叶玲玲[1]2004年在《一种高通量定量检测细胞凋亡方法的建立和初步应用》文中提出动物细胞大规模培养技术是目前生物技术制药产业广泛采用的技术平台，细胞凋亡的发生是培养中限制产量和增加成本的主要环节，预防并控制凋亡也因此成为研究的热点。进行凋亡控制的重要前提是对其进行早期检测。本研究以杂交瘤细胞G7为研究对象，用DNA交联染料YO-PRO-1(简称YP)联合PI对细胞进行染色，活细胞、凋亡细胞和坏死细胞因膜通透性的差异而着染为不同的颜色，从而将叁者区分开来。分别借助荧光显微镜和流式细胞仪检测YP／PI染色的细胞凋亡情况，将其检测结果与公认较为准确的AV／PI流式细胞仪方法进行比较，表明前两者与后者有显着的相关性，并且没有显着差异，因此可以用YP／PI染色的方法代替AV／PI流式法检测细胞凋亡。在此基础上，证实了经染色的细胞YP／PI荧光强度与凋亡／坏死细胞数具有显着的相关性，因而可以通过检测YP／PI荧光强度定量凋亡／坏死细胞数。本研究优化了荧光分光光度计检测所需的各种条件，在96孔细胞培养板中，使用3μMYP，4μg／ml PI，于37℃孵育8min，用Ex／Em为485／538和530／590两组滤光片分别检测YP和PI的荧光强度。结合细胞密度的计数结果(细胞计数板、MTT比色法等)，建立了用YP、PI荧光强度值计算细胞凋亡和坏死百分数的方法。实验证明，该方法可检测出样品中少至100个的凋亡细胞，具有很高的灵敏度；检测在96孔板中即可进行，操作简便，快速省时，因而适于高通量应用。将该方法应用于寻找培养体系中的诱导细胞凋亡的主要因素和筛选有效的抗凋亡药物方面，结果证明培养体系中葡萄糖、胱氨酸、谷氨酰胺等营养成分的缺乏，pH降低等因素能够诱导G7细胞发生凋亡。通过筛选几种化学药物，证实了在无gln和无葡萄糖两种情况下，caspases抑制剂Z-VAD-FMK均能够有效的抑制细胞凋亡的发生，是一种有应用前景的抗凋亡药物。用低剂量的Staurosporine处理半贴壁培养、呈球形的G7细胞，在不明显影响细胞活力的条件下，可引起细胞发生伸展变形，成为类似成纤维细胞的形状。检测了该现象所伴随的细胞生长代谢及细胞周期分布的变化，但其具体机理仍有待进一步阐明。
田文洪[2]2013年在《高通量活细胞microRNAs活性谱检测方法的建立及其应用研究》文中认为microRNAs（miRNAs）是人和动物体内的单链非编码小RNA。在体内，miRNA与AGO等蛋白形成miRISC（miRNA associated RNA induced silencing complex），识别并结合mRNA中靶序列，通过降低mRNA稳定性和抑制mRNA翻译负调节基因的表达，在多种生理和病理过程中发挥重要作用。研究miRNA的表达、功能及相应的调节机制具有重要的意义。高通量的miRNA检测方法是miRNA功能研究的基础。目前已建立qRT-PCR、miRNA microarray和RNA测序等多种高通量miRNA表达谱检测方法。然而，miRNA活性更直接体现miRNA功能，不仅与miRNA表达关系密切，还受到细胞中蛋白因子、miRNA定位和miRNA靶序列数量等因素影响。建立简单方便的高通量miRNA活性谱检测方法十分必要。miRNA活性检测传感器的设计及规模化制备和高通量基因转导技术是建立高通量miRNA活性谱检测方法的关键。本论文突破这些关键技术，首先建立一种简单方便的高通量活细胞miRNA活性谱检测方法miRNAAsensor arra（yadeno-associated virus (AAV) vectorbased miRNA sensor array）；然后将miRNAAsensor array技术应用于细胞miRNA活性谱特征性分析，病毒癌基因对细胞miRNA活性影响研究，细胞分化过程中miRNA活性谱变化监测和BHK21细胞中特征性高活性miRNA的发现；最后，建立一种体内miRNA活性检测方法，用于研究特征性miRNA在活体小鼠肝脏内的活性。为了建立一种高通量的miRNA活性检测技术，我们首先构建了115种miRNA活性检测AAV载体质粒传感器miRNA Dsensor。miRNA Dsensor携带分泌型荧光素酶Gluc基因和萤火虫荧光素酶Fluc基因两个独立的表达框。Gluc基因表达框的3′端非翻译区（3′-untranslated region，3′UTR）中包含单个的完全互补的miRNA靶序列，用于感知细胞中miRNA活性；Fluc基因表达框不受miRNA调控，用于校正不同miRNA Dsensor的转导效率差异。选择了55种miRNA Dsensor，用转染方法分别导入HEK293细胞中，通过测定细胞上清中Gluc活性及细胞裂解液中Fluc活性，经过计算获得每种miRNA的相对抑制活性，绘制成活性谱。结果显示miRNADsensor能够有效地检测HEK293细胞中miRNA活性，表明了miRNADsensor设计的合理性和功能的有效性。然而质粒转染方法在应用时操作比较繁琐且不利于质量控制。为了更便捷和高效地转导细胞，我们采用了AAV病毒载体。将每种miRNADsensor分别制备成相应的重组AAV2病毒，即miRNAAsensors。将多种miRNAAsensors有序地包被于96孔细胞培养板上，获得可高通量检测miRNA活性谱的miRNA Asensor阵列（miRNA Asensor array）。应用时，将待检测的细胞等量加入miRNAAsensor array板中，包被其上的AAV病毒“反向感染”细胞，将传感器带入细胞中而表达报告基因，测定报告基因表达，推算获得检测miRNA活性谱。接下来分析了细胞数量和取样时间对miRNA活性检测结果的影响。结果表明，细胞数量的适宜范围为3125-25000/孔；取样时间的适宜范围为36-60h。为了排除不同传感器因AAV病毒载体转导效率的差异对miRNAAsensor array方法测定miRNA活性的影响，我们选用对于AAV2载体体外感染十分敏感的BHK21细胞来测定转导系数。首先，用不携带miRNA靶序列的空白传感器（Control Asensor）感染BHK21细胞，获得不受miRNA活性抑制时Gluc和Fluc表达活性关系。将ControlAsensor的转导效率定义为1个转导系数（transductioncoefficient，TC）单位，那么miRNAAsensor的TC值为其不受miRNA抑制时Gluc表达活性和Control Asensor的Gluc表达活性的比值。根据Gluc和Fluc关系，miRNA Asensor的TC值计算为miRNA Asensor和Control Asensor的Fluc比值的1.32次方。