贾宏瑛[1]2004年在《靶向性细胞Ca～（2+）荧光探针的合成及其应用》文中研究指明细胞内游离Ca~(2+)作为细胞内第二信使，具有重要的生物学功能。因此，细胞内游离Ca~(2+)的浓度和时空分布的研究已成为化学、生物学和基础及临床医学等学科重要的前沿热点研究课题。目前，细胞内游离Ca~(2+)的研究主要借助先进的荧光图像分析技术和Ca~(2+)荧光探针来实现的，但迄今为止，尚未见既可长波激发、又与Ca~(2+)结合后荧光峰有位移、可无损伤的导入细胞、且对胞内Ca~(2+)测定具有双靶向性、可同时对胞质Ca~(2+)和胞核Ca~(2+)进行测定的整体性能优良的Ca~(2+)荧光探针及其应用的研究报道。 本论文的研究主要开展了以下几个方面：1．合成了新型Ca~(2+)荧光探针STDBT的AM酯型STDBT—AM，使该探针可无损伤性的导入细胞。2．系统研究了新型Ca~(2+)荧光探针STDBT的光谱性能包括吸收光谱、荧光光谱、荧光寿命和荧光量子产率；6种不同类型细胞标记性能和它在四种不同的活性氧体系中的耐氧化性能。3．以所合成的STDBT—AM为细胞Ca~(2+)荧光探针，采用共聚焦技术，进行了不同类型细胞受刺激之后胞内游离Ca~(2+)浓度变化的实时监测，探讨了细胞内游离Ca~(2+)动员的机制，并与Fluo-3进行比较。 本研究论文主要包括以下叁个部分： 一．概述 本文对目前常用的几种细胞Ca~(2+)测定方法，特别是钙荧光指示剂法中细胞Ca~(2+)荧光探针的合成研究及测定方法进行了较为详尽的综述。 二．新型细胞Ca~(2+)荧光探针STDBT—AM的合成及其性能研究 1．新型Ca~(2+)荧光探针STDBT—AM的合成 将合成的具有靶向性、可长波激发、与Ca~(2+)结合前后荧光峰有较大位移的新型Ca~(2+)荧光探针STDBT制成AM酯型导入细胞。 2．新型Ca~(2+)荧光探针的性能研究 系统研究了所设计合成的Ca~(2+)荧光探针STDBT的分析性能，包括吸收光谱、荧光光谱、细胞荧光标记特性和耐氧化性能。结果表明，所合成试剂STDBT既具备双波长Ca~(2+)荧光探针Fura-2与Ca~(2+)结合前后吸收和荧光峰有位移，又保持了长波长Ca~(2+)荧光探针Fluo-3荧光激发波长位于可见光区的特性且与Ca~(2+)的亲和力较小，适合细胞Ca~(2+)的动态测定。同时细胞荧光图像分析显示，STDBT—AM进入细胞后既标记胞质又标记胞核，且胞核、胞质边缘界限清晰明显，是目前唯一的可以AM酯型无损伤导入细胞、双波长、可见光激发、具有亚细胞区域定位性的人工合成小分子Caz+荧光探针。并且其水溶性好，在细胞内较Fluo一3等更易于负载，耐氧性较目前常用的两种Caz+荧光探针F~2和Fluo一3好，氧化剂对STDBT与C扩+的亲和力的影响较小。试剂整体性能优于目前国内外广泛采用的c犷+荧光探针。叁.新型ca2+荧光探针的应用 1.新型ca2+荧光探针sTDBT测定血清中游离ca2+ 利用指示剂sTDBT在 PH一7.2的中性缓冲介质中，可与c扩十络合形成稳定的络合物，且络合前后吸收峰有较大位移这一特点，建立了一种在生理条件下，采用双波长比率法测定血清中游离c犷+的新方法。 2.肾上腺素诱导不同运动负荷大鼠心肌细胞胞质、胞核ca2+的动员机制研究 采用激光共聚焦显微术，应用所合成的新型caz+荧光探针smBT一AM研究了肾上腺素诱导大鼠心肌细胞c扩+动员的机制，探讨了心肌细胞胞核caz+与胞质caz+的调节是否具有独立性，并比较了不同运动负荷大鼠心肌细胞内c扩+的含量、分布变化情况，且与Fluo一3进行了比较。表明所合成探针SrTDBT一AM是目前国内外唯一的可以AM酉旨型无损伤导入细胞、双波长、可见光激发的双靶向胜的caz+荧光探针，’肾上腺素诱导心肌细胞中核[C扩+]。是通过T型c扩+通道促进外c犷十内流。 3.sTDBT用于瘦素对生长激素细胞胞内ca2+变化的影响 将所合成的新型c犷十荧光探针sTDBT一AM用于生长激素细胞，研究了减肥药一瘦素对细胞中C犷十浓度的影响，并与Fluo一3一AM对生长激素细胞的标记及其对胞内游离C扩十浓度变化的响应等特性进行了比较。结果表明，与Fluo-3不同，新型C扩+荧光探针STDBT对胞核c扩+具有很强的靶向胜，当它与Fluo一3一起标记细胞时它能完全占有细胞核，但却不进入核仁，是一种真正的胞核C扩十荧光探针，且其荧光发射峰位于长波长区域，它发射的为红色荧光。对瘦素诱导的胞内游离c扩+浓度变化的响应较Fluo一3更灵敏迅速。 4.双靶向性c扩十荧光探针sTDBT一AM用于K562细胞胞核caz+和胞质ca2+的调节机理研究 利用新型caz+荧光探针smBT-A加I的双靶向胜，结合激光共聚焦技术研究了K562细胞胞核[C内。和胞质[C扩勺。的调节机制。结果表明在K562细胞中胞核Caz十和胞质c犷十在行使其信使作用时具有相对独立性，激动剂诱导胞质[C内。的升高主要来自外c尹内流和内c犷+释放，而胞核[C矛勺。升高主要依赖于内c犷+释放，即核被膜紧邻外周的内c扩+释放和被认为是核caz+库的核被膜空腔的内caz+释放。
