型,评价五种来源石斛的保肝作用。结果表明,各石斛给药剂量组均能够降低小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)含量,不同程度的升高小鼠肝组织超氧化物歧化酶(SOD)活性同时抑制了丙二醛(MDA)的过量表达,有效缓解肝脏组织病理损伤。不同来源石斛表现出不同的保肝效果,其中霍山石斛的保肝活性最好。3.五种来源石斛在对乙酰氨基酚诱导肝损伤小鼠中的保护作用对乙酰氨基酚(APAP)在临床上常用来解热镇痛,但长时间或大量服用会引起肝脏损伤,研究认为APAP肝损伤是其中间代谢产物不可逆地与大分子结合所导致的。为进一步评价石斛对不同机制所致肝损伤的保肝功效,本章以APAP为肝损伤诱导源,建立小鼠急性肝损伤模型。实验结果显示,与模型组相比,各石斛给药组可有效提高小鼠血清指标ALT、AST的活性及肝组织谷胱甘肽(GSH)和SOD含量,同时MDA含量明显降低,其保肝机制可能是提高抗氧化酶活性,增强机体的抗氧化能力,抑制脂质过氧化反应。不同石斛显示出不同的保肝活性,其中霍山石斛的保肝效果最好。4.霍山石斛拮抗CCl_4致肝损伤炎症相关机制的初步研究为了评价石斛的保肝机制是否与炎症反应有关,本章采用荧光定量PCR技术检测肝脏组织白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA表达水平,同时采用免疫组化法检测其蛋白表达水平,结果显示霍山石斛可显着降低小鼠肝脏内炎症因子的表达。
庞道睿[7]2017年在《杨桃酚类物质降脂作用及其改善肝脂变性的机理研究》文中进行了进一步梳理脂代谢紊乱作为代谢综合征的一种表现严重影响着人类的健康。流行病学研究表明:食用水果和蔬菜可有效地降低代谢综合征的发病率。杨桃是一种在我国华南地区广泛种植的亚热带水果,其叶、枝、根、花和果有一定药食用价值。本文对华南地区4个品种杨桃水果中的多酚种类及含量进行了测定,并对不同品种杨桃的游离酚提取物的抗氧化活性进行了探讨。进一步结合测定降脂活性的细胞模型,筛选出具有显着降脂活性的优势杨桃品种,在动物体内验证其游离酚提取物的降脂活性,并对其主要的单体化合物进行研究,初步探讨了部分主要降脂活性单体间可能存在的交互作用关系。此外,探究了杨桃游离酚提取物在动物体内降脂的作用机制。主要实验方法及结果如下:(1)不同品种杨桃多酚类物质的测定。经化学法提取了4个品种杨桃水果中的游离酚和结合酚。采用福林酚法和硼氢化钠/邻四氯苯醌(SBC)法测定4个品种杨桃提取物中多酚和黄酮的含量,并用液相色谱分析游离酚中酚类化合物的组成。4种杨桃中的游离酚、结合酚和总酚含量分别为162.5-286.8、6.4-19.7和174.5-293.1 mg GAE/100g FW。4个品种杨桃中游离态黄酮、结合态黄酮和总黄酮的含量分别为:100.7-234.0、1.1-7.8和104.4-235.1 mg CE/100g FW。其中Taiguo杨桃中游离酚含量显着高于其他品种(p<0.05)。不同品种杨桃的结合酚占总酚的比例为2.17%-7.69%。游离酚中被检测到的酚类化合物有:异槲皮苷、原花青素B_2、表儿茶素、没食子酸、p-香豆酸和丁香酸。(2)不同品种杨桃游离酚提取物体外化学法抗氧化活性和细胞抗氧化活性的测定。采用氧自由基吸收能力(ORAC)、过氧自由基清除能力(PSC)和细胞抗氧化活性(CAA)方法评价不同品种杨桃游离酚提取物的抗氧化活性。4个品种杨桃游离酚提取物的ORAC值介于23.76-49.84μmol TE/g FW之间,其中Taiguo杨桃游离酚提取物的ORAC值最高,比Xiangmi、Hong和Honglong分别高出0.47、0.51和1.1倍(p<0.05)。