依据miRNA抑制基因表达的原理，考虑到不同miRNAAsensor之间转导效率差异，miRNA活性表示为ControlAsensor和miRNAAsensor的Gluc活性的比值与miRNAAsensor的TC值的乘积，即相对抑制倍数（relative inhibiting fold， RIF）。以HEK293细胞为例，比较分析了细胞中miRNA活性和表达水平关系，发现miRNAAsensorarray能够有效地检测细胞中非家族性miRNA活性。建立了miRNA Asensor array分析方法后，我们尝试了用该方法进行高通量的miRNA活性测定。制备了一套含有115种miRNA传感器的miRNA Asensor array，分别检测了9种细胞的miRNA活性谱。每种细胞在48h内得出结果，9种细胞检测可同步进行，迅速比较出不同miRNA在细胞中的活性差异以及同一种miRNA在不同细胞株之间的活性差异，表明了所建方法的高效和便捷。我们发现不同细胞的miRNA总活性存在明显差异，肿瘤来源细胞（K562、U937、HepG2和Huh7/CD81）miRNA总活性明显低于正常组织来源细胞（BJ和C2C12）。组织特异性表达miRNA（miR-122，miR-194，miR-142-3p和miR-142-5p）在各自相应组织来源细胞（HepG2、Huh7/CD81、U937和K562）中特异性高活性。对肿瘤具有抑制作用的miRNA（let-7a，miR-31，miR-199a-3p和miR-143）在正常组织来源细胞（BJ和C2C12）中活性明显高于肿瘤来源细胞（HepG2、Huh7/CD81、U937和K562）。对肿瘤具有促进作用的miRNA在不同来源细胞间活性规律存在差异，miR-17-5p在肿瘤来源细胞（HepG2、Huh7/CD81、HeLaS3、U937和K562）中明显高于正常组织来源细胞（BJ、C2C12和BEAS-2B）；miR-221/222在正常组织来源细胞（BJ、BEAS-2B和C2C12）和某些肿瘤来源细胞（HepG2、Huh7/CD81和HeLaS3）中较高，而在U937和K562等肿瘤来源细胞中则较低。miR-21则在所有检测的9种细胞中都具有较高的活性。对肿瘤具有复杂作用的miR-26a活性则在正常组织来源细胞（BJ和BEAS-2B）和某些肿瘤来源细胞（HepG2、Huh7/CD81和HeLaS3）中都较高，而在U937和K562等肿瘤来源细胞中较低。这些结果显示miRNAAsensor array方法能够高效快速地比较和发现出不同细胞之间miRNA活性谱差异，为miRNA的功能和作用机制研究提供线索。结果还提示miRNA在肿瘤中作用的复杂性，因此从功能水平上（癌基因和抑癌基因）区分miRNA需要更多的实验证据。根据9种细胞的115种miRNA活性谱综合评价结果，我们初步选择出13种特征性的miRNA，进一步分析了9种细胞中这13种miRNA活性谱，发现不同的细胞间该13种miRNA活性谱差异明显，提示有限种类的miRNA活性谱可能作为一种生物标记，用于细胞特征鉴定。为了分析外源基因导入对于细胞内miRNA的活性影响，我们以SV40大T抗原为例，分析了其对HEK293细胞miRNA活性影响。首先扫描获得HEK293和SV40大T抗原稳定表达细胞株HEK293T的115种miRNA活性谱，发现HEK293T细胞miRNA总活性明显低于HEK293。具体分析发现，相比于HEK293细胞，HEK293T细胞中let-7家族（除let-7i外）和miR-26a活性明显下降，且差异具有统计学意义(P<0.01)，miR-17-92cluster中miR-18a和miR-20a活性则明显升高(P<0.05)，差异也具有统计学意义。而两种细胞中miR-221和miR-222活性却未见统计学差异。值得注意的是，HEK293T细胞中miR-21活性和表达水平都显着低于HEK293细胞(P<0.01)。在此基础上，构建了SV40大T抗原的表达载体pSV40LT，Westernblot检测结果表明pSV40LT能够有效地表达SV40大T抗原。分析比较了HEK293细胞转染pSV40LT载体前后miRNA活性变化。结果发现，转染pSV40LT后，HEK293细胞中115种miRNA总活性也明显下降。具体地，相比于HEK293细胞，转染pSV40LT后HEK293细胞let-7家族（除let-7i外）和miR-26a活性下降，且差异具有统计学意义(P<0.05)，miR-21活性也有下降，但差异不具有统计学意义；miR-17-92cluster和miR-221/222却未见明显差异。结果表明，SV40大T抗原能够影响HEK293细胞中miRNA活性，为从miRNA水平上揭示SV40大T抗原的致癌机制提供了新的线索。我们以TPA（phorbol12-myristate13-acetatefor）诱导K562细胞分化为例，应用miRNAAsensor array技术监测诱导分化前后细胞miRNA活性谱的变化。首先，观察发现TPA诱导K562细胞24h后，K562细胞形态特征发生明显变化。miRNA活性谱扫描发现诱导48h后，K562细胞115种miRNA总活性明显升高。具体分析发现，10种miRNA（miR-221，miR-222，miR-34a，miR-21，let-7a，let-7b，let-7c，let-7e，let-7f和miR-146a）活性明显升高，3种miRNA（miR-106a，miR-144和miR-32）活性显着下降。结果显示miRNAAsensorarray技术有效地监测了TPA诱导K562细胞分化过程中miRNA活性变化，为细胞生理过程中的miRNA活性变化研究提供了新的选择工具。比较了叁种肾来源的细胞BHK21、HEK293和Vero的58种miRNA活性谱，发现BHK21细胞中miR-206特征性高活性。具体地，miRNA序列保守性分析找出58种在BHK21细胞中可能表达miRNA序列，制备相应的miRNAAsensor array。扫描获得BHK21、HEK293和Vero等叁种肾脏来源细胞58种miRNA活性谱，特征性发现BHK21细胞中miR-206高活性。以HEK293细胞为阴性对照，小鼠成肌细胞C2C12为阳性对照，证明了BHK21细胞中miR-206高活性和高表达，验证了发现结果。马血清（HS）诱导培养BHK21细胞后，细胞形态发生变化，WB检测到骨骼肌球蛋白重链(MHC)表达，表明BHK21细胞呈肌细胞分化。诱导培养后，BHK21细胞中miR-206活性和表达水平明显上升。探索发现miR-206可能通过下调连接蛋白43（Cx43）参与BHK21细胞诱导分化过程。