杨巧慧[1]2013年在《基于络病理论探讨VEGF、MVD、LVD与子宫内膜癌的相关性的研究》文中提出研究目的：1、通过对络病理论的文献整理,结合子宫内膜组织血供丰富、代谢旺盛的特点以及女性特殊的生理病理特点,首次提出基于络病理论的子宫内膜癌病机。2、通过回顾性研究218例子宫内膜增生及子宫内膜癌病例的中医四诊资料及临床资料,分析子宫内膜增生及子宫内膜癌的中医证型分布规律。3、通过测定47例子宫内膜非典型增生及子宫内膜癌病理组织的血管内皮生长因子(VEGF)、微血管密度(MVD,以CD105标记)和微淋巴管密度(LVD,以D2-40标记),探讨其在子宫内膜非典型增生与子宫内膜癌中的表达规律。4、通过测定子宫内膜非典型增生及子宫内膜癌VEGF、MVD、LVD,探讨其与中医证型间的相关性,以及与临床分期、组织学分级及肌层浸润的相关性,初步探索基于络病理论的子宫内膜癌病机的实验基础。研究方法：1、文献整理：分别以“络病理论”、“络病”、“络脉”、“络”、“肿瘤”、“癌”、“妇科”、“胞络”、“子宫内膜癌”、"Endometrial carcinoma""tumor"、"cancer/carcinoma"、"TCM collateral disease theory"、"collateral disease"、"collateral"为关键词,检索出符合要求的文献,通过文献整理,总结络病理论在肿瘤防治的应用前景和VEGF与子宫内膜癌的相关性。2、理论研究：分别以“络病理论”、“络病”、“络”、“子宫内膜癌”“病机”、“胞络”为关键词,检索符合要求的文献,结合子宫内膜血供丰富、代谢旺盛的特点和女性特殊生理病理的特点,提出基于络病理论的子宫内膜癌病机。3、回顾性分析2]8例子宫内膜增生及子宫内膜癌病例的中医四诊资料,分析总结中医证型分布。4、用免疫组化的方法测定子宫内膜非典型增生和子宫内膜癌病理组织的VEGF、MVD、LVD,分析其在两者中表达的规律；5、根据VEGF、MVD、LVD检测结果,研究其与中医证型和临床分期、组织学分级及肌层浸润的相关性。研究结果：1、根据络病理论,结合子宫内膜的特点和女性特殊的生理病理特点,提出基于络病理论的子宫内膜癌病机为胞络虚滞、(火)毒损胞络、络息成积。2、218例子宫内膜增生及子宫内膜癌病例的中医证型可分为气虚证、血热证、血瘀证和湿毒瘀结证。随着子宫内膜单纯性增生、复杂性增生、子宫内膜非典型增生向子宫内膜癌的进展,气虚证所占比例逐渐减少,血瘀证、血热证比例逐渐升高,在子宫内膜癌病例中并开始出现湿毒瘀结证。在子宫内膜良性病变中,虚证表现突出,其中以肾虚和脾虚为主。在子宫内膜非典型增生及内膜癌病例中,血瘀和血热的表现比虚证的表现更加突出。3、测定子宫内膜癌病理组织的VEGF、MVD、LVD,结果显示测定值均高于子宫内膜非典型增生病例,具有统计学意义4、测定子宫内膜非典型增生和子宫内膜癌病理组织的VEGF、MVD和LVD。结果显示：不同中医证型其测定值不同。湿毒瘀结证中三者测定值均为最高。VEGF的表达以血热证中含量最低,其次为气虚证、血瘀证。MVD及LVD的表达均以气虚证最低,湿毒瘀结证最高；前者血热证高于血瘀证,后者血瘀证高于血热证。结合临床病理情况分析,三者的测定值还与临床分期、组织学分级、肌层浸润情况相关。结论：1、基于络病理论的子宫内膜癌病机为胞络虚滞、(火)毒损胞络和络息成积。其中,胞络虚滞为始动因素,(火)毒损胞络为根本原因,络息成积为关键环节。2、子宫内膜增生及子宫内膜癌中医证型可以分为气虚证、血热证、血瘀证和湿毒瘀结证。在子宫内膜良性病变中,虚证表现突出,气虚中又以肾虚为主,其次为脾虚。而在癌前病变及癌变后,血瘀和血热的表现比虚证表现明显；在癌变后,出现了湿毒瘀结证。提示在子宫内膜良性病变治疗中,应以补气扶正为主。在子宫内膜非典型增生及子宫内膜癌治疗中,应注意解毒化瘀通络,同时辅以补气扶正。解毒通络和化瘀通络的选择根据证型中热毒与瘀血所占比重而有所侧重。3、在子宫内膜癌病例中,VEGF、MVD及LVD的表达高于子宫内膜非典型增生的病例,提示子宫内膜癌的血管生成及淋巴管生成比子宫内膜非典型增生显著,具有统计学意义。4. VEGF、MVD、LVD的表达在湿毒瘀结证中均为最高,之后由高到低依次为VEGF—血瘀证、气虚证和血热证；MVD—血热证、血瘀证和气虚证；LVD—血瘀证、血热证和气虚证。提示在临床治疗中,应根据辨证选用通络的方法；不同证型对新生血管占优势还是新生淋巴管占优势有一定指导意义。VEGF、 MVD、LVD与临床分期、组织学分级和肌层浸润相关,三者联合可以作为子宫内膜癌生长、转移和预后的重要指标。
孙小淳[2]2018年在《miR-548c下调Twist对子宫内膜癌和卵巢癌迁移和侵袭的影响及机制研究》文中研究指明【背景】子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)为女性重要恶性肿瘤之一,约占女性生殖系统肿瘤的20-30%。子宫内膜癌多发生于绝经后的女性,但近几年来的临床统计资料表明,该病的发病率呈逐年升高趋势。尽管早期子宫内膜癌经过规范治疗之后,患者的5年生存率有了很大提高,但对于晚期、低分化子宫内膜癌或者特殊类型的子宫内膜癌患者来说,其预后往往较差,因此是造成患者死亡的重要因素之一。子宫内膜癌发病的临床表现之一为不规则阴道流血,因此往往被误认为是围绝经期的月经紊乱,当患者去医院就诊时则为时已晚,因此耽误了最佳的治疗时机。子宫内膜癌的发生具有较为严格的演变过程,若在癌前病变前采取有效的干预措施,则可能降低该病的发病率。所以寻找能够有效诊断和治疗的分子标志物对于子宫内膜癌的治疗具有十分重要的意义。卵巢癌(Ovarian cancer,OC)是指生长在卵巢上的恶性肿瘤。由于卵巢位于盆腔深部,卵巢癌早期无典型症状,筛查的作用又极其有限,而且不具有特异性,因此卵巢癌的早期诊断比较困难。约有60%~70%的患者就诊时已为晚期病例,即使目前肿瘤治疗已经取得了突破性进展且新的治疗手段也不断出现,但对于卵巢癌晚期病例治疗的效果依然不理想,因此卵巢癌的死亡率居于妇科恶性肿瘤死亡率的首位。目前依然缺乏有效鉴别卵巢癌组织类型及良恶性的有效方法,无论在诊断和治疗上对卵巢癌患者来说都是一大难题。miRNA属于内源性单链非编码单链小分子RNA,研究显示多种miRNA与包括子宫内膜癌和卵巢癌在内的恶性肿瘤的发生以及发展过程有关。miR-548属于miRNA家族中的成员之一,目前已有研究显示,miR-548c在乳腺癌、肝癌、骨肉瘤中呈低表达状态,因此具有类似抑癌基因的作用。但目前尚未有对于miR-548c在卵巢癌和子宫内膜癌中的作用以及相关机制的研究。转移是造成子宫内膜癌和卵巢癌患者死亡的主要原因。上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)被认为是子宫内膜癌和卵巢癌转移的关键步骤,这增强了肿瘤细胞的迁移和侵袭能力,进而促进其恶性化进展。因此,了解介导子宫内膜癌和卵巢癌细胞的迁移、侵袭和EMT过程的分子机制可以确定未来治疗这些癌症的新分子靶点。Twist蛋白属于碱性螺旋-环-螺旋结构(basic helix-loop-helix,b HLH)转录因子家族成员,为调控EMT的关键基因,能够促进胚胎发育,通过促使中胚层上皮细胞向间质细胞转化,从而使中胚层细胞具有迁移能力,最终对生物机体各个器官的生长发育产生促进作用。目前已有研究证实,Twist在子宫内膜癌和卵巢癌组织中均呈异常高表达状态,从而提示Twist在上述两种恶性肿瘤中均具有促癌基因的作用。【目的】本研究检测miR-548c和Twist在子宫内膜癌和卵巢癌中的表达水平,并分析两者与上述两种肿瘤临床病理参数的关系。通过体外细胞实验研究miR-548c对子宫内膜癌和卵巢癌细胞生物学行为的影响,并对其是否通过靶向调控Twist基因的表达影响子宫内膜癌和卵巢癌细胞侵袭和迁移进行探讨。旨在明确miR-548c在子宫内膜癌和卵巢癌细胞恶性化进程中的具体作用机理,为寻找新的有效诊断、治疗子宫内膜癌和卵巢癌的分子靶标奠定理论和实验基础。【方法】1.本研究采集50对原发性子宫内膜癌组织和癌旁相应正常组织,同时采集60例上皮型卵巢癌组织和20例正常上皮型卵巢组织,采用荧光定量PCR检测上述组织样本中miR-548c和Twist m RNA的表达,分析miR-548c与卵巢癌患者临床病理参数的相关性,同时分析miR-548c与子宫内膜癌和卵巢癌患者预后的关系。2.