贺怀贞[2]2009年在《新型Ca~（2+）荧光探针的设计、合成及胞内信使作用研究》文中提出Ca~(2+)作为细胞内的信息传递物质,它起着调节许多重要细胞功能的作用。作为第二信使,Ca~(2+)参与生物信号的跨膜传递,介导细胞对外界刺激的应答等等,因此,准确测定活体细胞内游离Ca~(2+)的浓度及其动态变化已成为化学、生命科学及基础临床医学研究中的一个非常重要的研究领域。80年代以来Tsien等人合成的具有EGTA、BAPTA螫合母体的Ca~(2+)荧光探针,广泛地应用于细胞内游离Ca~(2+)浓度的测定。这种方法灵敏性高,响应时间短,并且可以通过显微镜成像来提高空间解析度,从而为细胞内Ca~(2+)的研究提供一条简便、高效的途径。因此,Ca~(2+)荧光探针的设计、合成也成为有机合成化学的热点问题。目前广泛应用的Ca~(2+)荧光探针上要以荧光素类和吲哚型为主。其中,荧光素类Ca~(2+)荧光探针属于可见光激发的荧光探针,主要通过荧光强度的变化来测定胞内Ca~(2+)的浓度:吲哚型Ca~(2+)荧光探针属于紫外光激发的荧光探针,在结合了Ca~(2+)后,激发波长或发射波长会发生较大位移.可应用双波长比率法进行Ca~(2+)浓度的测定。然而,目前商业化应用的Ca~(2+)荧光探针的数目极为有限。为了满足不同浓度范围Ca2~(2+)的测试,改善探针的生物亲和性以及荧光强度,本文围绕新型Ca~(2+)荧光探针的设计、合成及其胞内信使作用展开研究.主要内容有以下几个方面:1.通过对目前广泛应用的Ca~(2+)荧光探针的螫合母体BAPTA结构的分析,设计、合成了五种新型BAPTA结构的衍生物,并对这五种化合物进行了结构表征.2.设计、合成了叁种未见文献报道的新型荧光素类Ca~(2+)荧光探针,并对这叁种新型荧光素类Ca~(2+)荧光探针的甲酯形式进行了结构表征。报道了这叁种新型荧光素类Ca~(2+)荧光探针甲酯的荧光光谱。3.设计、合成了五种未见文献报道的新型含氯荧光素类Ca~(2+)荧光探针,并对这五种新型荧光素类Ca~(2+)荧光探针的甲酯形式进行了结构表征.报道了这五种新型荧光素类Ca~(2+)荧光探针甲酯的荧光光谱。同时,从理论计算角度获得了Ca~(2+)荧光探针分子设计的有用结果。4.设计、合成了五种未见文献报道的新型吲哚型Ca~(2+)荧光探针,并对这五种新型吲哚犁Ca~(2+)荧光探针的甲酯形式进行了结构表征。报道了这五种新型吲哚型Ca~(2+)荧光探针的荧光光谱。5.对设计、合成的新型荧光素类Ca~(2+)荧光探针Fluo-3M的荧光光谱进行了研究,结果表明,Fluo-3M在与Ca~(2+)结合后,荧光强度明显增强。其最大激发波长和发射波长与Fluo-3类似,所有可应用于Fluo-3的荧光成像仪器均适用于这种新型探针,为Fluo-3M的商品化应用奠定了基础。6.对设计、合成的新型荧光素类Ca~(2+)荧光探针Fluo-3M的离解平衡常数-K_d进行了测定,结果表明,Fluo-3M是一种具有较高亲和力(低K_d值)的Ca~(2+)荧光探针,适用于细胞膜附近的Ca~(2+)浓度的测定。7.将设计、合成的新型荧光素类Ca~(2+)荧光探针Fluo-3M的乙酸甲酯形式-Fluo-3MAM负载入人胚肾细胞及中国仓鼠卵巢细胞中,应用Olympus IX71型倒置研究级荧光显微镜进行活体细胞中胞内自由Ca~(2+)的检测和成像。结果表明:Fluo-3M具有优良的荧光性能和生物亲和性,可应用于活体细胞的连续测定,是一种性能优良的Ca~(2+)荧光探针。
张小玲[3]2002年在《新型细胞Ca～(2+)荧光探针的合成及在生命科学研究中的应用》文中指出细胞内游离Ca~(2+)作为细胞重要的生理应答反应信使，具有重要的生物学功能。因此，细胞游离钙含量及其动态分布变化的测定已成为化学、生物学和基础及临床医学研究中的一个非常重要的研究领域，亦是现代分析化学重要的前沿研究热点。目前胞内游离钙的测定方法主要是应用Tsien等人合成的Quin-2、Indo-1、Fura-2及Fluo-3等钙荧光探针而建立的钙荧光指示剂法。然而，该类荧光探针或需要在紫外区激发，导致细胞自身荧光干扰及光损伤；或与Ca~(2+)结合后无荧光峰的位移，难以采用双波长比率法进行测定；或对于细胞内胞浆、胞核钙无特异性。迄今为止，尚未见既可长波激发、又与Ca~(2+)结合后荧光峰位移、且对胞内Ca~(2+)测定具特异性、可在亚细胞水平进行Ca~(2+)测定的整体性能优良的钙荧光探针及其在生命科学中的应用研究报道。 本论文的研究主要开展了以下几个方面：1．首次研究设计并成功合成了国内外文献迄今未见报道的两种新型钙荧光探针(简称STDIn和STDBT，已申请国家发明专利)，系统研究了所合成钙荧光探针的结构、光谱特性及细胞荧光标记特性。2．以所合成STDIn—AM为细胞钙荧光探针，采用共聚焦技术，研究了5—羟色胺诱导培养胃底平滑肌细胞胞内游离钙动员的机制，并与Fluo-3进行比较。表明所合成试剂STDIn—AM是目前国内外唯一的可以AM酯型无损伤导入细胞、双波长、可见光激发的胞浆特异性Ca~(2+)荧光探针。3．首次发现了5—羟色胺诱导培养胃底平滑肌细胞产生的钙火花现象，探讨了其形成机制。4．采用了四种不同的活性氧产生体系，对自行合成Ca~(2+)荧光探针STDIn的耐氧化能力进行了考察。并进而以H_2O_2为外源性活性氧，STDIn-AM为探针标记HL—60细胞，激光共聚焦技术探讨了不同浓度H_2O_2对胞内Ca~(2+)的影响，从膜结构和生物信号转导的角度研究了氧自由基对培养细胞的生物学效应。5．