结果提示，miR-206可以作为一种鉴别BHK21细胞的特征性生物标记之一。最后，我们还建立了一种小鼠体内miRNA活性检测方法，测定了小鼠正常肝脏中miR-21活性。首先以空白对照Control Psensor为基础，构建了miR-21、miR-122和miR-206叁种体内miRNA活性检测质粒型传感器miRNAPsensor。其中miR-122和miR-206Psensor分别用作miR-21活性检测的阳性和阴性对照。用水动力法将Control Psensor和3种miRNAPsensor分别注射至不同小鼠体内，测定报告基因表达，计算获得miRNA活性。结果发现，小鼠肝脏中miR-21和miR-122活性较高，且miR-21明显高于miR-122，而未检测到miR-206活性。qRT-PCR结果发现小鼠肝脏中miR-21表达水平低于miR-122。本研究首次发现小鼠正常肝脏中miR-21活性明显高于miR-122，而表达水平却低于miR-122，提示miR-21可能在小鼠肝脏的正常生理活动中发挥重要作用。总之，本论文成功建立了一种高通量的活细胞miRNA活性谱检测方法miRNAAsensorarray。应用该方法分析获得了多种细胞特征性miRNA活性谱，表明miRNA活性谱具有成为一种生物标记用于细胞鉴定的潜力。miRNAAsensor array作为一种方便有效的研究工具，还可用于外界因素对细胞miRNA活性影响、细胞生理过程中miRNA活性监测和细胞特征性高活性miRNA的发现等研究。在体外检测miRNA活性方法的基础上，我们进一步创建了一种活体小鼠肝脏中miRNA活性检测方法，用于miRNA Asensor array发现特征性miRNA的体内活性研究。应用该方法，首次发现小鼠正常肝脏中oncomir miR-21高活性，提示miR-21体内功能的多样性。
赵志威[3]2017年在《胃癌基因差异表达谱的构建及长链非编码RNA TCONS_00068220功能的初步验证》文中认为胃癌作为一种上皮源性恶性肿瘤,是世界上高死亡率的疾病之一,发病率在恶性肿瘤中排第四位,致死率位居第二,严重威胁到人类健康。胃癌患者早诊早治后5年生存率可达90%,但由于早期症状不明显,而且缺乏准确的分子标志物,绝大多数胃癌患者就诊时已到晚期。目前,胃癌的治疗方法主要包括手术治疗、化学药物治疗和放射治疗等,虽然取得了一定成效,但对预后的改善仍差强人意,患者5年生存率不足25%。深入研究胃癌发生发展的分子发生机制,探索新型的、有效的早期诊断分子标志物及靶向治疗位点,提升治疗效果,一直是胃癌基础领域研究的热点。在高通量技术出现以前,对于肿瘤的研究仅仅局限于单个基因或者少量基因,这样无法从一个整体层面揭示肿瘤形成与发展的分子机制。随着人类基因组计划的完成以及生物信息技术的快速发展,基因组、转录组等组学研究也应运而生,人类生命科学研究进入了“后基因组”时代。在此期间,以基因芯片、新一代测序技术等为代表的高通量技术也日益成熟,为我们提供了大量的、可供研究的“全景式”组学数据,开启了基因研究的“大数据”时代。转录组测序(RNA-sequencing,RNA-seq)是最近发展起来的利用深度测序技术进行转录组分析的技术,该技术能在全基因组范围内以单碱基分辨率检测和量化转录片段,还能发现未知转录本和稀有转录本,精确地识别可变剪切位点以及编码序列的单核苷酸多态性,提供更为全面的转录组信息,正成为研究基因表达和转录组的重要实验手段。以往的研究认为,癌症是一种基因源性疾病,基因本身的变化导致细胞癌变,但是近期研究发现基因表观遗传水平的异常同样影响着肿瘤的发生发展。所谓表观遗传就是不基于DNA差异的核酸遗传,即细胞分裂过程中,DNA序列不变的前提下,全基因组的基因表达调控所决定的表型遗传,主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、基因组印记以及非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)调节等。微小RNA(microRNA,miRNA)和长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是研究最多的两种具有调节功能的RNA。其中lncRNA是一类转录本长度超过200个核苷酸(nucleotide,nt)的RNA,位于细胞核内或胞浆中,不参与或很少参与编码蛋白质,主要以RNA的形式在表观遗传、转录及转录后等多个水平参与对靶基因的调控,从而发挥重要的生物学功能。研究发现,lncRNA在许多恶性肿瘤中表达异常,可以用来作为肿瘤早期筛查的生物学标志物或是作为患者对化疗敏感性的检测指标,针对致癌或抑癌lncRNA进行人为干预,可以用于制定针对恶性肿瘤的新型靶向治疗方案,因此lncRNA具有良好的肿瘤诊断和治疗前景。在本研究的第一部分,从基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)中下载了系列号为GSE41476的3组胃癌和2组正常胃组织RNA-seq数据。利用第二代测序数据预处理软件NGSQC进行数据预处理,将获得的高质量RNA-seq数据通过Tophat2软件比对到人类基因组GRCh37/hg19上。利用Cufflinks软件对各个样本的读段定位结果进行转录组组装,根据Cuffmerge软件将5组数据的组装结果整合。依据比较基因组学的原理和方法,通过PholyCSF及HMMER软件,识别和筛选出预测的基因间lncRNA转录本。针对Tophat2比对结果,结合RefSeq注释文件、lncRNA注释文件以及预测的lncRNA转录本文件,利用Cuffdiff软件筛选差异表达基因和lncRNA。结果,预测了86个lncRNA转录本,其中有37个和已知lncRNA有高于50%的位置重迭。在胃癌基因差异表达谱的构建过程中,共发现了1,088个上调转录本(其中16个已知lncRNA、1个预测lncRNA、1071个mRNA),1,537个下调转录本(其中18个已知lncRNA、4个预测lncRNA、1,515个mRNA)。在本研究的第二部分,使用DAVID(the Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)在线工具对差异表达的基因进行基因本体(Gene Ontology,GO)功能富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路(pathway)富集分析,其中GO富集分析主要关注生物学过程(Biological Process,BP)。