将人子宫内膜癌细胞系(RL95-2和HEC-1A)和人卵巢癌细胞系(SKOV-3和OVCAR3)均随机分为2组,即Anti-Ctr组:将miRNA inhibitor control转染细胞;Anti-548c组:将miR-548c inhibitor转染细胞。检测各组细胞的增殖活性、凋亡率、迁移能力和侵袭能力。3.采用生物学软件预测miR-548c的靶基因,并通过荧光素酶报告系统进行验证,检测miR-548c表达上调和下调后对RL95-2、HEC-1A和SKOV-3细胞中Twist蛋白表达的影响。检测miR-548c表达上调和下调后对RL95-2、HEC-1A和SKOV-3细胞中EMT相关基因E-cadherin、N-cadherin、CD133、MMP-9 m RNA表达的影响。分别将miR-548c inhibitor/miR-548c mimic和/或Twist si RNA/Twist c DNA转染RL95-2、HEC-1A和SKOV-3细胞,检测上述细胞的增殖活性、侵袭和迁移能力,检测细胞中Twist蛋白的表达。【结果】1.miR-548c在子宫内膜癌和卵巢癌组织中的表达水平显著降低,Twist在子宫内膜癌和卵巢癌组织中的表达水平显著增高相较于癌旁相应正常组织,miR-548c在子宫内膜癌组织中的表达水平显著降低(P<0.01)。相较于正常卵巢组织,miR-548c在卵巢癌组织中的表达水平显著降低(P<0.01)。在浆液性癌、III-IV期和3级肿瘤组织中miR-548c的表达显著低于非浆液性、I-II期和1-2级肿瘤组织。与miR-548c高表达的子宫内膜癌患者相比,miR-548c低表达的子宫内膜癌患者的总体生存率较差。尽管在本研究使用TCGA数据进行Meta分析未能显示出miR-548c表达水平与卵巢癌发生风险的关系(P=0.425),但miR-548c表达下调的卵巢癌患者的生存期较短。相较于癌旁相应正常组织,Twist m RNA在子宫内膜癌组织中的表达水平显著增高(P<0.01)。相较于正常卵巢组织,Twist m RNA在卵巢癌组织中的表达水平显著增高(P<0.01)。在浆液性癌、III-IV期和3级肿瘤组织中Twist m RNA的表达显著高于非浆液性、I-II期和1-2级肿瘤组织。2.miR-548c能够抑制细胞的增殖活性、侵袭和迁移能力与Anti-Ctr组相比,Anti-548c组细胞的增殖活性、侵袭和迁移能力均明显增高(P<0.01),凋亡率明显下降(P<0.01);在OVCAR3细胞中,与Anti-Ctr组相比,Anti-548c组细胞的增殖活性、侵袭和迁移能力均显著升高(P<0.01),凋亡率明显下降(P<0.01);在HEC-1A细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组细胞的增殖活性、侵袭和迁移能力均明显降低(P<0.01),凋亡率明显上升(P<0.01);在SKOV-3细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组细胞的增殖活性、侵袭和迁移能力均明显降低(P<0.01),凋亡率明显上升(P<0.01)。3.Twist被确定为miR-548c的直接靶基因在RL95-2细胞中,当miR-548c表达水平抑制后,转染Twist-WT质粒的细胞中荧光素酶的表达水平明显升高(P<0.01),而转染Twist-Mut质粒的细胞中荧光素酶的表达水平则无明显变化(P>0.05)。在HEC-1A和SKOV-3细胞中,当miR-548c表达水平上调后,转染Twist-WT质粒的细胞中荧光素酶的表达水平明显降低(P<0.01),而转染Twist-Mut质粒的细胞中荧光素酶的表达水平则无明显变化(P>0.05)。在RL95-2细胞中,与Anti-Ctr组相比,Anti-548c组细胞中Twist蛋白的表达水平明显增高(P<0.01),E-cadherin m RNA的表达水平明显降低(P<0.01),N-cadherin、CD133、MMP-9 m RNA的表达水平则明显升高(P<0.01)。在HEC-1A和SKOV-3细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组细胞中Twist蛋白的表达水平均明显降低(P<0.01),E-cadherin m RNA的表达水平明显上升(P<0.01),N-cadherin、CD133、MMP-9m RNA的表达水平则显著降低(P<0.01)。在RL95-2细胞中,与Anti-Ctr组相比,Anti-548c组细胞的增殖活性明显增高(P<0.01);与Anti-548c组相比,Anti-548c+Twist si RNA组细胞的增殖活性显著降低(P<0.01)。在HEC-1A细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组细胞的增殖活性明显降低(P<0.01);与Pre-548c组相比,Pre-548c+Twist c DNA组细胞的增殖活性明显升高(P<0.01)。在SKOV-3细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组细胞的增殖活性明显降低(P<0.01);与Pre-548c组相比,Pre-548c+Twist c DNA组细胞的增殖活性无明显变化(P>0.05)。在RL95-2细胞中,与Anti-Ctr组相比,Anti-548c组细胞的侵袭和迁移能力明显增高(P<0.01);与Anti-548c组相比,Anti-548c+Twist si RNA组细胞的侵袭和迁移能力显著降低(P<0.01)。在HEC-1A细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组细胞的侵袭和迁移能力明显降低(P<0.01);与Pre-548c组相比,Pre-548c+Twist c DNA组细胞的侵袭和迁移能力明显升高(P<0.01)。在SKOV-3细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组细胞的侵袭和迁移能力明显降低(P<0.01);与Pre-548c组相比,Pre-548c+Twist c DNA组细胞的侵袭和迁移能力明显增高(P>0.05)。在RL95-2细胞中,与Anti-Ctr组相比,Anti-548c组细胞中Twist蛋白的表达水平明显增高(P<0.01);与Anti-548c组相比,Anti-548c+Twist si RNA组Twist蛋白的表达水平显著降低(P<0.01)。在HEC-1A细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组Twist蛋白的表达水平明显降低(P<0.01);与Pre-548c组相比,Pre-548c+Twist c DNA组Twist蛋白的表达水平明显升高(P<0.01)。在SKOV-3细胞中,与Pre-Ctr组相比,Pre-548c组Twist蛋白的表达水平明显降低(P<0.01);与Pre-548c组相比,Pre-548c+Twist c DNA组Twist蛋白的表达水平明显增高(P>0.05)。【结论】1.miR-548c在子宫内膜癌以及卵巢癌组织中的表达水平异常下调,且miR-548c表达下调与子宫内膜癌患者的不良预后有关。2.Twist在上述肿瘤组织中的表达水平异常上调。miR-548c和Twist均与卵巢癌的组织学类型、病例分级、临床分期有关。3.miR-548c通过下调Twist的表达,进而抑制子宫内膜癌和卵巢癌细胞的增殖、侵袭、迁移,诱导细胞凋亡,从而抑制子宫内膜癌和卵巢癌发生和发展。
