（1遵义医学院附属医院甲乳外科 贵州 遵义 563003）
（2遵义医学院附属医院病理科 贵州 遵义 563003）
【摘要】 目的：通过抑制E钙粘蛋白（E-cadherin）的表达，研究其是否调控乳腺癌细胞凋亡。方法：向乳腺癌细胞株MCF-7转染E-cadherin siRNA并应用实时聚合酶链反应（real-time polymerase chain reaction，RT-PCR）及Western Blot验证siRNA的效果。CCK-8实验研究E-cadherin siRNA对MCF-7药物敏感性的影响。Annexin-V实验研究E-cadherin siRNA对MCF-7凋亡的影响。Western Blot研究E-cadherin siRNA对凋亡相关蛋白表达的影响。结果：RT-PCR证明，转染E-cadherin siRNA的实验组MCF-7细胞中的E-cadherin mRNA表达量较转染negative control组的阴性对照组明显减低。Western Blot证明，实验组MCF-7中的E-cadherin蛋白表达量较阴性对照组减低。CCK-8实验发现实验组的MCF-7对化疗药物的敏感性低于阴性对照组。Annexin-V实验提示实验组MCF-7凋亡率较阴性对照组降低。转染E-cadherin siRNA后MCF-7中死亡受体4（death recptor 4，DR4）蛋白的表达量低于阴性对照组。结论：在MCF-7中，E-cadherin siRNA能通过抑制DR4的表达，进而抑制癌细胞的凋亡。
【关键词】 乳腺癌；E钙粘蛋白；凋亡；远处转移
【中图分类号】R737.9 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）32-0127-02
对于晚期乳腺癌患者，耐药和远处转移严重影响化疗的疗效[1]。肿瘤远处转移过程中的转移灶及发生转移的细胞常出现抗凋亡及耐药。同时，肿瘤细胞会发生细胞表面黏附蛋白的改变。这些黏附蛋白的缺失是否参与晚期乳腺癌的耐药及抗凋亡。
肿瘤细胞的远处转移及凋亡已进行了大量的研究。但目前对于二者之间关系的研究尚不多。而文章之所以决定探索乳腺癌细胞黏附蛋白和凋亡之间的关系。是因为，大量的研究证明肿瘤细胞表面黏附蛋白的缺失预示着乳腺癌患者的耐药，这些蛋白可能参与了恶性肿瘤的凋亡[2]。本研究通过抑制肿瘤细胞表面黏附蛋白的表达，研究其与凋亡之间的关系。
1.资料与方法
1.1 一般资料
PCR试剂盒（Takara公司）；E-cadherin siRNA及对照（瑞博公司）、Lipo iMAX转染试剂（Invitrogen公司）；CCK-8试剂盒（Dojindo公司）；Annexin-V凋亡试剂盒（凯基公司）；蛋白抗体（Abcam公司）。E-cadherin引物：正义链：5’-AAGGTTCACCCAGCACCTTGCA-3’；反义链：5’-GGCAGAGGGACACACCAGTGTA-3’。GAPDH引物：正义链：5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’；反义链：5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’。乳腺癌细胞株MCF-7在DMEM培养基中加入10%胎牛血清，于37℃、5% CO2恒温细胞培养箱内培养。
1.2 细胞转染
MCF-7使用Lipo iMax和E-cadherin siRNA或者negative control共培养12h后更换培养基，48h后提取RNA并检测E-cadherin mRNA表达量，72h后提取蛋白并检测蛋白表达量。
1.3 RT-PCR
Trizol试剂提取总RNA，Takara RT反应液，进行反转录。使用Takara mRNA qRT-PCR反应液，以GAPDH mRNA为内参，荧光定量PCR仪进行定量。根据Ct值计算表达量。
1.4 Western Blot
细胞以蛋白裂解液裂解，离心后取蛋白液，测浓度。取等量蛋白液进行凝胶电泳后转膜，经封闭后加入相应一抗，孵育二抗。将蛋白条带置于GE自动曝光机曝光，进行灰度分析。