根据STRING(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins)在线筛选了差异表达基因所编码蛋白质的互作(Protein-Protein Interaction,PPI)网络,利用Cytoscape软件进行网络展示,再利用CFinder软件进行模块分析,然后对每个子模块进行GO和KEGG pathway富集分析。为了对差异表达lncRNA的功能作初步分析,根据筛选的差异表达lncRNA和差异表达基因的表达矩阵,计算它们之间的表达相关性,之后对每个lncRNA的共表达基因(Pearson相关系数>0.99)进行KEGG pathway富集分析。结果发现,差异表达的基因在Cell adhesion molecules(CAMs,细胞粘附分子),Extracellular matrix(细胞外基质,ECM),ECM organization(细胞外基质组织),ECM-receptor interaction(细胞外基质受体相互作用),Focal adhesion(粘着斑),Protein binding(蛋白粘附)等癌症相关通路中富集。PPI子模块中的基因在ECM-receptor interaction,Focal adhesion,T-cell receptor signaling pathway(T细胞受体信号通路),Antigen processing and presentation(抗原加工和提呈),Neuroactive ligand-receptor interaction(神经活性的配体-受体相互作用),Cytokine-mediated signaling pathway(细胞因子介导的信号通路),Ribosome biogenesis in eukaryotes(真核细胞核糖体生成)等癌症相关通路富集。对lncRNA进行功能分析发现,lnc-IFT20-3:1和lnc-FAM46C-1:1的共表达基因在Non-small cell lung cancer(非小细胞肺癌),Cell adhesion molecules等癌症相关通路中富集。TCONS_00068220的共表达基因在Cell adhesion molecules,Cytokine-mediated signaling pathway,Bladder cancer(膀胱癌),Natural killer cell mediated cytotoxicity(自然杀伤性细胞介导的细胞毒作用)等癌症相关通路中富集。在本研究第叁部分,挑选lncRNA TCONS_00068220,对其进行组织和细胞学功能的初步验证。首先,利用荧光实时定量PCR分别检测了15例临床胃癌和对应癌旁组织样本、胃黏膜正常上皮细胞系GES-1以及胃癌细胞系(MKN-45,SNU-484,NCI-N87)中TCONS_00068220的表达量。其次,为了研究TCONS_00068220对胃癌细胞增殖及凋亡能力的影响,分别用真核细胞表达质粒和小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)构建胃癌细胞系NCI-N87的TCONS_00068220过表达及低表达模型。用流式细胞仪分别检测过表达和降低表达TCONS_00068220后,胃癌NCI-N87细胞的周期及凋亡变化情况。最后,对低表达TCONS_00068220的NCI-N87细胞进行台盼蓝及DAPI染色实验。经Western Blot实验检测降低TCONS_00068220表达后,NCI-N87细胞活化型半胱天冬酶3(cleaved caspase-3)蛋白的表达变化情况。结果发现,无论在胃癌组织还是胃癌细胞系中,相对于正常对照样本TCONS_00068220均呈现一种高表达状态。降低胃癌NCI-N87细胞中TCONS_00068220的表达后,cleaved caspase-3蛋白的表达水平升高,细胞凋亡率明显增加。综上所述,胃癌的发生与发展是一个多因素、多基因参与,多阶段形成的复杂渐进的过程。通过高通量技术和生物信息学方法,在整体层面对胃癌相关基因进行多层次多角度分析,为进一步了解胃癌的发生机制奠定理论基础,同时也为将来胃癌的分子诊断、靶向治疗提供新的思路和视角。
葛芹玉[4]2006年在《胎儿核酸检测分析方法的研究》文中认为产前诊断一直人类遗传学领域的研究重点,目前临床上常用的诊断方法主要有羊水穿刺和绒毛膜诊断等,这些方法对产妇和胎儿均有较大的危害,而且操作相对繁琐。近年来胎儿DNA的发现为这一问题的解决提供了可能,使得无创性产前诊断不再是梦想。随后的研究证实胎儿RNA也存在于孕妇的外周血液中,这为该研究的进一步发展提供了新的途径。尽管无创性产前诊断在近年来取得了较大的进展,但仍然与临床实际应用存在着很大的差距,特别是在胎儿核酸的高灵敏度和高通量检测方面。为此,我们以不同怀孕时期的孕妇外周血液为研究对象,结合基因芯片技术,发展了胎儿DNA和RNA的高通量检测技术并且应用于胎儿相关基因的检测分析中。本论文的主要研究内容有:胎儿核酸分离纯化方法的研究;胎儿DNA的扩增检测方法的研究;胎儿RNA定量检测分析方法的研究;孕妇血浆DNA甲基化的初步研究。具体内容如下:1.孕妇血浆核酸提取方法的研究我们以现有的核酸提取分离方法为基础,结合孕妇外周血液中胎儿核酸的特性,发展了改良的胎儿核酸提取纯化方法。我们首先利用甲醛溶液来处理孕妇的外周血液,在新鲜的孕妇血液中加入1%的甲醛溶液,处理30分钟后,离心分离孕妇血浆,然后用常规的树脂吸附法提取血浆DNA,以Y染色体特异性序列作为男性胎儿DNA的标志物,定量检测胎儿DNA的浓度。结果发现采用甲醛处理的实验组提取获得的胎儿DNA占血浆总DNA的比例有了较大的提高。我们还改良了RNA的提取方法,结果发现利用改良的“Trizol”提取法获得的胎儿RNA浓度比普通方法有了较大的提高。这些胎儿核酸的分离纯化方法为无创性产前诊断方法的发展打下了基础。2.微乳液多重PCR技术聚合酶链式反应(PCR)主要用于DNA片断的扩增分析,是生物医学领域一项重要的核酸分析技术。尽管如此,PCR在检测灵敏度、特异性方面仍存在一些问题,多重PCR扩增也因引物等成分之间的干扰而受到了较大的限制。微乳液(油包水)是一种水相均匀的分散到油相中形成的稳定均一的分散系,近年来有人利用微乳液的特殊的结构进行生物化学反应获得了一定的成功。我们通过优化微乳液制备方法和PCR反应体系,成功地在微乳液中进行了PCR扩增。实验结果表明,微乳液体系中的微小液滴结构不但能够提高PCR扩增的效率,而且能够有效的降低多重PCR体系中各个成分特别是引物之间的干扰,从而使多重PCR能够更加有效的进行。我们利用该技术进行了Y染色体微缺失的检测,在不育的男性样品和怀有男性胎儿的孕妇外周血液中我们均检测到了微缺失位点的存在。结果显示微乳液多重PCR技术不但具有很高的灵敏度和特异性,而且能够用于相关疾病的分析检测,可以检测孕妇外周血液中胎儿DNA用于无创性产前诊断,大大推动了产前诊断技术的进一步发展。