4个品种杨桃游离酚提取物的PSC值介于177.5-457.64μmol Vit.C E/100g FW之间,Taiguo杨桃游离酚提取物的PSC值最高。在CAA的No PBS wash组中,4个品种杨桃游离酚CAA值为32.41-68.96μmol QE/100g FW,而PBS wash组的CAA值介于25.80-63.29μmol QE/100g FW之间。4个品种杨桃游离酚提取物均表现出一定的抗氧化活性,且Taiguo杨桃游离酚提取物的抗氧化活性最强,与其他品种杨桃游离酚提取物的抗氧化活性存在显着性差异(p<0.05)。(3)杨桃游离酚提取物体外降脂活性的筛选。分别采用相应的诱导剂作用于3T3-L1细胞和L02细胞建立脂肪生成模型和肝细胞脂肪变性模型。经4个品种杨桃游离酚提取物干预后,3T3-L1细胞脂肪生成受到了不同程度的抑制,L02细胞肝脂变性得到了不同程度的缓解。结果表明:Taiguo杨桃游离酚提取物的降脂活性最强。(4)优势品种杨桃提取物体内降脂活性的评价。经Taiguo杨桃游离酚提取物干预8周后,db/db肥胖小鼠体内血脂(甘油叁酯、低密度脂蛋白和游离脂肪酸等)含量与模型组小鼠相比均出现较为明显的降低现象,且呈现出一定的剂量依赖性。此外,db/db肥胖小鼠肝脏甘油叁酯的含量显着低于模型组小鼠(p<0.05)。结果表明:Taiguo杨桃游离酚提取物表现出一定的降低db/db肥胖型小鼠血脂和肝脂的作用。(5)降脂活性单体及单体间的交互作用研究。采用3T3-L1细胞脂肪生成模型和L02细胞肝脏脂肪变性模型,对游离酚提取物中的6种酚类单体化合物进行降脂活性评价,并筛选出了在提取物中含量较高且活性较好的单体化合物,并进一步采用肝脏脂肪变性细胞模型对化合物间的联合作用进行考察。结果表明:表儿茶素、异槲皮苷、没食子酸和p-香豆酸等几种单体化合物表现出显着地抑制脂肪生成的活性(p<0.05)。表儿茶素、异槲皮苷、p-香豆酸、丁香酸和原花青素B_2等单体化合物表现出缓解肝脏脂肪变性的活性。表儿茶素与原花青素B_2联合作用时,在25%-50%抑制率范围内均表现出协同抑制肝脏脂肪变性的作用。(6)杨桃游离酚提取物抑制肝脏脂肪变性的作用机理。测定了Taiguo杨桃游离酚提取物对db/db小鼠肝脏胰岛素抵抗、抗氧化和抗炎活性的影响,并考察了其对小鼠肝脏脂肪生成和氧化分解等相关通路靶点的作用。结果表明:Taiguo杨桃游离酚提取物可以显着地提高db/db小鼠肝脏过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性(p<0.05),并显着地缓解了小鼠肝脏的胰岛素抵抗(p<0.05)。Taiguo杨桃游离酚提取物并未对小鼠体内炎症因子的含量产生明显作用(p>0.05)。Taiguo杨桃游离酚提取物通过显着激活AMPK的磷酸化,进而下调SREBP-1c、FAS、SCD1基因和蛋白表达(p<0.05),从而抑制了小鼠肝脏的脂肪生成。此外,microRNA-34a和microRNA-33可能在此信号通路传导中起到RNA干扰的作用。
涂芊茜[8]2011年在《自噬在脂肪酸诱导肝损伤中的作用及机制的初步研究》文中研究说明研究背景非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是指一种无过量饮酒史,以肝实质细胞脂肪变性和脂肪蓄积为特征的临床病理综合征,包括单纯性脂肪肝、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)、脂肪性肝纤维化和肝硬化。有研究表明,约有90%的健康体检人群肝酶学指标异常的常见原因是非酒精性脂肪肝。