采用量子化学方法对新荧光试剂及其Ca~(2+)络合物进行了研究，首次从理论上确定了新荧光试剂及其络合物的几何构型、金属离子在试剂分子中的络合位置，并研究了试剂结构参数与性能之间的关系。 本文靶向性细胞Ca~(2+)荧光探针的设计合成及其在生命科学研究中的应用研究，使细胞钙的测定由单细胞水平拓展到了亚细胞水平，为更深入的细胞信号转导研究提供了可行、有效的手段。这一研究结果，对于新型细胞探针试剂的设计合成，揭示生命科学中的重要生理应答反应信使—胞内游离Ca~(2+)的作用机制具有十分重要的理论意1穿北大学准味d匕学位创含文2002义和应用参考价值。 本研究论文包括以下四个部分:一细胞c扩+测定方法研究进展(综述) 对目前常用的几种细胞C扩+测定方法，特别是钙荧光指示剂法中细胞钙荧光探针的合成研究及测定方法进行了较为详尽的综述，引用截至2002年的文献103篇。在此基础上提出了自己拟进行的研究方向。二.新型细胞c扩+荧光探针的合成及性能研究 1.新型钙荧光探针的合成 设计合成了两种新型钙荧光探针一STDhi和STDBT(其中STDIn已制成相应AM酉旨型可导入细胞)。 2.新型钙荧光探针的性能研究 研究了试剂的结构、吸收及荧光光谱特性和细胞荧光标记特性。结果表明，所合成试剂既具备双波长钙荧光探针F盯a一2与c扩+结合前后吸收和荧光峰位移，又保持了长波长钙荧光探针Fluo一3荧光激发波长位于可见光区的特性。同时细胞荧光图像分析显示，sTDhi一AM进入细胞后只标记胞浆c扩+而不标记胞核c扩+，是目前唯一的可以 AM酉旨型无损伤导入细胞、双波长、可见光激发的胞浆特异性C扩+荧光探针。并且其水溶性好，在胞浆内较Fhi小3等更易于负载。试剂整体性能优于目前国内外广泛采用的C扩+荧光探针。叁.新型c扩+荧光探针在生命科学研究中的应用 1.胞浆特异性c扩+荧光探针sTDhi用于5一轻色胺诱导培养胃底平滑肌细胞内游离钙动员机制的共聚焦研究 首次采用激光共聚焦技术分别进行了新型Ca=+荧光探针STDIn与Flu。一3对胃底平滑肌细胞的标记，及其对胞内游离CaZ+浓度变化的响应等特性的比较研究。结果表明，与Fluo一3不同，新型Ca2+荧光探针STDIn对胞浆Caz+具有靶向性，只标记胞浆而不进入胞核，是一种真正的胞浆Ca2+荧光探针，对5一轻色胺(5一HT)诱导的胞内游离Caz+浓度变化的响应更灵敏迅速。应用于5一HT诱导胃底平滑肌细胞胞内游离Ca2+动员的机制研究，发现5一HT通过促进外钙内流和内钙释放使[Caz+〕j升高;在胃底平滑肌5一HT升高〔Ca，‘〕，系通过5一HTZ受体介导的1 P3/Ca，‘和DG/PKC双信使途径;5一HT通过L型钙通道促进外钙内流。 2.5一HT诱导胃底平滑肌细胞钙火花的研究 以合成的胞浆特异性Caz+荧光探针STDhi一AM标记细胞，采用激光共聚焦线扫描技术，首次观察到5一HT诱导胃底平滑肌细胞胞内钙释放的最基本单位一一J塑必尝华盆翔望尝‘一盈些沁(elementary events)，“钙火花(ealeium sparks)”现象。提出其成因于肌质网上的单个和若干钙释放通道(亦称ryanodine受体)的开启的机理。 3.钙荧光探针STDIn对活性氧的耐受性和在HZO:对HL一60细?
李宏[4]2017年在《纳米氧化铈的合成修饰及其在辐射防护与肿瘤光动力学治疗中的应用研究》文中指出研究背景和目的纳米氧化铈(CNPs)属于镧系金属元素氧化物,其表面同时存在Ce4+和Ce3+的氧化价态且可相互转化,因此具有独特的催化活性及多种生物酶学模仿活性,能有效清除机体内多种活性氧及活性氮,被广泛应用于生物医学领域。然而,未经充分表面修饰的CNPs存在着体内易团聚,易被内皮网状系统(ERS)清除等缺点,从而限制了其临床应用,因此需要对CNPs表面进行生物相容性修饰。然而,大多数表面修饰物如聚乙二醇(PEG)由于缺乏内在亲和力而很难稳定的吸附于CNPs表面。因此,需要寻找一种锚定分子来“桥接”CNPs与表面修饰物,以此探索一种简单、有效的CNPs表面修饰方法。正常生物组织暴露于电离辐射会产生大量自由基,损伤正常细胞及组织。研究报道,CNPs可以有效清除电离辐射诱导产生的多种自由基,降低细胞氧化应激水平,有望成为一种新型的放射防护剂。然而,未经充分表面修饰的CNPs抗辐射活性较低,且副作用较大。因此,有必要评价生物相容性修饰的CNPs对正常细胞的辐射防护作用,积极探索一种新型、有效、副作用小的放射防护剂。光动力学治疗(PDT)是指进入特定组织的光敏剂(PSs)在特定波长光的激发下,与生物分子或氧分子发生光敏作用,产生大量单线态氧(1O2)等活性氧,从而光损伤细胞。作为一种新型非侵袭性治疗手段,PDT具有组织特异性强、副作用小等优点,在治疗良恶性实体瘤及克服肿瘤耐药方面具有其独特的优势。然而,大多数传统的PSs疏水性较高,肿瘤靶向性较弱。CNPs作为PSs的载药平台除具有载药量大,靶向性高,有效提高PSs的生物相容性,药效时间长等一般纳米材料的优点外,其独特的催化活性、协同抗肿瘤效应以及优秀的储氧功能亦可增强PDT效应,因此CNPs-PSs在恶性肿瘤及耐药性肿瘤的PDT治疗中具有巨大的潜力。然而,CNPs在PDT中的应用却很少被研究。因此,设计一种基于CNPs的PSs载药系统用于PDT肿瘤治疗及肿瘤耐药性的克服,并深入研究其机制,以此探索一种基于CNPs的新型、有效、靶向性高、副作用小PDT治疗方案,对指导临床肿瘤PDT的实施具有重要意义。