冯同富[5]2008年在《卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白与基因的筛选鉴定研究》文中研究指明卵巢上皮癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。临床上,以铂类为基础的联合化疗是其最重要和最主要的治疗方法。尽管在化疗的最初阶段,卵巢上皮癌对抗癌药物表现出较好的敏感性,但是随着化疗的进行其逐渐获得多药耐药性,因而其五年生存率一直徘徊在30—50%。为了更好的认识卵巢癌的多药耐药机制,我们用卡铂对卵巢浆液性囊腺癌细胞SKOV3进行间断、大剂量冲击,建立了卵巢癌耐药细胞株SKOV3/CB,并且从蛋白和基因两个水平筛选、鉴定了两种细胞间的差异分子。第一部分:卵巢上皮癌铂类耐药细胞株相关生物学指标的检测验证研究目的:对铂类耐药细胞株SKOV3/CB进行相关生物学指标的检测验证。方法:MTT法检测SKOV3/CB对卡铂的耐药指数及对CTX、5-FU、ADM、VP-16、泰素和DDP的交叉耐药性;采用21天细胞计数法绘制细胞的生长曲线并计算其倍增时间;流式细胞术检测细胞的凋亡率和周期分布。结果:SKOV3/CB对卡铂的RI为3.09,对CTX、VP-16、泰素和DDP有不同程度的耐药性,但对5-FU和ADM仍然敏感;同SKOV3相比其凋亡率和S期细胞明显增加,但生长速度却显着降低。结论:SKOV3/CB表现出典型的多药耐药特征,该耐药模型十分稳定达到了后续的蛋白和基因实验的实验要求。第二部分:卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达蛋白筛选鉴定研究研究目的:比较卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间的蛋白表达差异,并进行相关蛋白的筛选和鉴定。方法:提取卵巢癌耐卡铂细胞SKOV3/CB和亲本细胞SKOV3的总蛋白,用蛋白二维液相分离色谱技术(ProtemeLab~(TM)PF-2D)总蛋白进行分级分离,然后用其自带的Proteovue和Deltavue分析软件进行两种细胞间差异蛋白的筛选;用电喷雾离子化串联质谱(ESI-MS/MS)结合数据库比对进行差异蛋白的鉴定。结果:共分离筛选出差异蛋白54个,其中SKOV3/CB表达上调的34个,SKOV3表达上调的20个。鉴定出SKOV3/CB比SKOV3表达上调的差异蛋白15个,即人假想镁离子转运体(humanputative magnesium transporter protein,HPT)、人亮氨酸拉链样蛋白(Leucinezipper-like protein)、超氧化物歧化酶-1(Superoxide dismutase,SOD-1)、硫氧还原蛋白(Thioredoxin,Trx)、Immunoglobulin heavy chain variable region、SMYD2、周期蛋白依赖激酶6抑制因子(cyclin-dependent kinase 6 inhibitor)、MYL9(Myosinregulatory light polypeptide 9)、垂体腺苷酸环化酶促多肽(pituitary adenylatecyclase-activating polypeptide,PACAP)、stanniocalcin homolog、G蛋白信号通路的调节因子(human regulator of G-protein signalling,RGS)、T cell receptor betachain、TADAl protein和AX887247 NID。这些蛋白涉及离子转运、信号转导、氧化还原、增殖分化、免疫、甲基化、周期和凋亡调控等多方面。结论:PF-2D结合ESI-MS/MS是一种进行能够差异蛋白筛选、鉴定的有效方法。鉴定出的蛋白通过多种复杂机制介导了卵巢癌对铂类的耐药性的产生,这些蛋白有可能成为疗效预测分子或新的治疗靶标。第叁部分:卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间差异表达基因筛选鉴定研究研究目的:比较卵巢上皮癌耐铂类和非耐铂类细胞间的基因表达差异,并进行相关基因的筛选和鉴定。方法:采用人类全基因组表达谱芯片对卵巢癌耐卡铂细胞SKOV3/CB和亲本细胞SKOV3进行差异基因的筛选和分析;用半定量逆转录聚合酶联反应(RT-PCR)对芯片结果进行核对验证。结果:共分离筛选出差异基因3506个,SKOV3/CB比SKOV3上调的差异基因共有1712个,其中上调10倍以上的共有163个,SKOV3比SKOV3/CB上调的差异基因共有1794个,其中上调10倍以上的共有70个。SKOV3/CB比SKOV3上调10倍以上的6个差异基因,即ANXA6、UGDH、ZNF198、ERCC5、TWIST2和BIRC3经半定量RT-PCR验证,表明上述6个基因在耐药细胞株中的表达的确高于敏感细胞株,证明基因芯片的结果是可信的。结论:基因芯片是分析肿瘤差异基因的一种高通量的强有力工具。卵巢癌的多药耐药是一个多种基因参与的复杂过程。
闫慧娟[6]2014年在《高生物适应性双光子荧光纳米探针的构建及生物医学成像应用》文中提出近年来，双光子荧光共聚焦显微成像技术（TPM），作为一种新型的光学成像技术逐渐引起人们的极大关注与传统单光子激发荧光显微成像（OPM）相比，双光子激发（TPE）以近红外光子作为激发光源，具有组织自发荧光和自吸收低光损伤和光漂白弱空间分别率高和组织穿透深(>500m)等优点双光子（TP）探针的构建是TPE技术发展的关键到目前为止，尽管已有很多具有优良双光子吸收（TPA）特性的探针被报道和应用于生物医学成像领域，但是大部分集中在有机小分子方面，这样TPE有机探针就不可避免地存在细胞膜穿透性差抗光漂白性能低和细胞定位能力差等有机小分子的固有缺陷此外，对于生物分子检测，基于TPA有机分子探针的设计和合成仍然存在巨大挑战随着纳米技术的发展和纳米结构所具有的优良性质，如抗酶切性能载体性质循环时间可调控性高通透性和滞留（EPR）增强效应等，TPA纳米探针将为TPE成像方法的广泛应用提供一种重要的研究基础与此同时，环糊精聚合物（CDP）是以物理混配法或化学键组成的含有多个环糊精（CD）单元的高分子聚合物CDP