而约有20%患非酒精性脂肪性肝炎的病人会最终发展为肝硬化。非酒精性脂肪肝是一种重要的代谢性疾病,有数据表明大概18%的正常体型和27%的肥胖人群会患有这个疾病,严重威胁着人类的健康安全。目前存在多种关于非酒精性脂肪肝发病机理的学说,但具体机制仍不清楚,因此,非常有必要对NAFLD的发生、发展及其发病机制进行深入研究。自噬是生物体内一种相对保守的对物质进行分解代谢的过程,它通过“自我清除”细胞内无用的、累积的蛋白质聚集物和有缺陷的细胞器等,维持细胞内环境的稳态。在受到饥饿、高温、低氧等外界环境刺激下,细胞通过提高自噬水平,将胞浆内多余组分分解为游离氨基酸、脂肪酸和核苷酸,维持细胞的能量代谢。自噬主要分为叁种类型:巨型自体吞噬(macroautophagy) ,微型自体吞噬(microautophagy)和分子伴侣介导的自体吞噬(chaperonmediated autophagy)。目前发现至少有叁十余种基因参与酵母autophagy过程,这些基因被统一命名为酵母自噬相关基因ATG (AuTophaGy-related)。其中许多酵母中autophagy相关基因均已在哺乳动物中找到同源物,并以分离鉴定成功,表明autophagy是一种进化保守的过程。在哺乳动物的自噬泡形成过程中,由Atg3, Atg5, Atg7, Atg10, Atg12和LC3 (Microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAP1-LC3)参与组成的两条泛素样蛋白加工修饰过程:Atg16与Atg12-Atg5结合过程与前自噬泡(Preautophagosome)的形成相关,而LC3修饰过程对自噬泡(Autophagosome)的形成必不可少。自噬在生物体生长发育、细胞分化及对环境应激的应答方面极为关键,对防止某些疾病如肿瘤、肌病、神经退行性疾病以及对抵御病原微生物的感染和延缓衰老、延长寿命等方面发挥重要作用。近期,有大型流行病学调查结果显示肥胖,尤其是体重指数>25的人群,会显着增加罹患癌症的几率。其中高BMI这个高危因素易引发肝细胞癌。Michael Karin研究小组发现,给DEN诱导肝癌模型的小鼠分别喂养普通饮食和高脂饮食后,高脂饮食组小鼠肝癌的发生率明显增加。然而自噬是否参与调控NAFLD的发生发展过程目前尚未见系统报道。本课题首先从动物水平和细胞水平研究了高脂饮食和游离饱和脂肪酸诱导的肝细胞损伤对自噬的影响,进一步通过分子生物学技术初步研究了自噬在脂肪酸诱导的肝细胞损伤过程中的作用,并探讨了其发挥作用的可能机制。本研究旨在为深入认识NAFLD发病机制,进而寻找其相应的治疗靶点提供一定的实验依据。实验方法:1.用高脂饮食喂养小鼠,建立NAFLD小鼠模型,Western blot方法检测高脂饮食小鼠肝组织中自噬泡标志分子LC3-Ⅱ的蛋白水平;2.应用Western blot技术检测脂肪酸刺激对肝细胞系自噬泡标志分子LC3-Ⅱ的蛋白表达的影响;3. GFP-LC3表达质粒瞬时转染肝细胞系,荧光显微镜下观察脂肪酸刺激下肝细胞中自噬泡的形成;4.电子透射显微镜观察高脂饮食小鼠肝组织和游离脂肪酸处理细胞中自噬泡的形成;5. Real-time PCR技术检测正常饮食小鼠与高脂饮食小鼠肝组织中自噬相关基因的mRNA表达水平差异;同时在细胞水平检测对照组和游离脂肪酸处理组细胞中自噬相关基因mRNA表达水平差异;6.通过自噬抑制剂实验观察自噬在PA诱导的肝细胞损伤过程中的作用;7.细胞水平提供通路抑制剂实验明确PA诱导的自噬所依赖的具体通路;8.进一步使用siRNA干扰技术明确PA调节自噬的具体通路;9.