晁红霞[3]1999年在《子宫内膜癌的临床与实验研究》文中提出近20年来子宫内膜癌的发生率在世界范围内呈上升趋势，为最常见的妇科肿瘤之一，随着经济生活的改善和工业化进程，其发病率将持续上升。因此，子宫内膜癌的防治将成为我国肿瘤研究的重点领域之一。原发耐药是中晚期子宫内膜癌及其复发、转移患者化疗失败的重要原因，因此本课题尝试寻找另一种新的治疗途径。 肿瘤细胞普遍存在DNA甲基化模式的改变，异常甲基化与肿瘤的发生、演进密切相关。近年来，抑癌基因的高甲基化以及DNA甲基转移酶和去甲基化酶的研究，成为研究的热点。本课题选用目前常用于去甲基化研究的DNA甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR，以常发生5’CpG岛高甲基化而导致基因灭活的P16基因为观察对象，观察其抗子宫内膜癌裸鼠移植瘤的作用，探讨其抗肿瘤效应可能的机制；并检测临床子宫内膜癌标本中P16甲基化水平及P16 mRNA表达改变，以了解子宫内膜癌P16基因甲基化状态以及与子宫内膜癌发生、发展的关系，为今后临床应用提供依据。研究结果如下： 临床部分： 1．PCR法检测临床标本P16基因第一外显子甲基化状态：8例正常子宫内膜和6例子宫内膜单纯及复和增生均无甲基化，6例子宫内膜非典型性增生中发现1例甲基化，说明P16基因甲基化是子宫内膜癌发生的早期事件；38例子宫内膜癌中，13例甲基化(34.21％)，说明P16基因甲基化状态与子宫内膜癌关系密切。 2．应用RT-PCR检测临床标本P16 mRNA表达：以8例正常子宫内膜P16 mRNA表达为正常水平参照：6例子宫内膜单纯及复和增生中5例过表达，1例正常表达；6例子宫内膜非典型性增生中4例表达下降或不表达，2例正常表达；38例子宫内膜癌中27例(71.05％)P16 mRNA表达下降或不表达。统计学表明P16基因甲基化与P16 mRNA转录抑制高度相关。
庄妍[4]2017年在《MDH2通过抑制PTEN发挥促进子宫内膜癌增殖和侵袭作用的初步研究》文中指出子宫内膜癌是威胁妇女健康的三大生殖道肿瘤之一。在北美和北欧,子宫内膜癌是最常见的女性生殖道恶性肿瘤,占每年新发肿瘤病例的6%,肿瘤死亡病例的3%。子宫内膜癌的发病率呈现明显的地域性,发病率最高的是北美和北欧,其次为东欧和拉丁美洲,发病率最低的是亚洲和非洲。早期子宫内膜癌总体生存率在74-91%,而晚期仅为20-26%。按照临床表现,病理学特征及预后等,子宫内膜癌可以分为两类,Ⅰ型子宫内膜癌通常以内膜样腺癌为主,由内膜增生发展而来,常发生于生育年龄及绝经后妇女,被认为与无拮抗的雌激素暴露相关,Ⅰ型内膜癌预后较好;Ⅱ型子宫内膜癌以浆液性癌或透明细胞癌为代表,通常由萎缩内膜发展而来,多发生于绝经后妇女,是非雌激素依赖型,预后差。雌激素在子宫内膜癌的发病机制中扮演着重要角色。无拮抗的雌激素暴露被公认为是Ⅰ型子宫内膜癌的重要风险因素。大样本研究也已证实,无论Ⅰ型还是Ⅱ型子宫内膜癌,肿瘤组织中雌激素含量都高于正常组织。经典的雌激素代谢理论认为,雌激素通过与细胞核的雌激素受体ER结合激活转录因子和下游信号通路发挥生理学效应,这个过程通常需要数小时。事实上,雌激素还可以通过与细胞膜上的G蛋白偶联受体GPR30结合启动仅耗时数分钟甚至数秒钟的快速雌激素信号通路。我们之前的研究中已经证实,雌激素可以通过与GPR30的结合激活MAPK途径促进子宫内膜癌细胞的增殖侵袭。分子生物学研究揭示了雌激素在促进子宫内膜癌进展的生物学活动中PTEN,PIK3CA,K-RAS,P53,P16等基因突变或失活以及微卫星不稳定现象等的作用。研究表明,PI3K-AKT-PTEN-mTOR,Wnt-β-catenin等信号通路对子宫内膜癌细胞的生存与增殖,基因的转录与表达起到重要的调节作用。而肿瘤抑制因子PTEN在几乎高达80%的子宫内膜腺癌,近55%的子宫内膜增生过长病例中存在突变或失活。诸多研究数据提示,PTEN基因的突变是子宫内膜癌病变早期的致病因素之一。80多年前,Otto Warburg提出了瓦氏效应,开启了肿瘤代谢研究的新纪元。瓦氏效应指出,即使在氧供充足的情况下,肿瘤细胞仍优先选择糖酵解的方式提供能量。众所周知,有氧氧化可将一分子葡萄糖完全转化为二氧化碳和水,同时产生34分子ATP;而糖酵解途径在生成乳酸的同时,仅产生2分子ATP。肿瘤细胞选择这种产能效率低的代谢方式的现象引起了人们的思考。Warburg认为肿瘤细胞线粒体功能的损伤使其不得不选择糖酵解途径产能。然而,数十年来,越来越多的研究数据显示,大多数肿瘤细胞的线粒体功能并未受损,不仅如此,肿瘤细胞的线粒体中还发生了代谢重编程。在重编程过程中,代谢酶对肿瘤的发生发展起到了重要的作用。它们发挥自身酶的催化作用,或是发生基因突变,亦或通过抑制细胞的死亡途径等提高肿瘤细胞酵解途径的代谢活性,促进肿瘤细胞的增殖侵袭。近年来一些研究显示,部分代谢酶不仅可以发挥酶的催化作用,还可以作为一种转录调节因子直接调控肿瘤抑制基因,从而影响肿瘤细胞的生物学行为。苹果酸脱氢酶是三羧酸循环中的重要代谢酶。MDH催化苹果酸与草酰乙酸的相互转化。事实上,真核生物中,MDH通常有两种亚型,MDH1和MDH2。MDH2参与线粒体TCA循环,而MDH1通常参与苹果酸-天冬氨酸穿梭。MDH在多种肿瘤组织中过表达,如分化较差的消化系统鳞状细胞癌,恶性副神经节瘤,前列腺癌等。MDH在肿瘤组织中表达上调,活性增加,通过提高癌细胞代谢率发挥促进癌细胞的增殖的作用。有趣的是,一项关于MDH1与肿瘤抑制因子p53的关系的研究结果显示,在无葡萄糖的环境下,MDH1通过与下游基因启动子的P53反应元件相互作用反式激活抑癌基因P53的活性。敲除MDH1可显著降低乙酰-p53转录激活组蛋白编码与启动子结合。而且,MDH1还调节p53依赖的细胞周期停滞及凋亡。可见,MDH1可作为一种转录调节因子调控抑癌基因的活动。本实验希望通过科学研究探索苹果酸脱氢酶MDH2与子宫内膜癌抑制因子PTEN之间的关系,以及它们对肿瘤细胞生物学行为的影响,并初步探讨雌激素膜受体GPR30在雌激素对MDH2和PTEN表达调节中的作用,为进一步研究子宫内膜癌的能量代谢机制奠定基础。实验的第一部分,我们采用免疫组织化学法检测子宫内膜癌组织和正常组织MDH2表达情况及表达部位。同时,对临床病理资料进行统计学分析,找出MDH2与子宫内膜癌患者发病年龄,肿瘤的期别,级别,淋巴结转移等生物学特征之间的关系,以揭示MDH2的表达在子宫内膜癌临床病理方面的意义;第二部分,我们采用Realtime-PCR,Western-blot,细胞转染,RNA干扰等方法研究MDH2和PTEN之间的相互影响,并用免疫荧光法直观的展现MDH2与PTEN的表达部位与相互关系。第三部分,采用CCK8,流式细胞学分析,Transwell,凋亡检测,细胞转染,RNA干扰等方法,分别研究MDH2和PTEN对子宫内膜癌细胞增殖,侵袭,转移及凋亡等生物学行为的影响;第四部分,采用Realtime PCR法,研究雌激素,GPR30激动剂和抑制剂对子宫内膜癌细胞增殖的影响。第一部分MDH2在子宫内膜癌组织中的表达及临床病理意义对60孔子宫内膜癌组织芯片进行苏木素染色,结果显示,子宫内膜癌组织中,MDH2呈过表达状态,且其表达部位是细胞质。对这34例子宫内膜癌组织标本的临床病理资料进行的统计学分析显示MDH2的表达与子宫内膜癌的级别相关。这些数据提示MDH2可能在子宫内膜癌的发病机制中发挥了重要作用。第二部分MDH2和PTEN间的相互关系构建RNA干扰质粒MDH2 RNAi敲减MDH2,从细胞水平和蛋白水平均检测到PTEN表达的上升;而过表达质粒GV219-MDH2则会使PTEN的表达水平下降。同样的,用RNA干扰质粒PTENRNAi敲减PTEN,MDH2在细胞水平和蛋白水平的表达都有所上升;而过表达质粒GV219-PTEN则会使MDH2的表达下降。这些结果说明,MDH2和PTEN之间存在相互调节。免疫荧光检测中,我们看到,MDH2和PTEN共同表达与子宫内膜癌细胞HEC-1-A的细胞质中。因此,二者很可能通过直接结合发挥相互调节作用,当然这一猜想还有待实验进一步证实。第三部分MDH2和PTEN对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响构建RNA干扰质粒MDH2 RNAi及过表达质粒GV219-MDH2,并分别转染到子宫内膜癌细胞系HEC-1-A和AN3CA中。结果显示,敲减MDH2抑制了子宫内膜癌细胞的增殖,侵袭和转移,促进了肿瘤细胞的凋亡;而过表达MDH2的子宫内膜癌细胞系AN3CA却表现出增殖,侵袭和转移增强而凋亡减弱的情况。由此可见,MDH2促进子宫内膜癌的增殖侵袭,抑制其凋亡。类似的,我们再分别构建RNA干扰质粒PTEN RNAi和过表达质粒GV219-PTEN并转染内膜癌细胞,结果显示,敲减PTEN后,子宫内膜癌细胞的增殖,侵袭和转移的水平上调,而凋亡却受到抑制;相应的,过表达PTEN后,内膜癌细胞增殖侵袭减弱,凋亡增强。这也再次证实了 PTEN作为肿瘤抑制因子阻碍子宫内膜癌细胞生存侵袭的作用。第四部分雌激素对MDH2和PTEN表达的影响用雌激素,GPR30激动剂G1和抑制剂G15分别刺激子宫内膜癌细胞,在子宫内膜癌细胞系HEC-1-A(ER阳性,GPR30阳性)和AN3CA(ER阴性,GPR30阳性)细胞系中,雌激素和G1刺激MDH2表达上升,而G15使MDH2表达下降。相反,雌激素和G1的刺激使PTEN表达下降而G15使其表达上升。由此,我们不难得出结论,雌激素对MDH2的表达上调及对PTEN的表达下调,很可能是通过GPR30相关的信号通路完成的。综上所述,MDH2很可能在雌激素的刺激下,通过GPR30相关的信号通路抑制PTEN的表达,发挥促进子宫内膜癌细胞的增殖侵袭的作用。MDH2与PTEN相关性的探索为子宫内膜癌代谢机制的研究提供了实验基础。更为深入的实验研究将揭示MDH2在子宫内膜癌发病机制中的作用方式。MDH2很可能成为临床上诊断治疗子宫内膜癌的新的靶点。