也是近年来发展的一种生物相容性较好无生物毒性的新型载体它既保留环糊精自身的催化包结缓释和识别的能力，又在聚合过程中形成多个支点构成的空间叁维网络结构，兼具了聚合物的化学可调性和良好的机械强度等优点结合甲基丙烯酸甲酯甲基丙烯酸共聚物（PMMA-co-MAA）金纳米颗粒（AuNPs）和CDP等纳米材料所具有的独特性能，以及TPM技术优良的组织穿透性能和较高的空间分辨率本论文选择具有双光子性质的有机小分子为研究对象，构建了一系列新型高生物适应性的双光子荧光纳米探针，并将其应用在与生命活动密切相关的离子蛋白酶的定量检测及生物医学靶向成像等领域，具体开展以下几个工作：（一）构建了一种以反式-4-[对-(N,N-二乙基胺基)苯基]乙烯基-4‘-（4-N,N-二乙胺基）苯(DEAS)为双光子染料，通过共沉淀-自组装法形成的新型DEAS@PMMA-co-MAA双光子荧光纳米探针PMMA-co-MAA对染料DEAS的包裹，改善了双光子有机小分子的水溶性生物相容性以及双光子性质同时将该体系成功应用于活细胞及深层组织中的双光子成像研究（二）构建了一种以双光子有机分子（TPdye）为生物标记的荧光团AuNPs为纳米载体的新型AuNPs@CDGRG-TPdye荧光纳米探针，通过多肽序列定点切割及AuNPs溶解等设计机理，实现对深层组织中胶原蛋白酶collagenase的活性成像应用及复杂体系中CN-的定量检测（叁）发展了一种基于双光子有机分子反式-4-[对-(N,N-二乙基胺基)苯基]乙烯基-N-甲基吡啶碘(DEASPI)与CD之间的主客体相互作用的TPA DEASPI/CDP纳米胶束的构建新策略该TPA超分子纳米胶束表现出优良的双光子荧光性质较高的光学稳定性良好的细胞膜穿透性和优良的生物相容性等特点并且进一步将靶向多肽RGD交联在纳米胶束表面，成功实现在癌细胞和深层肿瘤组织中的靶向双光子成像研究应用该设计策略为未来开发各种独特传感方法并应用于癌症诊断和生物成像研究等领域开辟了新的途径（四）在上一章基础上，本章发展了一种基于TPA纳米胶束的双光子荧光纳米探针，用于活细胞和组织中高灵敏度和高选择性的细胞凋亡蛋白酶caspase-3的活性检测及成像应用基于DEASPI/βCDP纳米胶束的TPA荧光纳米交联物提供了一种高灵敏度和高选择性的探针，用于复杂生物条件下caspase-3的定量检测该纳米交联物也可以被有效地运输到活细胞中，作为一种信号增强型荧光探针用于靶生物分子的高特异性和高分辨率成像研究
王中贺[7]2018年在《液质联用测定BPs和神经递质方法的建立及应用研究》文中认为第一部分液质联用测定河水和底泥中13种BPs方法的建立及应用目的:建立一种运用液液萃取和柱前衍生化处理步骤同时测定河水和底泥中十叁种双酚结构类似物(Bisphenol structure analogues,BPs)的检测方法。方法:河水中待测分析物BPs经过液液萃取浓缩,对萃取试剂进行了优选,选择了乙酸乙酯作为最优萃取试剂;底泥中BPs用甲醇进行提取;以丹磺酰氯对浓缩后的待测物进行衍生化反应,对影响衍生化的因素进行了优化;衍生化后的产物由超高效液相色谱串联质谱(ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry,UHPLC-MS/MS)进行测定,十叁种衍生化后的BPs待测物经C18反相色谱柱洗脱和分离,流动相分别为含有0.1%甲酸的乙腈和纯水,进而经电喷雾电离源正模式(ESI+)进入质谱(Q Exactive Orbitrap),质谱平行反应监测模式(PRM scan mode)进行检测和定量。结果:方法学验证结果显示,基质匹配的标准曲线线性相关程度良好,R~2均大于0.99;河水中BPs检测方法的定量限(limits of quantitations,LOQs)范围为0.005到0.02 ng/mL,底泥定量限范围为0.15到0.80 ng/g;日内精密度和日间精密度均满足要求,相对标准偏差(RSDs)分别小于10.8%和11.6%,方法精密度结果良好。结论:本实验所建立的双酚结构类似物BPs超高效液相色谱串联质谱测定方法经方法学系统验证准确、灵敏、可靠,快速、简单,适用于河水和底泥等大批量样本中的BPs含量测定。第二部分正常人群尿液和血浆中13种BPs暴露水平的测定与分析目的:在前期所建立的超高效液相色谱串联质谱测定BPs方法的基础上,建立人群尿液和血浆基质中BPs的定量分析方法。评估正常人群的尿液和血浆样本中双酚结构类似物BPs游离态和总态的暴露水平,并分析其中的差异。方法:对所收集的49例人群尿液和血浆分别用葡萄糖醛酸酶及硫酸酯酶进行酶解,运用所建立的超高效液相色谱串联质谱的方法检测并评估尿液和血浆样本中游离态及总态的双酚结构类似物BPs暴露水平,测定尿液样本中的肌酐对目标待测物浓度进行校正。结果:尿液加标回收率在82.8%-115.3%,精密度1.3%-11.9%;血浆加标回收率81.3%-115.6,精密度1.5%-11.6%。人群样本检出率较高的待测双酚结构类似物BPs有BPA、BPS和DHBP,血浆和尿液中游离态的BPA检出率高达85.4%和87.5%,总态的BPA检出率分别为91.7%和95.8%;血浆和尿液中游离态的BPS检出率分别为75.0%和79.2%,总态的BPS检出率分别为87.5%和91.7%。尿液样本中BPS的检出浓度水平已经高于BPA,尿液中游离态和总态的BPS平均浓度分别为2.44 ng/m L和5.82 ng/m L,而尿液中游离态和总态的BPA的平均浓度分别为1.36 ng/m L和4.75 ng/m L;血浆中游离态和总态的BPS浓度分别为0.69 ng/m L和2.48 ng/m L,游离态和总态的BPA浓度分别为1.24 ng/m L和3.91ng/m L,血浆中BPA的浓度水平仍然高于BPS。结论:建立的方法回收率和精密度实验均满足测定要求,标准曲线相关系数良好。研究结果显示,所测定的人群尿液样本中,无论是游离态还是总态的形式,BPS已经成为双酚结构类似物BPs暴露中的主导类型;而血浆中占主导类型的双酚结构类似物是BPA。第叁部分帕金森与正常人群血浆中BPs及神经递质浓度水平的差异性分析目的:建立同时测定双酚结构类似物BPs和神经递质的超高效液相色谱串联质谱方法,探究帕金森疾病人群和正常人群体内BPs及神经递质浓度水平的差异性。方法:使用甲醇提取血浆生物样本中待测物并用于蛋白清除,选用丹磺酰氯作为衍生化试剂对待测物进行衍生化反应,Thermo Hypersill GOLD(2.1×100mm,1.9μm)色谱柱进行分离,含0.1%甲酸的乙腈和水作为流动相,电喷雾电离源正模式电离,质谱平行反应监测模式进行检测。使用该方法测定了帕金森疾病与正常对照人群血浆中的BPs及神经递质含量。结果:衍生化技术改善和促进了待测分析物的离子化,使得一次性快速同时测定这25种不同性质的化合物。血浆样本中BPs和神经递质的加标回收率在80.8%-109.1%之间,精密度数值在0.9%-15.6%之间。帕金森病例组人群血浆中BPF、BPS、TBBPA均高于对照组,病例组人群血浆中的5-羟吲哚乙酸、5-羟色胺以及多巴胺的浓度水平低于对照组样本,而血浆中的3-羟基犬尿氨酸、去甲肾上腺素和肾上腺素浓度水平高于正常对照组人群(P<0.05)。结论:本实验采用丹磺酰氯衍生化技术,建立了一种高通量同时测定十叁种双酚结构类似物BPs和十二种神经递质的超高效液相色谱串联质谱方法。帕金森病例和正常对照人群血浆中BPs、神经递质含量存在明显差异。