通过自噬相关基因siRNA干扰实验,初步探讨自噬在PA诱导肝损伤中的作用。实验结果:1.高脂饮食小鼠肝组织中自噬通路高度激活,自噬标志性分子LC3-II水平明显升高;2. PA刺激状态下肝细胞系SMMC-7721、HepG2、LM3及L02自噬活化明显升高;3.在游离脂肪酸诱导肝损伤的过程中,自噬相关基因Beclin1、atg5和atg7在动物水平和细胞水平均无明显改变;4.高脂饮食小鼠肝细胞内JNK通路明显活化;JNK抑制剂可有效抑制PA诱导的自噬,并且JNK2在其中可能起主要作用,抑制JNK1能有效阻止细胞的凋亡;5.干扰Beclin1和Atg5的表达可以抑制脂肪酸诱导肝损伤过程中自噬标志LC3-II的表达。实验结论:在高脂饮食小鼠肝组织中和游离脂肪酸诱导细胞损伤中肝细胞自噬活性明显升高,JNK2信号通路在游离脂肪酸诱导肝细胞自噬活性升高的过程中发挥主要作用。抑制自噬促进了脂肪酸诱导的肝细胞凋亡,提示其在脂肪酸诱导肝细胞损伤过程中可能发挥保护作用。本实验为深入认识高脂饮食诱导的肝损伤中自噬的作用及调控机制提供一定的实验依据。
徐剑锋[9]2005年在《PTP1B为靶位利用RNAi技术治疗糖尿病的初步研究》文中进行了进一步梳理糖尿病是威胁人类健康的重要疾病,而胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗是导致2型糖尿病发生的主要原因。有关研究发现胰岛素受体后信号转导通路的缺陷与2型糖尿病相关,其中PTP1B作为负调控胰岛素通路的重要磷酸酯酶而受到广泛关注。降低PTP1B的活性可以增强胰岛素敏感性,从而改善2型糖尿病症状。本博士论文工作利用RNA干扰技术降低PTP1B基因的表达,并且观察到胰岛素信号传导的上调以及糖尿病小鼠症状的改善,为RNA干扰技术应用于糖尿病治疗提供了初步的证据。 第一部分工作利用能够在真核细胞中转录发卡结构小RNA的载体pSliencer,针对PTP1B表达框中的5个特定序列,构建了5个质粒(pS-MP1～5);同时将PTP1B的表达框插入绿色荧光蛋白(EGFP)表达框的5’端,构建了能够表达PTP1B-EGFP融和蛋白的载体作为报告质粒,将这两种质粒同时转染小鼠肝癌细胞Hepa 1-6,以荧光强度作为PTP1B表达量的间接反映,用流式细胞仪测量了不同序列的siRNA对PTP1B基因表达的下调效率,分别为:65%,72%,55%,57%和56%;并利用PTP1B的多克隆抗体对融合蛋白进行免疫印迹分析,确认了沉默效率最高的2号序列。以此为依据,合成了相应的siRNA。同时构建了在大肠杆菌中表达小鼠PTP1B基因dsRNA的载体,大量表达后用CF11亲合纯化dsRNA,经大肠杆菌RNase Ⅲ酶切,分子筛分离得到了esiRNA。esiRNA和合成的siRNA对PTP1B-EGFP融合蛋白表达的下调效率分别为94%和90%。 第二部分工作构建了一套对胰岛素信号响应的报告系统,由受胰岛素正调控的脂肪酸合成酶启动子和分泌型的乙肝病毒表面抗原组成,通过检测乙肝病毒表面抗原的表达来监测胰岛素信号通路的变化,具有简便快捷的优点。在小鼠体内,利用这套报告系统,采用了液压法注射,检测了esiRNA,合成的siRNA以及pS-MP2对胰岛素通路的影响。同时,为了进一步验证PTP1B的siRNA用于治疗糖尿病的可能性,利用四氧嘧啶诱导的糖尿病小鼠模型,检查了注射esiMP后小鼠血糖的变化。动物水平的实验表明PTP1B的siRNA具有上调胰岛素信号和改善糖尿病症状的作用。 第叁部分工作用RT-PCR检测了PTP1B基因表达降低之后小鼠肝细胞中其它磷酸酯酶基因的表达情况,发现了TCPTP基因的表达有明显的上调,而LAR,SHP2基因的表达则没有明显变化。为了进一步研究TCPTP对胰岛素通路以及在2型糖尿病中的作用,大量表达了TCPTP dsRNA并且酶切纯化了针对TCPTP的siRNA:esiTP,利用TCPTP-EGFP融合蛋白检测了esiTP下调TCPTP基因表达的