黎金颜[5]2017年在《子宫内膜癌组织中叶酸受体α与CA125的表达及相关性研究》文中研究表明研究背景子宫内膜癌是发生在子宫内膜的一类上皮性恶性肿瘤,其发病率在一些欧洲发达国家已居于女性生殖道恶性肿瘤首位。近年发病率在世界范围内呈上升且年轻化趋势,其病因及发病机制未完全明确,治疗仍无突破性进展,术后生存率仍有待提高。目前,子宫内膜癌的诊断主要依靠症状、超声、诊刮术、肿瘤标志物等辅助检查。诊断性刮宫为最常见而有价值的诊断方法。为提高子宫内膜癌患者的生存期及生活质量,早发现、早诊断并尽早干预是关键。近期,有报道指出,叶酸受体α(FRA)在大部分子宫内膜癌组织中呈高表达,有望成为新的肿瘤标志物。FRA是一种糖基磷脂酰肌醇偶联蛋白,在正常组织中表达极低,但在上皮性恶性肿瘤细胞表达明显上升。正因为这一表达差异及特异性,使之有望成为新型生物标志物,协助肿瘤的诊断、监测及预后判断。本研究团队前期研究发现,子宫内膜癌患者血清FRA表达显著升高,那么,FRA在子宫内膜癌组织中的表达及意义如何?CA125是最常见的妇科肿瘤标志物,现已被广泛用于泌尿生殖系统、消化系统等肿瘤的诊断和追踪。目前,对于CA125在子宫内膜癌中的表达研究多局限于血清学方面,然而大多数学者认为血清CA125水平并不能准确反应肿瘤的进展程度。那么CA125在内膜病变组织中表达如何?其与FRA是否存在相关性?对临床诊断及预后判断是否存在意义?目的通过检测不同内膜病变组织中FRA、CA125的表达差异及与临床病理特征的关系,探讨FRA在子宫内膜癌变过程的临床意义及可能的机制,分析FRA与CA125的相关性,探讨两者对临床诊断及预后判断的意义。方法收集子宫内膜腺癌标本60例,随机选取子宫内膜增生症46例及正常子宫内膜10例,采用免疫组化法检测组织中FRA、CA125的表达。阳性染色为细胞膜及细胞质中呈现棕黄色或棕褐色颗粒,与阴性表达的比较。结果1、FRA在正常子宫内膜、子宫内膜增生症及子宫内膜癌组织中均可见表达,阳性率分别为10.0%、45.7%、93.3%,且在内膜癌中呈高表达(65.0%),较增生症组和正常组升高(P<0.05)。2、复杂型子宫内膜增生组织中FRA的阳性率较单纯型升高,伴不典型增生较其他类型表达率升高(P<0.05);内膜癌组中,FRA的表达与年龄、FIGO手术病理分期、分化程度有关(P<0.05)。3、CA125在正常子宫内膜组织中以低表达为主,在增生症及内膜癌组织中则以高表达为主。FRA及CA125在子宫内膜癌变过程中呈弱正相关关系(r=0.204,P=0.028)。结论1、子宫内膜从正常增殖到增生、出现不典型增生继而癌变,组织中FRA的表达呈逐步上调趋势,提示FRA可能参与到子宫内膜病变甚至癌症发生当中;FRA作为一种新型生物标志物,为子宫内膜癌的靶向诊断提供理论基础。2、子宫内膜癌中FRA的表达较非癌变组织明显增高,且与肿瘤的分化、分期相关,提示FRA有望成为子宫内膜癌新的治疗靶点。3、FRA与CA125在子宫内膜癌变过程中均呈上调趋势,两者联合用于诊断子宫内膜癌的效果优于单一指标。
赵喜娃[6]2017年在《CARLo-5在子宫内膜癌中的作用及机制研究》文中提出子宫内膜癌是最常见的妇科恶性肿瘤之一。2015年子宫内膜癌在中国的新发病例数约为63400人,死亡率约为21.8%,新发病例数逐年上升,且发病呈年轻化的趋势。2016年美国子宫内膜癌新发病例约为60050人,成为继乳腺癌之后的第二大妇科癌症,严重危害了女性的健康。尽管目前医学诊断和治疗水平已经非常发达,但子宫内膜癌的确切发病机制尚不明确,治疗手段也十分有限。最近,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)的发现为探索子宫内膜癌的发病机制提供了分子生物学基础。lncRNA是长度超过200nt不能编码蛋白质的转录本,大量的研究发现其在人类的生命活动及各种疾病的发生发展中发挥了重要的作用。CARLo-5是最近发现的长度为2628个核苷酸的lncRNA,位于原癌基因myc的增强子附近,据报道,CARLo-5在结肠癌、胃癌等多种癌组织中表达上调,在癌症的发生和进展中起着重要作用,对多种癌症的诊断、预后评估和治疗均具有潜在价值。然而,CARLo-5在子宫内膜癌中的表达情况及作用机制尚未见报道。本研究采用实时荧光定量PCR(Real-time PCR)的方法检测正常子宫内膜组织和子宫内膜癌组织中CARLo-5基因的表达水平,使用蛋白印迹法(Western-blot)检测细胞周期相关蛋白CDK2和CDKN1A的表达情况,深入分析了CARLo-5表达水平与子宫内膜癌患者临床病理特征和总生存期的相关性,并统计分析了CARLo-5基因表达水平与细胞周期相关蛋白CDK2和CDKN1A表达水平的相关性。体外敲低子宫内膜癌细胞中CARLo-5的表达后,通过MTS法、Transwell迁移、Matrigel侵袭实验、平板克隆形成实验及流式细胞术检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响。为了探究CARLo-5在子宫内膜癌中的作用机制,本研究通过Western-blot检测了敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞中CDK2、CDKN1A、基质金属蛋白酶MMP2和MMP9表达水平的影响。通过RNAi慢病毒技术构建了稳定敲低CARLo-5的子宫内膜癌细胞株,并进行裸鼠皮下荷子宫内膜癌细胞成瘤实验,检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞体内增殖能力的影响。本研究探索了CARLo-5在子宫内膜癌中的作用及机制,利于阐明子宫内膜癌发生发展的分子生物学机制,从而为子宫内膜癌的基因诊断和治疗提供前期实验基础。第一部分CARLo-5在子宫内膜癌组织中的表达及临床意义目的:研究lncRNA CARLo-5在子宫内膜癌组织中的表达情况,并探讨CARLo-5表达水平与子宫内膜癌患者临床病理特征及总生存期的关系。检测子宫内膜癌组织中细胞周期相关蛋白CDK2和CDKN1A的表达水平及其与CARLo-5表达水平的相关性。方法:1采用Real-time PCR法检测108例子宫内膜癌组织和66例正常子宫内膜组织中CARLo-5的表达水平。2采用Western-blot检测子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中细胞周期相关蛋白CDK2和CDKN1A的表达情况。3分析CARLo-5的表达水平与子宫内膜癌患者临床病理特征和总生存期的相关性。4分析CARLo-5在子宫内膜癌组织中的表达与细胞周期相关蛋白CDK2和CDKN1A表达之间的相关性。结果:1 lncRNA CARLo-5在子宫内膜癌组织和正常子宫内膜组织中的表达水平Real-time PCR实验结果显示:CARLo-5在子宫内膜癌中的表达水平较正常子宫内膜组织明显升高(P<0.001)。2 CARLo-5的表达水平与子宫内膜癌患者临床病理特征的相关性CARLo-5在子宫内膜癌组织中的表达水平与子宫内膜癌患者的临床分期和淋巴结转移密切相关(P<0.05),与患者的年龄、病理类型、病理分级、肌层侵犯深度和脉管浸润无明显相关性(P>0.05)。3 CARLo-5的表达水平与子宫内膜癌患者总生存期的相关性CARLo-5高表达组子宫内膜癌患者的平均生存时间(43.0±14.1月)较CARLo-5低表达组患者(52.5±9.1月)明显缩短(P<0.05)。4子宫内膜癌组织中CDK2和CDKN1A蛋白的表达水平Western-blot结果显示:CDK2蛋白在子宫内膜癌组织中的表达水平(9.32±0.69)较正常子宫内膜组织(1.00±0.54)明显升高,而CDKN1A蛋白在子宫内膜癌组织中的表达水平(0.71±0.14)较正常子宫内膜组织(1.00±0.11)明显降低(P<0.001)。