李莉[8]2011年在《蛋白质组学技术对胃癌、肝癌、卵巢癌血清差异蛋白表达的研究》文中研究指明目的：应用蛋白质组学技术研究胃癌、肝癌、卵巢癌叁种恶性肿瘤患者的血清差异蛋白表达,探寻具有潜在诊断意义的血清肿瘤标志物,以利于胃癌、肝癌、卵巢癌的诊断和防治。方法：1)收集胃癌患者20例和肝癌患者10例以及健康人20例血清样本,采用ClinProt磁珠纯化、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrum, MALDI-TOF-MS)分析及ClinProTools生物信息学方法研究其血清差异蛋白表达；2)收集卵巢癌患者、卵巢良性肿瘤卵巢子宫内膜异位囊肿患者以及健康人各10例血清样本,采用shotgun蛋白组学研究方法,进行基于标记定量iTRAQ技术和2D nano HPLC-ESI-OrbiTrap MS/MS(纳升级两维高效液相色谱-电喷雾-OrbiTrap质谱)分离检测技术研究卵巢癌血清差异蛋白表达,建立生物标记物地图,筛选重要的差异蛋白。3)在原有的第二部分研究30例血清的基础上,进一步收集卵巢癌患者血清10例,卵巢子宫内膜异位囊肿患者血清6例,健康人血清10例,共计56例临床血清标本(卵巢癌20例,卵巢子宫内膜异位囊肿16例,健康人20例),采用Western Blot方法,将蛋白质组学筛选出的重要差异蛋白进行逐例血清样本的蛋白验证。结果：1)质荷比为2863Da和4965Da的蛋白峰能较好地鉴别胃癌和正常人组。质荷比为1618Da和4965Da的蛋白峰能较好地鉴别肝癌和正常人组。同正常人相比较,胃癌和肝癌存在共同的差异蛋白峰为4965Da。2)iTRAQ标记的定量蛋白质组学对卵巢癌血清差异蛋白表达的研究数据经搜索蛋白质数据库及数据处理后,共鉴定出iTRAQ标记定量信息的蛋白326个。相比于正常组在卵巢癌组中上调在1.2倍以上的差异蛋白有9个,下调在1.5倍以上的差异蛋白有75个。相比于正常组在卵巢良性囊肿组中上调在1.2倍以上的差异蛋白有32个,下调在1.5倍以上的差异蛋白有103个。依据卵巢癌组与正常组的差异蛋白和卵巢良性囊肿与正常组的差异蛋白进行对比,得到卵巢癌组对比良性囊肿组上调在1.2倍以上的差异蛋白有77个,下调在1.5倍以上的差异蛋白有43个。其中重点筛选出了8个重要的差异蛋白,它们在蛋白谱水平上明显区分了卵巢癌组、良性卵巢囊肿组和正常对照组血清。这8个重要的差异蛋白包括,蛋白PARD3,SRP1-alpha,LAMA4,LRP16,IgSF2,NRAMP1,NF-E2-related factor 1和APOA4。3)将其中发现的叁个重要差异蛋白：APOA4蛋白、PARD3蛋白、NRAMP1蛋白,采用Western Blot技术进行逐例血清样本的蛋白验证筛查。结果APOA4蛋白逐例验证了血清56例(卵巢癌组20例,卵巢子宫内膜异位囊肿16例,健康对照20例)。在卵巢癌组表达量最低(0.7),卵巢子宫内膜异位囊肿组最高(1.2),健康对照组(1)介于其中。PARD3蛋白Western Blot结果不好,有杂带,放弃用该蛋白做临床血清逐例筛选。NRAMP1蛋白逐例验证了血清21例(卵巢癌组9例,卵巢子宫内膜异位囊肿6例,健康对照6例)。在卵巢癌组中表达量最高(1.3),卵巢子宫内膜异位囊肿组表达量最低(0.7),健康对照组(1)介于其中。结论：1)利用液体蛋白芯片-飞行时间质谱技术可从血清中筛选出胃癌、肝癌的潜在的标志蛋白,此技术对于发现和筛选血清中的胃癌、肝癌标志蛋白是一种很有前途的方法。2)利用iTRAQ标记的定量蛋白质组学技术初步筛选了卵巢癌、卵巢子宫内膜异位囊肿和正常人的血清差异蛋白,形成了可能的卵巢癌生物标记物地图。重点筛选出了8个重要的差异蛋白,可能是潜在的肿瘤标记物。其中叁个差异蛋白经过临床患者血清的验证,NRAMP1蛋白在卵巢癌、良性卵巢炎症的发生发展中具有一定重要的作用,但因其在各血清样本中波动较大,所以判断该蛋白对于区分卵巢癌组与健康对照组实际应用意义会较低。APOA4蛋白在逐例血清验证中表现稳定,在CA125升高的患者群中,APOA4蛋白有可能成为区分恶性与良性卵巢疾病的生物标志物,从而尽早筛查出部分卵巢癌患者。
赵燕[9]2014年在《猪瘟病毒QuantiGene ViewRNA原位杂交方法的建立及初步应用》文中指出猪瘟（Classical Swine Fever，CSF）是由猪瘟病毒（Classical Swine Fever Virus，CSFV）引起的猪的高度接触性、致死性传染性疾病，给养猪业造成巨大威胁和经济损失。本研究建立了CSFV QuantiGene ViewRNA原位杂交检测方法；并采用建立的CSFV QuantiGene ViewRNA原位杂交方法初步应用于CSFV RNA在体外感染细胞中的增殖动态研究和体内感染组织的CSFVRNA检测。为了高效检测和准确定位CSFV并探究CSFV RNA在体外感染细胞中的复制动态和分布规律，本研究分别设计并合成了CSFV RNA和猪内参基因β-actin的多条特异性探针，对培养于PK15细胞系中的CSFV中等致病力毒株HeBHH1/95（TCID-.550为104/200μL）进行研究。并采用正交试验方法优化反应条件，根据检测结果、荧光强度、重复性等因素，确定CSFV QuantiGeneViewRNA原位杂交反应的关键要素，蛋白酶K最优浓度为1:1000，甲醛最优固定时间为30min。在荧光共聚焦显微镜下，阳性样本可检测到明亮的红色荧光。通过与CSFV免疫组化法及CSFV单抗免疫荧光法比较，该法检测灵敏度可达10-8，分别比CSFV免疫组化法及CSFV单抗免疫荧光法高4个和3个数量级；同时，采用不同亚型CSFV毒株和猪其它相关病毒质控样本验证其特异性，能特异性与各种亚型的CSFV结合，与其他病毒无交叉反应，显示了良好的特异性。