段雅彬[10]2016年在《黑果枸杞对辐射损伤小鼠的保护作用及机制研究》文中研究指明目的:通过测定黑果枸杞中总花色苷与原花青素B2的含量,为黑果枸杞的质量控制提供依据;探讨黑果枸杞对小鼠耐常压缺氧能力的影响,为辐射防护作用研究奠定理论基础。研究黑果枸杞对辐射损伤小鼠的防护作用及其机制。方法:采用紫外-可见分光光度法(UV-Vis)测定总花色苷的含量。原花青素B2的含量测定采用RP-HPLC法,色谱柱Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm,5μm),流动相为乙腈-2%冰醋酸溶液,流速为1 ml/min;检测波长为280 nm。抗缺氧实验,小鼠分为空白对照组,阳性组,黑果枸杞高、中、低剂量组,灌胃给药14d后进行常压密闭缺氧实验,观察各组小鼠存活时间、血红蛋白含量、红细胞数量、一氧化氮含量和抗氧化酶活力、脑含水量的变化。抗辐射实验,小鼠分为空白对照组、辐射模型组、阳性组、黑果枸杞高、中、低剂量组于照射后第3天进行实验,同法分组分别于照射后第7天、第14天进行实验。给药组灌胃给予黑果枸杞水提取液,空白与模型组给予等容生理盐水,连续14天,阳性组于照射前30 min腹腔注射氨磷汀。除正常组外各组小鼠接受X射线一次性全身照射。辐射后第3天、第7天、第14天分别观察各组小鼠血象、脏器指数、DNA含量、抗氧化酶活力、caspase-3、caspase-6、p53含量变化情况。结果:总花色苷和原花青素B2的含量分别为0.639 g/100 g和0.141 g/100 g;黑果枸杞水提取液能增加缺氧小鼠的存活时间、降低脑含水量。对HGB、RBC、GSH-PX、CAT无明显影响;黑果枸杞能升高辐射后小鼠红细胞、血红蛋白和脾脏指数,明显升高辐射小鼠骨髓DNA的含量。黑果枸杞低剂量组能降低辐射后3、7、14天小鼠细胞凋亡因子的含量,中剂量组能降低辐射后第7天caspase-6的量,黑果枸杞降低小肠p53蛋白的表达,保护小肠绒毛上皮的结构。黑果枸杞在辐射后不同时间点对抗氧化酶活力的影响不同。结论:黑果枸杞中含有大量原花青素B2和总花色苷,能够减轻缺氧小鼠的损伤。黑果枸杞能够提高小鼠的抗氧化能力,减少细胞凋亡,具有一定的辐射防护作用
参考文献：
[1]. 小鼠肝脏耐热蛋白的初步研究[D]. 张振峰. 华东师范大学. 2004
[2]. 小鼠肝脏部分耐热蛋白的初步研究[J]. 张振峰, 高红亮, 蔡在龙, 毛积芳, 焦炳华. 第二军医大学学报. 2004
[3]. 蝗虫营养价值与生物学功能研究[D]. 段玉峰. 陕西师范大学. 2005
[4]. 基础免疫[C]. 佚名. 第七届全国免疫学学术大会论文集. 2010
[5]. 富硒女贞子防治小鼠热应激作用及其机制初探[D]. 陈静. 扬州大学. 2014
[6]. 五种来源石斛对小鼠肝脏细胞色素P450酶表达的影响及对肝损伤的保护作用[D]. 王凯. 江苏大学. 2017
[7]. 杨桃酚类物质降脂作用及其改善肝脂变性的机理研究[D]. 庞道睿. 华南理工大学. 2017
[8]. 自噬在脂肪酸诱导肝损伤中的作用及机制的初步研究[D]. 涂芊茜. 第二军医大学. 2011
[9]. PTP1B为靶位利用RNAi技术治疗糖尿病的初步研究[D]. 徐剑锋. 复旦大学. 2005
[10]. 黑果枸杞对辐射损伤小鼠的保护作用及机制研究[D]. 段雅彬. 青海大学. 2016