研究方法1、通过微乳液法或高温分解法合成CNPs,并以阿仑膦酸(AL)作为锚定分子,对CNPs表面进行琥珀酸(SA)或PEG修饰;分析修饰前后纳米颗粒的分散性、稳定性、表面电荷分布、SOD酶模仿活性及细胞毒性;测定修饰前后纳米颗粒在小鼠体内的血液循环滞留时间及脏器分布。2、对比研究裸的CNPs及PEG化的CNPs(CNPs-AL-PEG)对60Coγ射线诱导的正常肝细胞增殖活性、细胞凋亡、细胞内ROS浓度、DNA损伤的影响;分析修饰前后纳米颗粒的细胞摄入量、亚细胞定位及对细胞内SOD2蛋白表达的影响。3、通过共价链接将聚乙烯亚胺(PEI)嫁接到CNPs-AL-PEG上(PPCNPs),并将光敏分子二氢卟吩(Ce6)共价键合到PEI氨基末端,合成多功能纳米载药系统(PPCNPs-Ce6);采用稳定性分析、X射线光电能谱(XPS)分析、荧光光谱分析、Zeta电位分析及1O2产生能力分析对材料进行化学表征;对PPCNPs-Ce6的细胞摄入量及亚细胞定位进行分析;通过细胞增殖活性分析、细胞凋亡检测、细胞内ROS浓度测定、溶酶体功能检测及透射电镜观察,研究PPCNPs-Ce6对宫颈癌细胞的黑暗化疗毒性或在660 nm光照条件下的PDT光损伤效应及其机制;采用肿瘤生长曲线及肿瘤及脏器病理研究PPCNPs-Ce6对荷瘤小鼠的光-化疗协同效应。4、在PPCNPs-Ce6的基础上,链接肿瘤靶向性分子叶酸(FA),合成靶向性多功能载药系统(PPCNPs-Ce6/FA);采用透射电镜观察、稳定性分析、XPS分析、荧光光谱分析、红外光谱分析、Zeta电位分析、1O2产生能力分析对材料进行化学表征;通过阿霉素(DOX)摄入量、细胞增殖活性研究及药物外排泵P糖蛋白(P-gp)表达分析,研究基于PPCNPs-Ce6/FA的低剂量PDT对耐药性乳腺癌细胞耐药性的影响;分析PPCNPs-Ce6/FA的细胞摄入量、亚细胞定位及对耐药性乳腺癌细胞的PDT光损伤效应;通过细胞内凋亡相关蛋白Caspase-3/-7酶及自噬相关蛋白LC3-II的表达水平分析、溶酶体膜通透性检测(吖啶橙染色、凝集素穿孔实验)、活细胞成像、透射电镜观察、胞内ATP含量及Ca2+浓度检测,研究基于PPCNPs-Ce6/FA的PDT诱导耐药性乳腺癌细胞死亡的途径;活体动物成像、肿瘤生长曲线及肿瘤病理研究PPCNPs-Ce6/FA对荷瘤小鼠的肿瘤靶向性及PDT抗肿瘤效应;研究尾静脉注射PPCNPs-Ce6/FA对小鼠血常规、肝肾功及脏器病理的影响。研究结果1、CNPs的合成及表面修饰:采用微乳液法及高温分解法合成的CNPs,粒径约为3-5 nm;以AL作为锚定分子,成功将SA及PEG修饰于CNPs表面,修饰后的CNPs分散性及稳定性显着提高;CNPs表面修饰能显着提高纳米颗粒表面Ce3+/Ce4+的比率,且随着修饰链长度的增加而升高,导致其SOD酶模仿活性显着提高,并降低对肝细胞的毒性;CNPs的PEG修饰能显着提高纳米颗粒在体内的血液循环滞留时间,改善组织分布,进而减少其在肝脏特别是脾脏中的蓄积。2、PEG化的CNPs的辐射防护研究:CNPs-AL-PEG具有良好的分散性及稳定性,其表面Ce3+的浓度(46.4%)显着高于裸的CNPs(37.9%);CNPs及CNPs-AL-PEG都能有效降低电离辐射诱导的L-02细胞损伤及凋亡,但CNPs-AL-PEG的辐射保护效应(~86.7%)显着强于CNPs(~62.4%),提示PEG修饰能有效提高CNPs的辐射防护效应;PEG修饰能显着增强CNPs对电离辐射诱导的O2·-等自由基的清除,促进细胞内SOD2酶的表达,从而减轻电离辐射对细胞DNA的损伤;PEG修饰显着降低细胞对CNPs的摄取(约400倍),CNPs-AL-PEG进入细胞后分散于胞浆,而裸的CNPs进入细胞后大量团聚并集聚于溶酶体,这是裸的CNPs毒性较高且放射防护效应较低的主要原因之一。3、PPCNPs-Ce6对宫颈癌的光-化疗协同效应:PPCNPs-Ce6具有良好的稳定性及生物相容性,PSs加载效率较高(质量比Ce6/Ce:~40%);PPCNPs-Ce6显着增加宫颈癌细胞Hela对PSs的摄入(>10倍),并定位于细胞溶酶体;PPCNPs-Ce6能被660 nm近红外激光(NIR)激发而发生光敏反应,超低剂量PPCNPs-Ce6(<1μM)下就能有效光损伤肿瘤细胞,与游离Ce6相比,其PDT效应显着提高;较低剂量PPCNPs-Ce6(3-10μM)在黑暗情况下就能损伤细胞溶酶体,促进细胞ROS的产生,诱导细胞细胞发生凋亡,对肿瘤细胞有显着的化疗毒性;基于PPCNPs-Ce6的同步光-化疗能显着降低抑制荷瘤小鼠肿瘤的生长(肿瘤抑制率104.7%),可克服传统PDT组织穿透性差的缺点,且无明显毒副作用,实现了成像介导的光-化疗协同治疗宫颈癌。