5 CARLo-5的表达水平与CDK2和CDKN1A蛋白表达水平的相关性子宫内膜癌组织中CDK2蛋白的表达水平与CARLo-5的表达呈正相关关系(r=0.30,P=0.043)。CDKN1A蛋白的表达与CARLo-5的表达呈负相关关系(r=-0.28,P=0.046)。结论:1 CARLo-5在子宫内膜癌组织中的表达较正常子宫内膜明显升高,提示CARLo-5可能在子宫内膜癌发生发展中发挥了促进作用。2 CARLo-5高表达与子宫内膜癌患者的临床分期、淋巴结转移和不良预后相关,提示CARLo-5可能成为子宫内膜癌判断预后的分子标志物。3 CDK2蛋白在子宫内膜癌组织中的表达水平较正常子宫内膜明显升高,CDKN1A蛋白表达水平明显降低,且CDKN1A和CDK2蛋白的表达与CARLo-5的表达水平具有明显相关性。这些结果提示,CARLo-5可能部分通过调节CDK2和CDKN1A蛋白的表达而在子宫内膜癌中发挥促癌作用。第二部分CARLo-5对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响及机制研究目的:通过调节CARLo-5在子宫内膜癌细胞中的表达情况来探讨其对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响及其可能的机制。方法:1采用MTS法检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞体外增殖活性的影响。2采用Transwell迁移、划痕愈合实验和Matrigel侵袭实验检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响。3采用平板克隆形成实验检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞克隆形成能力的影响。4采用流式细胞术检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞增殖周期的影响。5采用Real-time PCR和Western-blot检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞中CDK2和CDKN1A基因及蛋白表达水平的影响。6采用Western-blot检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞中MMP2和MMP9蛋白表达水平的影响。结果:1敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞体外增殖活性的影响MTS法检测结果显示:敲低CARLo-5后子宫内膜癌细胞HEC-1-B和KLE的体外增殖活性明显降低(P<0.05)。2敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞体外迁移和侵袭能力的影响Transwell迁移和划痕愈合实验结果显示:敲低CARLo-5后子宫内膜癌细胞HEC-1-B和KLE的体外迁移能力明显降低(P<0.05);Matrigel侵袭实验结果显示:敲低CARLo-5后子宫内膜癌细胞HEC-1-B和KLE的体外侵袭能力明显降低(P<0.05)。3敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞克隆形成能力的影响平板克隆形成实验结果显示:敲低CARLo-5后子宫内膜癌细胞HEC-1-B和KLE的克隆形成能力明显下降(P<0.05)。4敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞增殖周期的影响流式细胞术结果显示:敲低CARLo-5后子宫内膜癌HEC-1-B和KLE细胞G0/G1期细胞数明显增多,S期细胞数明显减少(P<0.05)。5敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞CDK2和CDKN1A的基因及蛋白表达水平的影响Real-time PCR和Western-blot结果显示:敲低CARLo-5后子宫内膜癌细胞中CDK2 m RNA和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05),而CDKN1A m RNA和蛋白的表达水平明显增高(P<0.05)。6敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞MMP2和MMP9蛋白表达水平的影响Western-blot结果显示:敲低CARLo-5后子宫内膜癌细胞中MMP2和MMP9蛋白表达水平明显降低(P<0.05)。结论:1敲低CARLo-5能抑制子宫内膜癌细胞的体外增殖、迁移和侵袭能力,提示CARLo-5的表达能够促进子宫内膜癌细胞的增殖、侵袭和转移,CARLo-5有望成为子宫内膜癌治疗的新的生物学靶标。2敲低CARLo-5将子宫内膜癌细胞阻滞在G0/G1期,并抑制CDK2 m RNA和蛋白水平的表达,促进CDKN1A m RNA和蛋白水平的表达,提示CARLo-5可能通过调控CDK2和CDKN1A的表达,抑制细胞G0/G1期阻滞,进而促进子宫内膜癌细胞的增殖。3敲低CARLo-5能够抑制子宫内膜癌细胞中MMP2和MMP9蛋白的表达,提示CARLo-5可能通过上调MMP2和MMP9蛋白的表达来促进子宫内膜癌的转移。第三部分敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响及机制研究目的:检测稳定敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞在裸鼠体内的成瘤能力的影响,通过裸鼠体内实验来探讨其在子宫内膜癌发生发展中的作用机制。方法:1通过RNAi慢病毒技术构建稳定敲低CARLo-5的子宫内膜癌细胞株。2裸鼠皮下成瘤实验检测敲低CARLo-5对子宫内膜癌细胞体内成瘤能力的影响。3免疫组织化学法实验检测裸鼠移植瘤组织中CDK2和CDKN1A蛋白的表达水平。结果:1敲低CARLo-5在体内对子宫内膜癌细胞的影响sh RNA-1组、sh RNA-2组和对照组裸鼠移植瘤的平均体积分别为(157.66±37.93 mm3)、(102.81±58.33mm3)、(499.74±98.61 mm3),敲低CARLo-5组裸鼠移植瘤的生长速度和重量较未敲低组均明显降低(P<0.05)。2敲低CARLo-5对裸鼠移植瘤组织中CDK2和CDKN1A蛋白的表达水平的影响免疫组织化学结果显示:敲低CARLo-5组裸鼠移植瘤组织中CDK2的蛋白表达水平较未敲低组明显降低(P<0.05),而CDKN1A的蛋白表达水平较未敲低组明显增高(P<0.05)。结论:敲低CARLo-5明显抑制子宫内膜癌细胞的体内增殖活性,其作用机制可能为CARLo-5抑制CDKN1A并促进CDK2蛋白表达,进而促进子宫内膜癌细胞的体内增殖,CARLo-5有望成为子宫内膜癌治疗的新的靶点。
唐瑶[7]2017年在《子宫内膜病变中医证型、证素分析及清热解毒方干预的分子机制》文中研究指明目的:通过回顾性研究分析子宫内膜增生和子宫内膜癌病例的中医辨证分型,探讨子宫内膜增生及子宫内膜癌的中医证型证素分布规律。通过测定子宫内膜病变病理组织中LC3的表达含量变化,探讨"自噬"在子宫内膜病变中的表达规律。通过实验研究清热解毒方(黄连15g、白花蛇舌草15g、半枝莲15g、生黄芪20g等)醇提及水提物对人子宫内膜癌细胞株HEC-1A细胞及Ishikawa细胞增殖和凋亡和自噬的影响。方法:1.回顾性分析120例子宫内膜增生及子宫内膜癌病例的中医诊断资料,分析总结子宫内膜增生及子宫内膜癌的中医证型、证素分布规律。2.用免疫组化的方法测定子宫内膜增生和子宫内膜癌病理组织中LC3的表达含量变化,探讨"自噬"在子宫内膜病变中的表达规律。3.根据LC3检测结果,探讨自噬与中医证型和中医证素的相关性。4.MTS法测定清热解毒方(黄连15g、白花蛇舌草15g、半枝莲15g、生黄芪20g等)正丁醇提物及水提物对子宫内膜癌细胞株HEC-1A及Ishikawa体外增殖抑制的影响。5.流式细胞仪检测清热解毒方(黄连15g、白花蛇舌草15g、半枝莲15g、生黄芪20g等)正丁醇提物及水提物对子宫内膜癌细胞株HEC-1A及Ishikawa细胞凋亡及周期的影响。