为了研究CSFV RNA在体外感染细胞中的准确定位和增殖动态规律，本研究采用中等致病力流行毒株HeBHH1/95株和HCLV分别接种体外培养细胞PK15，用上述建立的CSFV QuantiGeneViewRNA原位杂交方法分别对0.5hpi、1hpi、1.5hpi、2hpi、2.5hpi、3hpi、3.5hpi、4hpi、4.5hpi、5hpi、5.5hpi、6hpi、12hpi、18hpi、24hpi、36hpi、48hpi、72hpi、96hpi的感染细胞进行检测，荧光共聚焦显微镜下观察。结果显示，HeBHH1/95和HCLV感染PK15细胞后，随着感染时间的延长，能观察到病毒在细胞内持续增长繁殖，72hpi达到最高值，直到96hpi病毒RNA一直保持较高水平；；感染后0.5hpi，便可在细胞内检测到病毒RNA，且0.5hpi~12hpi之间，病毒RNA集中在细胞核内，18hpi以后，病毒RNA主要集中于细胞核周围的细胞质中直到96hpi；流行毒株和疫苗毒株RNA的复制规律是一致的。本研究第一次从RNA分子角度阐明了CSFV流行毒株和疫苗毒株在体外培养细胞中的增殖动态和RNA的复制规律。为了准确可视化检测体内感染细胞中的CSFV RNA，本研究采集了CSFV感染动物的扁桃体、肠道和肾脏样本制成石蜡包埋组织切片（FFPE），使用QuantiGene ViewRNA原位杂交技术对感染后各器官靶细胞中CSFV RNA进行精确检测。结果显示，在荧光显微镜下可观察到点状红色荧光信号，说明建立的CSFV QuantiGene ViewRNA原位杂交方法能准确、可视化地对石蜡包埋组织切片中CSFV RNA进行检测。该研究可为探索CSFV感染靶细胞类型的差异，分析CSFVRNA复制动态、分布变化与病程、病理损伤之间的相关性提供重要的技术平台。本研究成功建立了CSFV QuantiGene ViewRNA原位杂交检测方法，该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好和省时的优点，为CSFV准确诊断提供了一种高敏感且特异的新技术；同时为CSFV RNA在体内外靶细胞中增殖动态和RNA的复制规律研究提供重要的技术支持；还可对临床采集CSFV RNA富集样品提出指导意见。
陈明[10]2007年在《多维液相色谱质谱联用技术及其在人类肝脏蛋白质组学研究中的应用》文中提出肝脏是人体最大的实质器官之一，是人体物质代谢、能量转换及供应的中心，在人体的生命活动中占有重要地位；同时，肝脏也是常见的病原体持续感染的场所，因此，对肝脏蛋白质组的研究有助于人们对肝脏正常生理功能以及肝脏疾病机制的深入了解。本文主要是以多维液相色谱质谱联用技术为研究平台，以肝脏组织为研究对象，对蛋白质组学研究中的一些基本问题：如生物样品的分离，质谱鉴定的重现性，低丰度蛋白质的质谱检测，鉴定结果的可信度以及质谱数据的充分挖掘与利用等方面作系统的研究，为进一步的规模化蛋白质学研究提供参考。蛋白质组学的基本目标是尽可能的鉴定到生物体所表达的全套蛋白质，随着质谱技术的发展和完善，高通量地分析生物体的蛋白质组成已经成为可能。但是生物样品的高度复杂性严重干扰了蛋白质的质谱鉴定。因此有必要对生物样品进行预分离以简化样品组成。在第二章中，我们搭建和优化了液相色谱质谱平台，从蛋白质水平和蛋白的酶切肽段水平分别对生物样品进行预分离。在蛋白质水平，我们优化了反相色谱(RPLC)对复杂生物样品的分离效果。在肽段水平，我们搭建了离线的SCX-RPLC两维液相色谱体系。我们利用建立的多维液相色谱质谱技术平台，采取重复多次运行策略构建了目前世界上规模最大的人类肝脏蛋白质组表达谱。通过6次重复的实验，共获得了6,000,000余张二级质谱图，通过SEQUEST软件对人类蛋白质IPI3.07数据库进行检索，在90％的可信度水平下共鉴定到35658个去冗余肽段，用Buildsummary软件合并后，共得到13150个去冗余蛋白质(或蛋白质Group)，其中双肽段以上匹配蛋白质为7001个。对双肽段匹配蛋白质的理化性质、功能及亚细胞定位进行了全面分析，说明重复“Shotgun”策略是一种高通量、高灵敏度的蛋白质组研究策略。同时我们也分析了蛋白质被质谱检测频次与蛋白质丰度之间的关系，通过重复的ESI-RPLC-MS／MS技术可以鉴定更多的低丰度蛋白质。另外，相同的蛋白质在不同批次中被鉴定也起到相互印证的作用，从而增加鉴定结果的可信度。在规模化蛋白质组学研究中，鉴定结果的可靠性越来越受到人们的关注。在第叁章中，应用全新的LTQ-FTICR质谱仪器，我们对质量准确度对鉴定结果可信度的影响进行了研究。质谱仪器的质量准确度是质谱仪器的关键参数，在蛋白质的定性分析中起重要作用，我们对LTQ，FT-full(全扫描模式)及FT-SIM(选择离子监控模式)叁种质谱采集模式下的分辨率，质谱扫描时间，质量准确度进行了考察，分析了不同质量准确度数据在数据库检索中可信度过滤参数的变化，高质量准确度条件下鉴定肽段的deltaCn值普遍升高，Xcorr值下降。我们的研究表明，鉴定结果的可信度与质谱数据的质量准确度和母离子质量误差设置密切相关。对FT的数据进行了Sequest和Mascot算法的比较，肽段和蛋白的重迭率均在70％以上。这两种软件均可用于FT数据的检索，但mascot对质量准确度更为敏感。基于以上分析，我们获得了一组高可信度、高质量准确度的中国人健康肝脏蛋白质组数据集(4898个蛋白质，2640个蛋白质Group)。质谱数据中蕴藏着丰富的信息，对质谱数据的充分挖掘是当前蛋白质组研究的难点。SNPs是人类基因组中最为常见的一种遗传多态性，具有数量多、分布广和稳定遗传等特点，它与生物个体差异和许多疾病直接相关，是决定人类疾病易感性和药物反应差异的主要因素。长期以来，对SNP的发掘和鉴定一直是以基因水平的分析为基础的。在第四章中，我们首次提出了一套完整的基于液质联用质谱数据的肽段nsSNP位点发掘的策略和技术路线。利用构建的肽库，我们对先前的质谱数据进行了重新解析，发现了一系列由于nsSNP导致的氨基酸突变的肽段和蛋白质，从而在蛋白质水平验证了这些SNP的存在。在前期工作中，我们发现生物样品中蛋白质的丰度确实与该蛋白质的酶解肽段被质谱仪检测到的频率有关系。在第五章中，基于我们建立的液质联用平台，利用相对简单的酵母体系建立了根据差异样品中共同鉴定蛋白质的肽段检测频率的比值来发现差异蛋白寻找生物标志物的方法，并对不同归一化方法进行了比较分析，并将建立的非标定量方法成功地应用于肝癌细胞模型HepG2和HepG2-HBx细胞系的差异蛋白质组研究中。
参考文献：
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