4、PPCNPs-Ce6/FA对耐药性乳腺癌的靶向光敏作用:PPCNPs-Ce6/FA稳定性及生物相容性高,PSs加载效率高;与PPCNPs-Ce6相比,耐药性乳腺癌MCF-7/ADR对PPCNPs-Ce6/FA的摄入进一步提高;PPCNPs-Ce6/FA进入细胞后选择性的定位于溶酶体,且能被660 nm NIR激发,产生大量ROS;基于PPCNPs-Ce6/FA的低剂量PDT能破坏MCF-7/ADR细胞P-gp药物外排泵,促进细胞对DOX的摄入,从而发挥光-化疗协同效应;PPCNPs-Ce6/FA在660 nm光照激发下,超低剂量(<1μM)就能对MCF-7/ADR细胞发挥优异的光损伤效应;基于PPCNPs-Ce6/FA溶酶体靶向的PDT诱导细胞发生凋亡及自噬具有明显的剂量依赖性,光敏化较高浓度的PPCNPs-Ce6/FA(1μM)会诱导细胞发生Oncosis方式的死亡,伴随着细胞溶酶体膜的破坏、胞膜起泡、细胞及细胞器肿胀、胞浆空泡化及能量的快速耗竭;裸鼠荷瘤实验证明PPCNPs-Ce6/FA具有优异的肿瘤靶向性,并能在NIR激发下显着抑制肿瘤的生长(肿瘤抑制率96%),发挥优异的抗肿瘤效应;适当浓度PPCNPs-Ce6/FA静脉全身给药对动物毒性较小,安全性高。主要结论1、以AL作为锚定分子,成功将SA及PEG修饰于CNPs表面,修饰后的纳米颗粒稳定性、生物相容性及SOD酶模仿活性显着提高,细胞毒性显着降低。2、PEG修饰有效改善CNPs的细胞摄取及亚细胞定位,提高纳米颗粒对辐射诱导的ROS的清除能力,促进细胞SOD2的表达,减轻辐射诱导的DNA损伤,从而增强CNPs对细胞的辐射防护效应。3、基于CNPs的纳米载药系统(PPCNPs-Ce6)显着促进宫颈癌细胞对PSs的摄入,并定位于溶酶体,在特定波长光激发下超低剂量就能能有效发挥PDT杀伤肿瘤效应;同时在黑暗情况下,一定浓度PPCNPs-Ce6能有效发挥化疗毒性,从而实现成像介导的光-化疗协同治疗宫颈癌。4、PPCNPs-Ce6/FA进一步增强耐药性乳腺癌对PSs的摄入及光敏效应,基于PPCNPs-Ce6/FA溶酶体靶向的PDT能有效克服肿瘤耐药性,其诱导细胞发生凋亡及自噬具有明显的剂量依赖性,光敏化较高浓度的PPCNPs-Ce6/FA会诱导细胞发生Oncosis。
韩洁[5]2008年在《新型荧光素类细胞Ca~（2+）荧光探针的设计合成及在细胞信号转导中的应用研究》文中研究指明钙离子作为细胞内的信息传递物质,起着调节许多重要细胞功能的作用。作为第二信使,钙离子参与生物信号的跨膜传递,介导细胞对外界刺激的应答等等。因而,准确测定活细胞内游离钙离子的浓度和其动态变化已成为化学、生命科学和基础及临床医学研究中的一个非常重要的研究领域,也是有机合成化学重要的前沿热点。荧光探针是一种极好的生物分子传感器,具备高灵敏性、快速反应时间以及通过显微镜成像能提供高空间解析度等特点。荧光探针在胞内游离钙离子测定中的应用,为细胞内钙离子的研究提供了一条简便、高效的途径。荧光素具有高的消光系数,激发和发射波长都在可见光区,在水中具有较高的荧光量子产率,无毒,成本低等优点。近年来,大量以荧光素为核心的荧光探针被开发出来。随着生物技术的不断发展,基于荧光素的荧光探针已经在蛋白质、核酸、细胞检测及免疫分析等方面发挥了重要作用。Ca~(2+)荧光探针法是近年来发展起来的一种钙离子浓度的测定方法,以荧光素类细胞Ca~(2+)荧光探针的应用最为广泛。目前已有的荧光素类细胞Ca~(2+)荧光探针均系可见光激发的荧光探针,且大多数荧光探针属于高亲和力(低K_d值)的Ca~(2+)荧光探针,它对细胞内Ca~(2+)具有缓冲作用,而且高亲和力的Ca~(2+)荧光指示剂在低[Ca~(2+)]时容易饱和,易导致细胞内[Ca~(2+)]分析的误差。为了改善细胞Ca~(2+)荧光探针的生物亲和性,荧光强度和与钙离子结合力等方面的性能,本文围绕新型荧光素类细胞Ca~(2+)荧光探针的设计、合成及在细胞信号转导中的应用展开,主要内容有以下几个方面。1.对目前广泛应用的荧光素类细胞Ca~(2+)荧光探针的合成方法进行了改进,对合成条件进行了优化,成功合成了Fluo-3、Fluo-4和Fluo-2,并实现了Fluo-3的商品化生产。并对这叁种化合物进行了结构表征。2.设计了五种未见文献报道的新型荧光素类细胞Ca~(2+)荧光探针,对相关的叁种新型细胞Ca~(2+)荧光探针中间体进行了合成,为开发新型细胞Ca~(2+)荧光探针提供了新思路。3.合成了五个新型荧光素类细胞Ca~(2+)荧光探针,对这五种化合物进行了结构表征。首次报道了这五个新型荧光素类细胞Ca~(2+)荧光探针的荧光光谱和与钙离子结合前后荧光光谱的变化。4.对其中两种新型荧光素类细胞Ca~(2+)荧光探针的K_d值进行了测定,结果表明,这两种新型荧光素类细胞Ca~(2+)荧光探针是一类低亲和力(高K_d值)的Ca~(2+)荧光探针,它避免了高亲和力的Ca~(2+)荧光指示剂容易造成指示剂过载,超出其相应范围,从而造成测量误差,不能真实反映细胞内的Ca~(2+)浓度的缺点,可用于分析细胞器内[Ca~(2+)]的变化和有较高浓度钙离子的细胞中钙离子的测定。5.将设计合成的新型含氟荧光素类细胞钙离子荧光探针Fluo-2FFM负载入中国仓鼠卵巢细胞中,应用OlympusⅨ71型倒置研究级荧光显微镜进行活细胞中胞内自由钙离子的检测和成像。经过测定,新合成的一系列荧光素类细胞钙离子荧光探针对细胞的毒害性小,具有优良的荧光性能和生物亲和性,可应用于活体细胞的连续测定,是一类性能优良的细胞钙离子荧光探针。