6.Transwell检测清热解毒方(黄连15g、白花蛇舌草15g、半枝莲15g、生黄芪20g等)正丁醇提物及水提物对子宫内膜癌细胞株HEC-1A及Ishikawa细胞侵袭能力的影响。7.Western-blot检测清热解毒方(黄连15g、白花蛇舌草15g、半枝莲15g、生黄芪20g等)正丁醇提物及水提物对子宫内膜癌细胞自噬相关蛋白LC3表达的影响。8.Real Time PCR检测清热解毒方正丁醇提物及水提物干预后子宫内膜癌细胞各组中LC3B基因表达量的变化。9.PhosflowTM检测清热解毒方正丁醇提物及水提物干预子宫内膜癌细胞自噬相关通路MTOR、AKT的表达。10.免疫荧光染色观察清热解毒方正丁醇提物及水提物对子宫内膜癌细胞自噬蛋白LC3的影响11.投射电镜观察清热解毒方正丁醇提物及水提物对子宫内膜癌细胞自噬的影响。结果:1.120例子宫内膜增生及子宫内膜癌病例的最常见的中医证型有气虚血瘀、肾虚血瘀和肾阴虚,子宫内膜癌最常见的病性证素是血瘀、气虚、热(火)、阴虚、湿、湿热。2.LC3在中医诊断中的分布由高到低依次为经断复来、月经过多、经间期出血、癥瘕、崩漏和经期延长。3.子宫内膜癌组的LC3测定值高于子宫内膜增生组,具有统计学意义。4.不同中医证型LC3测定值不同,肾虚中测定值为最高。5.清热解毒方(黄连15g、白花蛇舌草15g、半枝莲15g、生黄芪20g等)正丁醇提物在不同浓度、不同时间里对2种内膜癌细胞系的增殖有显著抑制作用。其中,作用24小时、48小时,HEC-1A细胞1.25mg、0.625mg、0.3125mg组间细胞抑制率有显著性差异(P<0.01);Ishikawa 细胞 5mg/mL、2.5mg/mL、1.25mg/mL、0.625mg/mL、0.3125mg/mL、0.15625mg/mL组间细胞抑制率有显著性差异(P<0.01);作用24小时,HEC-1A 细胞、Ishikawa 细胞 10mg、5mg、0.625mg、0.078125mg 组间细胞抑制率有显著性差异,(P<0.01)。清热解毒方(黄连15g、白花蛇舌草15g、半枝莲15g、生黄芪20g等)正丁醇提物作用于HEC-1A细胞、Ishikawa细胞,与正常组比较,给药组细胞凋亡率显著增高,差异显著。清热解毒方(黄连15g、白花蛇舌草15g、半枝莲15g、生黄芪20g等)正丁醇提物及水提物,能显著阻滞HEC-1A及Ishikawa细胞周期,降低细胞侵袭力。6.清热解毒方(黄连15g、白花蛇舌草15g、半枝莲15g、生黄芪20g等)正丁醇提物及水提物,能够抑制HEC-1A及Ishikawa细胞发生自噬,并通过AKT-MTOR通路抑制HEC-1A及Ishikawa细胞自噬从而达到抗肿瘤作用。结论:1.子宫内膜增生及子宫内膜癌病例的最常见的中医证型有气虚血瘀、肾虚血瘀和肾阴虚,子宫内膜癌最常见的病性证素是血瘀、气虚、热(火)、阴虚、湿、湿热。2.自噬与子宫内膜癌的发生、发展具有相关性。3.清热解毒方(黄连15g、白花蛇舌草15g、半枝莲15g、生黄芪20g等)正丁醇提物及水提物能够抑制HEC-1A及Ishikawa细胞发生自噬,并通过AKT-MTOR通路抑制HEC-1A及Ishikawa细胞自噬从而达到抗肿瘤作用。4.以中医辨证论治理论为基础,有效结合辨病论治和辨证论治,清热解毒方(黄连15g、白花蛇舌草15g、半枝莲15g、生黄芪20g等)对子宫内膜癌各个证型及病程的治疗均有指导意义。
李美灵[8]2016年在《Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌组织中miR-181a与CA125的表达及其相关性研究》文中研究说明子宫内膜癌(endometrial carcinoma,EC)是发生于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤,好发于围绝经期和绝经后妇女,流行病学调查显示肥胖、高血压、糖尿病、吸烟、恶性肿瘤家族史、不孕等均是子宫内膜癌发病的高危因素,绝经后及绝经过渡期阴道流血为子宫内膜癌最常见的症状。子宫内膜癌与宫颈癌、卵巢癌合称女性生殖道三大恶性肿瘤。其发病率在美国及一些欧洲国家已高居女性生殖系统恶性肿瘤首位,在我国,其发病率仅次于宫颈癌,高居女性生殖系统恶性肿瘤第二位,约占女性生殖道恶性肿瘤的20%.30%,且近年来其发病率逐年上升,患者呈年轻化趋势,其治疗仍无突破性进展,术后存活率仍较低,目前其病因及发病机制仍未明确。根据子宫内膜癌的临床和病理特征,Bohkman将子宫内膜癌分为Ⅰ型(雌激素依赖型)Ⅱ型(非雌激素依赖型),两型的高危因素不同。前者的发生与长期雌激素刺激(内源性或外源性)有关,多发生在子宫内膜增生症(包括单纯性增生、复杂性增生和不典型增生)的基础上,因无孕激素拮抗,内膜持续增厚继而发生癌变,主要的病理类型为子宫内膜样腺癌,ER(雌激素受体)、PR(孕激素受体)常呈阳性表达,这种病理类型占子宫内膜癌的大多数,肿瘤分化好,肌层浸润浅,预后较好,PTEN基因失活和微卫星不稳定是常见的分子事件；而目前研究发现,后者的癌变与雌激素刺激无明确联系,其发病早期内膜多萎缩,而非增生,主要的病理类型为浆液性乳头状腺癌和透明细胞癌,其ER、PR一般为不表达或低表达,多见于绝经后妇女,肿瘤恶性程度高,分化差,容易有深肌层浸润,预后不良。P53基因突变和HER2基因过度表达为常见的分子事件。为显著提高子宫内膜癌患者的生存质量和生存期,早期发现、早期诊断、及早干预是其关键,但是,目前为止,本病尚找到合适的早期诊断的特异性标志物。随着分子生物学及其技术和生物信息学的飞速发展,微小RNA(microRNA, mir-RNA)成为近几年来的研究热点,它是一类长约20-23 nt的非编码单链小RNA,具有高度保守性、时序表达特异性、组织表达特异性三大特性。通过在转录后结合到靶基因mRNA的3'-UTR(3’非编码区)诱导靶mRNA的降解或抑制靶mRNA的翻译,或其他形式的调节机制,实现在转录后水平的调控作用,进而影响各种生物学性状。miRNA在肿瘤发生和发展过程中充当癌基因或者抑癌基因作用,其表达的变化与肿瘤的发生发展、诊断、治疗及预后密切相关。最近的研究报道显示发现miRNA表达谱的异常与子宫内膜癌的临床特征如分期、子宫肌层浸润、复发、淋巴转移等都存在明显相关性。如Yoneyama等人研究发现在子宫内膜腺癌中miR-200a、miR-200b、miR-429表达明显上调,可能通过下调抑癌基因PTEN(第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因)的表达导致子宫内膜癌的发生。Lee等研究发现当miR-200家族的表达被抑制后,HEC-1A细胞及Ishikawa细胞生长均减慢,而且转染了miR-429的HEC-1A细胞,细胞对顺铂的耐药性减弱。Karaayvaz等研究发现子宫内膜癌中miR-200c和miR-205表达明显升高,其中miR-205与子宫内膜癌的预后明显相关,通过Kaplan-Meier生存分析显示miR-205表达水平越高患者总体生存率的越低。结果提示miR-205通过降低PTEN的表达导致子宫内膜癌的发生发展及不良预后。miR-181a是近年来新发现的一种miRNA,广泛存在于各种细胞中,在细胞的生长、增殖、分化和凋亡的过程发挥重要的调控作用。miR-181a的表达异常与机体免疫调节、白血病、乳腺癌、消化系统肿瘤、神经胶质细胞瘤、肺癌、口腔鳞状细胞癌和宫颈癌、卵巢癌的发生发展密切相关。目前,国外研究发现,在新鲜冰冻子宫内膜癌组织中,miR-181a的表达上调,其靶基因可能为PR, PR的表达与miR-181a的表达成负相关。而国内尚未见有关miR-181a与子宫内膜癌分型及临床特征关系的研究报道。本研究团队前期实验研究发现Hsa-miR-181a在甲醛固定石蜡包埋子宫内膜癌组织中表达上调,可能起到癌基因的作用,且Hsa-miR-181a在Ⅱ型内膜癌组织中的表达较Ⅰ型内膜癌组织明显上调。有大量研究者发现miRNA表达谱在Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌中存在差异,同时有不同的靶基因和分子信号通路,可能参与了Ⅰ型/Ⅱ型内膜癌的不同发病机制。如周静等选取了可能以ERa为靶基因的miR-100在细胞系Ishikawa(来源于Ⅰ型内膜癌)和KLE(来源于Ⅱ型内膜癌)体外培养细胞和体内成瘤组织以及10例临床内膜癌标本中进行了qRT-PCR验证,发现hsa-miR-100在Ⅱ型组的表达显著高于Ⅰ型组,其靶基因可能为ERa。