1.5 CCK-8实验
MCF-7种入96孔板，转染后，培养基中加入0.2μg/ml阿霉素。24小时后，加入CCK-8溶液，避光培养1.5h后，应用酶标仪在450nm波长下检测各孔吸光值。
1.6 Annexin-V实验
MCF-7种入6孔板，转染后，加入0.2μg/ml阿霉素。24小时后，消化并收集细胞。加入FITC染料，再加入PI染料，混合，充分反应，流式细胞仪检查细胞凋亡率。
1.7 统计方法
结果采用t检验或成组设计的方差分析进行分析。所有资料均在SPSS17.0软件下进行操作。P＜0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 E-cadherin siRNA抑制E-cadherin在MCF-7中的表达
MCF-7转染E-cadherin siRNA或negative control后，RT-PCR结果提示：实验组的E-cadherin mRNA的表达低于阴性对照组（P＜0.01）。Western Blot结果提示：实验组的E-cadherin蛋白的表达量低于阴性对照组（P＜0.01）。
2.2 E-cadherin siRNA能降低MCF-7对阿霉素的敏感性
在MCF-7养基中加入阿霉素，通过CCK-8实验，我们观察到转染E-cadherin siRNA后，MCF-7对阿霉素的敏感性降低（P＜0.001）。
2.3 E-cadherin siRNA抑制MCF-7的凋亡
在MCF-7培养集中加入阿霉素诱导凋亡，Anexin-V实验证明E-cadherin siRNA抑制细胞的凋亡（P＜0.01）。
2.4 E-cadherin siRNA抑制MCF-7中DR4的表达
MCF-7细胞转染后，Western Blot实验结果提示：转染E-cadherin siRNA的实验组的DR4蛋白表达量低于阴性对照组（P＜0.01）。
3.讨论
晚期乳腺癌患者经常会对化疗耐药，同时可出现远处转移。肿瘤细胞的远处转移和耐药或抗凋亡是否有相关联系？目前已有文献报道肿瘤细胞远处转移与凋亡之间有一定的关系 [3]。在远处转移过程中，肿瘤细胞获得了侵袭、抗凋亡和降解细胞外基质的能力。肿瘤细胞在发生远处转移的同时往往获得了抗凋亡的特性。
远处转移过程中伴有细胞黏附分子（如E-cadherin）表达的减少[4]。E-cadherin在乳腺癌中是否参与调控细胞的凋亡目前鲜有报道。本实验中，我们应用E-cadherin siRNA，在抑制MCF-7的E-cadherin表达后，加入阿霉素，我们发现细胞的药物敏感性及凋亡率均明显降低。可见，E-cadherin可能参与了细胞的凋亡。
研究发现，细胞凋亡相关蛋白DR4在上皮来源的肿瘤中的表达丰富，并在诱导肿瘤细胞凋亡的过程中有着重要作用[5]。有文献报道，在肿瘤细胞远处过程中，DR4的表达会下降，同时细胞出现抗凋亡[5]。本实验发现在抑制上皮来源的MCF-7的E-cadherin表达后，DR4的表达明显下调。因此，我们认为E-cadherin可能通过调控DR4的表达，而参与调控细胞凋亡。E-cadherin与DR4之间的相互的作用机制，仍需进一步研究。
本研究中，我们发现通过E-cadherin siRNA抑制MCF-7中E-cadherin的表达，能降低乳腺癌细胞对化疗的敏感性及凋亡率。E-cadherin抑制细胞凋亡的作用可能与其抑制DR4的表达有关。
图4 Western Blot结果提示实验组细胞较阴性对照组细胞E-cadherin
及DR4蛋白的表达量明显降低（P＜0.01）
【参考文献】
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论文作者:朱晓峰1,曾丽莉2,冯国丽1,罗迆1,张淇1,方小
论文发表刊物:《医药前沿》2017年11月第32期
论文发表时间:2017/11/8
标签：细胞论文; 凋亡论文; 转染论文; 蛋白论文; 实验组论文; 阴性论文; 肿瘤论文; 《医药前沿》2017年11月第32期论文;