吴静[6]2018年在《氧杂蒽和二氢卟吩类荧光染料的合成及其性质研究》文中研究说明荧光染料因其特殊的光学性质,近年来在工业、生物、医学和环境等领域得到了越来越广泛的应用。特别是其发射波长可控,检测灵敏度高,能量相对较低,对动植物伤害小等优势,在生命相关领域得到人们的高度重视。随之也发展了多种基于不同母核结构的荧光染料族。因其结构上的差异,上述荧光染料在实际应用中或多或少受了一定的限制。开发具有优异光学性能的新型荧光染料,以期高效、低毒地应用于生命体的分析检测及疾病的诊断与治疗有着非常重要的现实意义。基于上述思路,本论文分别选择了氧杂蒽和二氢卟吩两类母核结构,通过化学方法在不同位点分别修饰具有不同给/吸电子能力的官能团,发现其对产物光学性质影响的规律,为开发高量子产率、长波长的新型荧光染料提供理论和物质基础。具体如下:1)以氧杂蒽为母核,在侧链酚氧上分别修饰丙烯酸酯、杂环醚,得到了5个新型氧杂蒽类荧光染料BPO-ACRY、BPO-CINA、BPO-CRTO、BPO-Py-Cl和BPO-THAZ-COOMe。采用HRMS、~1H NMR、~(13)C NMR等手段对它们表征,证实了上述化合物的成功合成。基于氧杂蒽特殊结构,α,β不饱和C=C,我们将之应用于SO_2的荧光检测。结果表明BPO-Py-Cl对SO_2表现出高灵敏度、高选择性和大Stokes位移等优点。SO_2能够增强495 nm处发射强度高达11.7倍,实现了可见光和365 nm紫外灯下对SO_2裸眼识别。进一步研究表明,该探针具有良好的细胞膜穿透性,可应用于活体细胞中外源性SO_2的荧光成像。2)设计了两条不同蚕沙粗品中叶绿素提取路线,其各关键环节进行了优化。经脱镁水解,制得原料脱镁叶绿酸a;以其为母核,设计合成了6个二氢卟吩衍生物GMJ-3a、GMJ-3b、GMJ-3c、GMJ-4、GMJ-5和GMJ-6,其中GMJ-3a和GMJ-3c为新化合物。采用HRMS、1D NMR(~1H和~(13)C NMR和DEPT)和2D NMR(HMBC、HMQC和~1H-~1HCOSY)等手段对它们表征,证实了上述化合物的成功合成。采用紫外-可见分光光度法和荧光分光光度法对它们的紫外和荧光特性进行了表征,发现上述化合物的吸收和发射光均处于近红外范围(650~710 nm),在疾病诊断及光动力治疗中具有潜在的应用前景。
王永祥[7]2006年在《新型细胞Ca～（2+）荧光探针的设计合成研究》文中研究表明细胞内游离Ca~(2+)作为细胞内的第二信使，在生物体中具有非常重要的作用，其作用几乎涉及到细胞的所有生理生化过程，如：细胞的胞吐、胞饮、神经递质释放、DNA合成、细胞分裂，乃至细胞的死亡等，因此，细胞游离钙含量及其时空分布和动态变化的研究已成为化学、生物学和医学研究中的一个非常重要的领域，也是现代分析化学重要的前沿研究热点之一。 自1982年，美籍华裔科学家、加利福尼亚大学的Tsien R Y等合成了第一代Ca~(2+)荧光指示剂(也称Ca~(2+)荧光探针)，据此而建立的Ca~(2+)荧光探针法由于探针能在生理条件下快速、灵敏而高选择性的响应胞内Ca~(2+)的瞬变，且其AM酯型可无损伤导入细胞，同时可采用先进的荧光显微成像分析技术，从而使测定活细胞内Ca~(2+)浓度的方法取得了突破性的进展。其后该小组又设计并合成出了第二代和第叁代Ca~(2+)荧光探针。目前胞内游离钙的测定方法主要是应用Tsien等人合成的Quin-2、Indo-1、Fura-2及Fluo-3等Ca~(2+)荧光探针，长期以来，人们利用Ca~(2+)荧光探针法详细、系统地研究了Ca~(2+)在生物体中发挥的重要作用，初步探明了其发挥第二信使作用的机制，为进一步了解生命现象做出了重要的贡献。但由于上述常用的Ca~(2+)荧光探针或需要紫外光激发(如Quin-2、Indo-1、Fura-2)，导致细胞自身荧光干扰及光损伤严重：或与Ca~(2+)结合前后荧光峰无位移(如Fluo-3)，采用双波长比率法进行测定较为困难；特别是上述探针均不具有靶向性，难以进行亚细胞区域Ca~(2+)的测定。这些探针自身存在的、无法克服的缺点和不足，使细胞游离Ca~(2+)含量及其时空分布动态变化的研究方面仍存在一定的困难和障碍，故设计并合成新型整体性能优良的Ca~(2+)荧光探针仍然是广大试剂合成工作者追求的目标。 本论文试图设计合成一种靶向性、长波激发的近红外新型细胞Ca~(2+)荧光探针，并就此方面进行了一些有意义的探索和尝试。 本研究论文包括以下叁个部分： 一．细胞内游离Ca~(2+)荧光探针研究进展(综述) 对目前常用的几种细胞钙荧光探针，特别针对钙荧光探针的合成研究及其性能和测定方法进行了较为详尽的综述，并在此基础上提出了拟进行的研究目标。 二．新型细胞Ca~(2+)荧光探针的合成研究 根据所确定的研究目标，设计了新型钙荧光探针的合成路线。实验中我们成功合成了一种Ca~(2+)荧光探针制备过程中的十分重要的的中间体