Zhang等研究发现Ⅰ型子宫内膜癌中miR-143、miR-145明显下调,与DNMT3B(DNA甲基转移酶)过度表达相关,而在Ⅱ型子宫内膜癌中,miR-143、miR-145表达与DNMT3B并无明显相关性。那么miR-181a在Ⅰ型和Ⅱ型内膜癌不同发病机制中可能的靶基因或信号通路是什么?CA125是存在于细胞表面的一种大分子糖蛋白,广泛存在于体腔上皮起源的各种组织细胞中及这些组织细胞发生的肿瘤中,如在正常情况下子宫内膜、输卵管及腹膜都能有极其微量CA125生成,在卵巢上皮癌、输卵管癌、子宫内膜癌及间皮细胞癌等肿瘤中CA125均明显升高。现已被广泛应用于泌尿生殖系统、消化系统等肿瘤的诊断和追踪。目前在临床上,CA125已被广泛应用于盆腔包块(尤其是卵巢上皮性肿瘤)的鉴别诊断、监测疗效及判断预后。目前有关子宫内膜癌CA125的检测大多局限于血清学检测,然而子宫内膜癌与血清CA125与的关系研究及检测价值一直存在争议,有学者认为术前血清CA125与组织学类型、病理分期分级、肌层浸润及淋巴转移均明显相关,然而大部分学者认为血清CA125水平并不能准确地反映肿瘤进展程度,与肌层浸润深度无关,对预测预后无帮助。可能与子宫内膜癌患者的CA125抗原量不足、进入外周血后被迅速清除,或经宫腔内脱落未进入血液循环有关,致使早期子宫内膜癌血清CA125阳性率降低。有研究者发现将子宫内膜癌组织中CA125敏感性和特异性均显著高于血清CA125,且与子宫内膜癌病理分级有关,病理分期越高,组织中CA125表达率越高。本团队早期实验研究发现,CA125在子宫内膜及其病变组织中的表达与内膜组织的病理演变进程一致,病变越严重,腺细胞生长和分泌越活跃,产生的CA125越多,但是在低分化及恶性程度高的子宫内膜癌中CA125表达有减弱的现象。鉴于Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌在病理特征方面的差异,那么在Ⅱ型内膜癌中CA125的表达是否有减弱现象?Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌中CA125的表达是否存在差异?有研究发现卵巢癌患者术前血清CA125与卵巢组织中miR-181a的存在关联性。相关性分析显示：卵巢癌患者术前血清CA125表达与miR-181a的表达成正相关,随着血清CA-125的增高的miR-181a的表达量逐渐升高。那么Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌组织中miR-181a与CA125的表达是否也存在相关性?若子宫内膜病变组织中miR-181a与CA125存在相关性,其可能的病理机制或信号通路是什么?对临床诊断或预后判断是否存在意义?为此,本实验拟通过检测甲醛固定石蜡包埋子宫内膜组织中miR-181a、CA125在Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌中的表达差异,分析miR-181a、CA125在不同类型子宫内膜癌中的表达差异及其两者的相关性,探讨miR-181a在子宫内膜发生癌变过程中的意义及其可能机制。第一章 Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌中miR-181a的表达及其意义研究内容及方法：1、选择2011年1月.2013年12月,南方医科大学附属小榄医院收治的41例子宫内膜癌患者及中山大学附属中山医院收治的4例、南方医科附属南方医院收治的2例Ⅱ型子宫内膜癌患者。为了解子宫内膜癌变的发生发展过程,同时选取了南方医科大学附属小榄医院收治的子宫内膜增生症患者18例,正常子宫内膜患者13例。患者年龄24-69岁,平均48岁。术前均未行放化疗及内分泌治疗,术后诊断均经病理证实。2、子宫内膜癌组织均经免疫组织化学染色检测其中ER、PR表达：以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性信号,否则为阴性。根据组织切片染色结果分Ⅰ型子宫内膜癌(ER、PR均阳性)和Ⅱ型子宫内膜癌(ER、PR均阴性)。3、总RNA提取：每例石蜡标本连续切片10张,每张厚10μm,取组织细胞含量在50%以上区域的切片每例2-5张(平均4张)制备总RNA。将切片放入1.5mL无水乙醇洗涤2次去除残余二甲苯。彻底干燥后严格按照QIAGEN总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。4、紫外线分光光度计检测提取的总RNA的吸光度(OD值),采用1%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性。5、通过microRNA茎环引物进行逆转录,以U6为内参,采用SYBR green实时荧光定量PCR技术检测各组子宫内膜组织中miR-181a的表达。反应参数为95℃预变性6mmin；95℃变性10s；55℃退火10s；72℃延伸30s,共50个PCR循环。记录Ct值。miRNA相对表达量即ΔCt=Ct (miR-181a)-CtU6,计算ΔCt=(Ct(miR-181a)-CtU6)实验组-(Ct (miR-181a)-CtU6)对照纽,各实验组miR-181a相对对照组的表达倍数以Folds=2-ΔΔCt表示。结果：1、各组子宫内膜组织中miR-181a的表达：miR-181a在正常子宫内膜组织中可见表达,与正常子宫内膜组相比,miR-181a在子宫内膜癌组织、子宫内膜增生症组织中表达(△Ct值分别为.3.356±2.401、.1.893±2.568)分别上调11.228倍(P<0.05)、4.073倍(P<0.05)。且子宫内膜癌组织miR-181a的表达是子宫内膜增生症组的2.757倍(P<0.05)。2、Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌组织miR-181a的表达：与正常组相比,Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌组织中miR-181a的表达(ACt值分别为-2.957±2.453、.4.832±1.524)分别上调8.515倍(P<0.05)和31.233倍(P<0.05)；且Ⅱ型子宫内膜癌组织中miR-181a表达是Ⅰ型内膜癌组织的3.668倍(P<0.05)。与子宫内膜增生症组相比,miR-181a在Ⅰ型和Ⅱ型内膜癌组中的表达分别上调2.091倍(P>0.05,差异无统计学意义)、7.669倍(P<0.05)。结论：从正常子宫内膜,到子宫内膜增生症,再到子宫内膜癌,miR-181a的表达呈逐渐上调的趋势,miR-181a在子宫内膜癌变过程中能参与了子宫内膜癌形成的早期分子事件,起到了癌基因的作用,甚至有望成为子宫内膜癌的早期筛查及诊断标志物。然而在子宫内膜增生症组织中miR-181a的表达相对Ⅰ型子宫内膜癌差别无统计学意义,相对Ⅱ型子宫内膜癌组织则显著降低,Ⅱ型子宫内膜癌组织中miR-181a的表达明显高于Ⅰ型,miR-181a的这种差异表达可能在不同类型内膜癌的发生、发展过程中发挥重要作用,尤其与Ⅱ型子宫内膜癌的发病机制相关。第二章Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌中CA125的表达及其与miR-181a的相关性研究内容及方法：将第一部分中子宫内膜组织标本均经过4%甲醛固定,常规作石蜡包埋切片,厚约4um,采用MaxVisionTM免疫组织化学染色法检测组织中CA125表达。实验步骤严格按MaxvisionTM检测试剂盒KIT-5001说明书操作。完全不染色：阴性(.)；CA125阳性染色：在细胞膜和(或)细胞质出现棕黄色颗粒。弱阳性(+)：染色呈浅棕色,且阳性细胞率小于10%(观察10个高倍视野)；中等阳性(++)：染色介于(+)与(+++)之间,阳性细胞率10%-50%；强阳性(+++)：CA125染色呈深棕黄色,结构清晰,阳性细胞率大于50%。结果：1、正常子宫内膜组织中的CA125的表达以弱阳性为主,子宫内膜增生症和子宫内膜癌组织中则以中等阳性及强阳性为主。子宫内膜癌中,Ⅰ型内膜癌中以强阳性表达为主,Ⅱ型内膜癌中以中等阳性为主。且不同类型子宫内膜癌组织中CA125表达差异有统计学意义(Z=一4.717,P<0.05)。2、子宫内膜癌变过程中miR-181a与CA125表达的相关性：在子宫内膜癌变过程中,miR-181a与CA125的表达呈负相关关系(P=0.026,r=.0.25)。结论：子宫内膜癌变过程中,CA125与miR-181a的表达呈负相关,这可能与低分化、恶性程度高的子宫内膜癌中CA125表达减弱的现象有关。全文结论：miR-181a在Ⅰ型和Ⅱ型子宫内膜癌间的表达差异可能与不同类型内膜癌的发生、发展相关。miR-181a可能参与了子宫内膜癌的发生发展,尤其是Ⅱ型内膜癌,起到了癌基因的作用。其机制可能是miR-181a通过调控CA125的表达而影响子宫内膜癌变,但具体作用机制尚需细胞水平实验的验证。