王保刚[8]2016年在《近红外硅基罗丹明—合成方法学及荧光探针的构建与成像研究》文中认为近年来,荧光成像技术为人们研究活体细胞及组织内的化学生物学过程提供了有效的研究工具,可以无损、实时、原位地以高时空分辨率实现对目标物进行生物荧光成像与分析。荧光成像技术在生物学、环境监测、临床诊断和药物发现等诸多研究领域发挥着越来越重要的作用。生物荧光成像技术的最新进展对发展新型小分子荧光染料及探针提出了更高的要求。激发和发射波长位于近红外光区(600-900 nm)的荧光染料及探针由于具有光毒性低、生物分子自发荧光干扰小、光散射低、组织穿透能力强等优点,非常适合用于生物荧光成像领域。研究表明,通过将罗丹明分子中O桥原子用Si Me2代替,得到了硅基罗丹明荧光染料。这类染料分子在保留了罗丹明荧光染料优越的光学性质的同时,光谱发生明显红移,满足了近红外荧光检测的要求,具有良好的生物相容性。在本论文中,我们致力于构建基于硅基罗丹明的近红外荧光成像平台。一、硅基罗丹明染料合成方法学研究现有硅基罗丹明染料的合成方法操作复杂,产率较低,且底物选择范围有限,大大限制了硅基罗丹明荧光探针的发展。为了解决这一问题,我们进行了硅基罗丹明合成方法学的研究工作,开发了一条全新的硅基罗丹明合成路线。通过二芳基硅醚中间体与取代苯甲醛反应,构建硅基罗丹明母核。通过该合成方法,我们大大扩充了硅基罗丹明染料的种类,合成了扩环的和具有不对称结构的硅基罗丹明衍生物,并且成功构建了含有以前方法难以引入基团(如-Br,-NO2等)的硅基罗丹明衍生物。在此基础上,通过Click反应,将细胞线粒体靶向基团引入到含炔基的硅基罗丹明分子中,合成出具有线粒体靶向功能的近红外荧光探针,并成功应用于活细胞线粒体的荧光成像实验中。二、功能化硅基罗丹明近红外荧光探针的构建及成像研究在合成方法学研究的基础上,我们进一步设计并合成了功能化硅基罗丹明近红外荧光探针,并应用于活细胞近红外荧光成像研究中。一方面,硅基罗丹明的螺环化已被证实是一种有效的设计“关–开”型荧光探针的手段,具有荧光背景低和检测灵敏度高等优点。另一方面,在对硅基罗丹明的性质进行研究过程中我们发现,相较于具有类似结构的罗丹明分子,硅基罗丹明有着许多独特的性质,其中较为突出的一点是硅基罗丹明分子中的螺环具有特殊的稳定性,特别是对H+有很强的耐受性。这使得硅基罗丹明在正常生理条件下和酸性环境中都有极低的荧光背景。因此,含有螺环结构的硅基罗丹明分子能够以较高的信噪比实现酸性条件下不同分析物的近红外荧光成像。由于溶酶体的酸性环境,往往会使一般的荧光探针产生背景荧光或者影响探针分子对检测物的响应,使得检测灵敏度降低,因而能够用于对细胞溶酶体中分析物进行生物成像的小分子荧光探针少之又少。得益于硅基罗丹明分子中螺环特殊的稳定性,我们设计并合成了具有溶酶体靶向功能的硅基罗丹明Cu~(2+)探针Si RB-Cu和硅基罗丹明NO探针Lyso-Si RB-NO,分别对其光谱学性质进行了研究,并成功应用于活细胞溶酶体内Cu~(2+)和NO的近红外荧光成像实验中。1、含六元螺环的硅基罗丹明靶向溶酶体Cu~(2+)近红外荧光探针细胞溶酶体Cu~(2+)平衡的调节与许多生理和病理过程着密切的联系,开发一种能够检测细胞溶酶体内Cu~(2+)实时分布和浓度变化的荧光探针具有重要的研究价值。我们报道了一个含有六元胺基硫脲螺环的硅基罗丹明Cu~(2+)探针—Si RB-Cu,胺基硫脲结构不仅仅是Cu~(2+)的结合和反应位点,同时与可以起到溶酶体靶向的功能;螺环的稳定性大大降低了探针Si RB-Cu在溶酶体中的检测背景,提高了检测灵敏度。探针Si RB-Cu实现了活细胞溶酶体内外源性和内源性Cu~(2+)的近红外荧光成像。2、具有溶酶体靶向功能的硅基罗丹明NO近红外荧光探针作为一种重要的信使分子,NO在溶酶体中的作用与许多病理生理过程有关。利用邻苯二胺基团作为NO的反应识别位点,我们合成得到了基于螺环开环原理的硅基罗丹明NO探针Si RB-NO;通过偶联反应引入吗啉结构,作为溶酶体靶向基团,合成得到具有溶酶体靶向功能的NO近红外荧光探针Lyso-Si RB-NO。探针Lyso-Si RB-NO具有一系列H+相关的性质:对H+较强的耐受性、H+能够促进探针对NO的识别、H+能够抑制荧光产物的水解、H+能够使水解产物Lyso-Si RB的荧光增强等。探针Lyso-Si RB-NO以极低的荧光背景、较高的灵敏度、较好的选择性和较好的时空分辨率分别实现了细胞溶酶体内NO的近红外荧光成像。与具有相应结构的罗丹明探针相比,硅基罗丹明探针Si RB-Cu和Lyso-Si RB-NO在细胞溶酶体成像中的成功应用,证明了硅基罗丹明分子中螺环的特殊性质可以成功的用于功能化近红外荧光探针的开发中。总之,我们成功建立了基于硅基罗丹明的近红外荧光成像平台。通过对合成方法学的研究和对基于硅基罗丹明功能化近红外荧光探针的开发,我们证实了硅基罗丹明近红外荧光成像平台在设计功能化生物成像探针上强大的创造性,有利于硅基罗丹明在生物成像领域的应用。
吴庐陵[9]2017年在《新型细胞微环境检测荧光探针的设计、合成和应用》文中认为基于半菁染料,荧光碳点为荧光母体,设计、制备了叁种高选择性荧光探针。利用分子内电荷转移效应(ICT),细胞内吞和靶向基团实现了环境中和和活细胞内微环境的定性、定量检测。(1)由于传统的p H计不能很好地应用在微环境如亚细胞器和复杂生物体系中的p H值动态和精确定量检测。因此迫切需要研究可监测复杂多变生物体系中p H值变化且具有高灵敏度的p H值响应分子探针。基于半菁染料合成了一种比色和荧光双模态检测p H的比率型分子探针CPH。CPH的具有合适的p Ka(6.44),使其可以聚集在溶酶体内成为靶向溶酶体的探针。CPH可监测经抗疟疾药氯喹刺激He La细胞后溶酶体内p H值的变化。将CPH固载在试纸上,可实现对环境中酸性和碱性蒸汽的可逆、动态、裸眼检测。这一概念验证展现出CPH作为检测溶酶体内p H变化的分子工具的潜在应用,同时提供了一种经济、可重复和快速对酸碱蒸汽的光学p H探针。(2)溶酶体是酸性囊状结构的细胞器,其膜内含有大量酶和蛋白质,p H值是4.5-5.5。因此,发展通过可视化荧光信号用于溶酶体标记和成像对理解与溶酶体功能紊乱相关的病理学显得尤为重要。首次设计、制备了基于荧光碳点用于标记溶酶体的纳米探针CDs-PEI-ML。该探针具有良好的水溶性和光稳定性。我们推测其成像原理是该纳米探针先通过内吞进入He La细胞,再通过吗啉基团使其聚集在溶酶体内。(3)基于半菁骨架,我们发展了一种比率型溶酶体探针CPY。该探针具有优良的溶酶体靶向性。利用该探针揭示出溶酶体的p H会随着热刺激而升高,且这个过程在短时间内是不可逆的。
李蒙蒙[10]2015年在《新型生物荧光/磷光分子探针的开发与应用》文中进行了进一步梳理荧光/磷光分析法由于具有灵敏度高、选择性强、取样量少、简便快捷、可实时原位监测等优点,被广泛用于生物体或环境样品中金属离子、生物小分子和大分子的传感,以及生物细胞、组织的成像分析中。设计高灵敏度和选择性的荧光/磷光探针分子是该分析方法的关键技术,进一步提高其生物相容性和靶向性是目前开发新型生物荧光/磷光分子探针面临的重大挑战。因此,本论文从分子设计和剪裁角度出发,旨在开发对于某种生物活性物种具有特定响应的新型荧光/磷光分子探针,优化建立相应定性或定量分析体系,探讨其在农产品和环境监测以及肿瘤诊疗中应用的可行性。本论文共四章,主要内容如下:第一章,绪论。主要介绍了荧光/磷光的基本概念、荧光/磷光分析法的优势、荧光/磷光分子探针的设计原理与类型以及荧光/磷光分子探针在生物大分子检测、金属离子检测、细胞内金属离子识别与显微荧光成像以及疾病诊断中的应用。第二章,绿色环保型镁离子荧光分子探针的开发与应用。以天然蒽醌类中草药活性成分大黄素和大黄酸为目标化合物,通过条件优化(溶剂、缓冲溶液、pH值等),分别建立了两种Mg2+荧光定量分析新体系(大黄素:检测范围0~1.05×10-5 mol/L,相关系数0.992,检测限(S/N=2)3.0×10-7 mol/L;大黄酸:检测范围0~2.1×10-5 mol/L,相关系数0.998,检测限(S/N=3)5.52×10-7 mol/L。通过Job法确定络合比、连续滴定分析计算络合常数以及合成金属配合物进行结构测定等途径,建立了大黄素-Mg2+和大黄酸-Mg2+金属配合物分子结构与光物理性质之间的构效关系。对比研究结果表明大黄酸体系对Mg2+具有高的选择性,受化学环境影响小,适用范围广泛,且对实际样品的测定结果与标准原子吸收方法相一致,证实了大黄酸作为Mg2+荧光分子探针的实用性。第叁章,新型Zn2+磷光分子探针的设计、合成及其多通道传感行为研究。设计合成了一个含有苯胺二聚体电子给体和叁联吡啶(TPY)受体的环金属化铂(II)苯乙炔配合物,利用核磁、质谱、XRD等手段表征其分子结构和纯度,考察其对不同金属离子的紫外可见吸收光谱和荧光发射光谱的响应情况,发现了其独特的H+-触发、Zn2+-增强和OH--淬灭发光特性,证实了其在酸性溶液中对Zn2+的选择性磷光增强效应,阐明了其多通道传感作用机制,预示着其可以作为Zn2+磷光分子探针用于生物和环境样品分析。第四章,基于生物素-亲和素系统(BAS)制备红色磷光蛋白及其在肺癌细胞A549靶向成像中的应用。通过六步化学反应合成了生物素化二联吡啶-Ru(II)配合物,并利用生物素和亲和素之间特异性相互作用,采用超过滤和冷冻干燥技术,获得了具有良好生物相容性的红色磷光Ru(II)配合物标记AV蛋白。通过HABA实验和连续滴定发射光谱分析,证实了红光蛋白中配合物和亲和素的结合比例为2:1。活细胞荧光成像实验初步证实了红光蛋白对肺癌细胞A549具有特异性的相互作用,能选择性穿透细胞膜富集于细胞质中。同时,小的细胞毒性和优良的抗光漂白性能,进一步预示着该红光蛋白作为复合型生物磷光分子探针在肿瘤细胞靶向成像中应用的诱人前景。
参考文献：
[1]. 靶向性细胞Ca～（2+）荧光探针的合成及其应用[D]. 贾宏瑛. 陕西师范大学. 2004
[2]. 新型Ca~（2+）荧光探针的设计、合成及胞内信使作用研究[D]. 贺怀贞. 西北大学. 2009
[3]. 新型细胞Ca～(2+)荧光探针的合成及在生命科学研究中的应用[D]. 张小玲. 西北大学. 2002
[4]. 纳米氧化铈的合成修饰及其在辐射防护与肿瘤光动力学治疗中的应用研究[D]. 李宏. 第叁军医大学. 2017
[5]. 新型荧光素类细胞Ca~（2+）荧光探针的设计合成及在细胞信号转导中的应用研究[D]. 韩洁. 西北大学. 2008
[6]. 氧杂蒽和二氢卟吩类荧光染料的合成及其性质研究[D]. 吴静. 西南交通大学. 2018
[7]. 新型细胞Ca～（2+）荧光探针的设计合成研究[D]. 王永祥. 陕西师范大学. 2006
[8]. 近红外硅基罗丹明—合成方法学及荧光探针的构建与成像研究[D]. 王保刚. 第二军医大学. 2016
[9]. 新型细胞微环境检测荧光探针的设计、合成和应用[D]. 吴庐陵. 上海师范大学. 2017
[10]. 新型生物荧光/磷光分子探针的开发与应用[D]. 李蒙蒙. 南阳师范学院. 2015
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