张雷英[9]2012年在《子宫内膜癌中EGFR、NF-KB蛋白表达及EGFR基因突变的研究》文中认为研究背景与目的：子宫内膜癌是女性生殖系统最常见的恶性肿瘤之一，尽管目前针对子宫内膜癌的治疗方法和技术不断发展，但对晚期和复发的子宫内膜癌治疗仍为棘手。表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）是一种跨膜受体型酪氨酸激酶，其介导的信号转导通路参与多种肿瘤的发生发展，研究表明[1]，其在子宫内膜癌中有过表达，并且与子宫内膜癌的发生、发展、侵袭等密切相关，是目前研究较多的抗肿瘤药物治疗的新靶点之一，EGFR酪氨酸激酶抑制剂能增强EGFR阳性表达肿瘤细胞的放疗敏感性,且在非小细胞肺癌中酪氨酸激酶抑制剂治疗敏感人群中EGFR突变率较高，其EGFR突变与酪氨酸激酶抑制剂治疗效果具有较密切的相关性，因此在子宫内膜癌中EGFR基因是否存在突变，突变与蛋白表达是否相关，是我们探讨的重点，明确这些关系，对于子宫内膜癌的治疗具有重要意义。NF-kB是最重要的核转录因子之一，参与多种基因调控、机体免疫应答和细胞凋亡的信号传导过程，p50、p65是其中分布最广泛的异源二聚体。研究显示EGFR与NF-kB在鼻咽癌、食管癌等多种肿瘤中表达，并且呈正相关关系[2]，两者在肿瘤的发生发展以及浸润等过程中起着重要的作用，而目前在子宫内膜癌中二者之间的关系国内外尚无研究报道，是否EGFR与NF-kB在子宫内膜癌中同样起着协同作用我们尚且不知，因此研究清楚EGFR与NF-kB在子宫内膜癌中二者之间的关系，对于此类疾病的诊断以及预后评估具有重要的意义。研究内容和方法：1.取江西省肿瘤医院及南昌大学第二附属医院子宫内膜石蜡包埋组织104例，其中正常增生期内膜30例，非典型增生子宫内膜18例，子宫内膜癌56例，采用免疫组化法检测EGFR、NF-kB在各组组织中的表达情况。结果采用x2检验或Fisher确切概率法等相关统计方法进行统计，并结合临床病理资料进行分析。2.取上述56例肿瘤腊块组织、19例子宫内膜癌病人新鲜手术标本为实验组，以同期因阴道出血诊刮的正常增生期宫内膜新鲜组织30例为对照组，提取基因组DNA,应用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction; PCR)分别特异扩增酪氨酸激酶编码区的外显子19、21，纯化后双向测序，所得结果与正常基因序列进行比对分析。结果：1.从正常增生期子宫内膜、非典型增生子宫内膜到子宫内膜癌组织EGFR的表达逐渐增强，阳性表达率分别为30.0%、44.4%、73.2%，差异显著（p＜0.05）.其中EGFR在FIGO分期各组中阳性表达率为I期63.0%、 II期79.0%、III期90.0%，三者之间的差异无统计学意义(p=0.141);在不同组织学分级各组中阳性表达率为G166.7%、G274.1%、G381.8%,差异明显有统计学意义（p＜0.05）；在肌层浸润≤1/2组及肌层浸润＞1/2两组中阳性表达率为44.4%、86.8%，差异有统计学意义（p＜0.05）；在有无淋巴结转移的两组中阳性表达率为69.6%、90.0%，差异无统计学意义（p=0.055）。2.从正常增生期子宫内膜、非典型增生子宫内膜到子宫内膜癌组织NF-kB的表达逐渐增强，阳性表达率分别为13.3%、38.9%、64.2%，差异显著（p＜0.05）.其中NF-kB在FIGO分期各组中阳性表达率为I期66.7.0%、II期63.2%、III期60.0%，三者之间的差异无统计学意义(p=0.962);在不同组织学分级各组中阳性表达率为G155.6%、G263.0%、G381.8%,差异明显有统计学意义（p＜0.05）；在肌层浸润≤1/2组及肌层浸润＞1/2两组中阳性表达率为44.4%、73.7%，差异有统计学意义（p＜0.05）；在有无淋巴结转移的两组中阳性表达率为60.9%、80.0%，差异无统计学意义（p=0.073）。3.经对本实验的子宫内膜组织提取的DNA扩增纯化后双向测序得出，一例子宫内膜癌组织提取的DNA中，其编码EGFR酪氨酸激酶区的第19外显子有突变(G2281A)，21外显子无突变；其余样本中未见突变。结论：1.子宫内膜癌组织分化越差，肌层浸润越深，EGFR及NF-kB蛋白的阳性表达率及表达强度越高，二者的阳性表达与肿瘤的组织学分级及肌层浸润深度有关，与临床分期及淋巴转移无关；2.子宫内膜癌组织中EGFR与NF-kB两蛋白的表达呈正相关；3.在子宫内膜癌组中发现一例EGFR基因第19外显子点突变（G2281A）。
何荣荣[10]2009年在《Ang-2靶向siRNA联合青蒿琥酯抑制人子宫内膜癌细胞生长及侵袭的实验研究》文中进行了进一步梳理目的:观察靶向Ang-2的RNA干扰、青蒿琥酯(Artesunate,Art)及二者协同作用对人子宫内膜癌Ishikawa细胞生长及侵袭的影响。方法:实验分为空白对照组、阴性对照组、pCMV-Ang-2组、Art组及协同组。构建靶向抑制Ang-2基因及阴性对照的shRNA重组载体,脂质体Lipofectamine~(TM)2000转染Ishikawa细胞,观察细胞内干扰效应。MTT法检测各组Ishikawa细胞增殖的变化;荧光显微镜观察细胞形态学改变;FCM检测细胞周期及凋亡;RT-PCR及Western印迹法检测Ang-2 mRNA及蛋白表达;Transwell法检测细胞侵袭能力的变化。结果:(1)构建的pRNAT-CMV3.2-Neo-Ang-2(pCMV-Ang-2)及pRNAT-CMV3.2-Neo-neg(pCMV-neg)(阴性对照)重组载体成功转染Ishikawa细胞。RT-PCR检测pCMV-Ang-2组Ang-2 mRNA表达下降;阴性对照组无明显改变。(2)pCMV-Ang-2、Art及协同组对Ishikawa细胞增殖均有抑制作用,协同组优于前两组(P＜0.05),同时抑制作用呈时间依赖性,72h抑制作用最强。(3)pCMV-Ang-2、Art及协同组均能诱导Ishikawa细胞凋亡,协同组优于前两组(P＜0.05),荧光显微镜下观察到细胞形态改变,甚至形成凋亡小体;对照组凋亡率均维持在相对较低水平。(4)pCMV-Ang-2、Art及协同组均能诱导Ishikawa细胞分化,pCMV-Ang-2组及协同组G1期细胞比例增多,S期减少,而Art组S期细胞数目减少,G2期比例增多。(5)在细胞凋亡增加和逐渐被分化的同时,pCMV-Ang-2、Art及协同组均使Ishikawa细胞Ang-2 mRNA及蛋白表达水平显著降低,协同组优于前两组(P＜0.05)。(6)pCMV-Ang-2、Art及协同组均使Ishikawa细胞侵袭能力明显下降。结论:细胞经pCMV-Ang-2、Art及协同组三组干预后,Ang-2表达发生改变,细胞侵袭能力明显被抑制,同时,细胞增殖受到抑制,细胞周期发生不同改变,诱导细胞凋亡。提示Ang-2基因不仅与子宫内膜癌的侵袭转移有关,还可能通过其它方式起到诱导Ishikawa细胞的凋亡和分化的作用。青蒿琥酯及靶向Ang-2的RNA干扰均可能为临床治疗子宫内膜癌的有效方式之一,而协同组明显优于前两组为中西医结合治疗肿瘤提供了新的思路。
参考文献：
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[9]. 子宫内膜癌中EGFR、NF-KB蛋白表达及EGFR基因突变的研究[D]. 张雷英. 南昌大学. 2012
[10]. Ang-2靶向siRNA联合青蒿琥酯抑制人子宫内膜癌细胞生长及侵袭的实验研究[D]. 何荣荣. 南京中医药大学. 2009
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