吴宝金[1]2004年在《ENU诱导小鼠突变及对部分突变基因的定位克隆》文中研究指明随着人类基因组计划的完成，生命科学进入一个大规模、系统性研究基因功能的后基因组时代。小鼠(Mus musculus，mouse)因其与人类的基因组序列、生化代谢及生理特点的相似性而成为研究人类基因功能最理想的模式动物。“表型驱动法”则是当前功能基因研究的主要策略之一。研究者用ENU(乙酰基亚硝基脲)诱导小鼠突变建立新的突变系动物，再通过对突变系动物的深入研究定位并克隆相应的突变基因，从而推测某一基因的功能。该方法是建立人类疾病的动物模型、研究功能基因比较有前景的手段和捷径。本研究通过对近万只小鼠的筛查及遗传试验，获得14种突变系小鼠，并采用微卫星标记进行全基因组扫描将6种白斑突变基因成功定位，最后通过位置候选法克隆了4种白斑突变基因，鉴定出2种突变小鼠的碱基变化。我们的工作分四个部分： 一、ENU诱变获得14种突变系小鼠 采用8～10周龄的雄性C57BL／6(B6)小鼠136只(G0)，腹腔注射ENU100mg／Kg，每周一次共2～4次，待雄鼠恢复生殖能力后与同品系母鼠配种，在后代小鼠中(G0)针对可见表型及血液生化指标等筛查突变个体。一共筛查G1小鼠4009只，获得突变小鼠262只，突变率约6.5％，具体包括眼异常124只、牙齿异常25只、白斑42只、矮小18只、血生化指标异常20只及其他异常33只。将突变小鼠与同品系小鼠回交进行遗传试验，在成功进行遗传试验的193只G1小鼠中，14只小鼠的突变表型表现为显性遗传。它们的编号及主要特征如下：B6-24白斑、B6-136、B6-312、B6-980、B6-1244、B6-1866及B6-2952都表现为不同程度的肢端、尾端及腹部皮肤白化，B6-3499为双角膜浑浊，它们都为单基因显性遗传，外显率100％；B6-24表现为虹膜缺损，为单基因显性遗传，外显率扬州大学博士学位论文约85%;B6一343、B6一1铆、_B夸绮字争种均表现为角膜混浊，B6一126为矮小，B6一29卷尾表现为尾巴酮程度弯断_挤几种小秒遗传鲜尚待确定。7种白斑突变小鼠是人类“花斑马”白斑病、B6一24是人类虹膜缺损、4种角膜浑浊小鼠是先天性角膜变性、B6一126是研究矮小、B6一29弯尾是研究发育的极好模型。这些模型可以用于致病机理的研究及相一关疾病治疗药物的筛选，同时也是研究突变基因功能的好材料。二、小鼠基因组阳个微卫星标记体系的建立 及对6种小鼠品系的检测 本研究选择平均分布小鼠基因组且在B石及DBA(D2)间有多态性的微卫星39个:DIMit372、DIMit84、DIMit273、DZMit6、DZMit17、DZMit528、D3Mit268、D3Mit15、D4Mit17、D4Mi巧4、DSMit352、DSMit168、D6Mit274、D6Mit339、D7Mit246、D7Mit333、DSMit4、DSMit3加、DgMit325、DgMit243、 D10Mit3、D10Mit73、DllMit163、DllMit258、D12Mit136、D12Mit17、D13Mit18、D13Mit262、D 14Mit5O、D14Mit205、D15Mit226、D15Mit34、D16Mit189、D16Mit100、D17Mit33、D17Mit39、D18Mit52、D19Mit128、D19Mit33。采用“梯度法”探索了它们的PCR条件，同时，利用这些微卫星引物对本中心的B6、BALB/c、DBA、CBA、FVB、ICR及上海B6、BALB/c共6个品系(8组)进行遗传背景检测，每组采用10只个体，提取鼠尾DNA并混合成DNA池，用微卫星引物扩增后经12%PAGE电泳，观察、比较种系纯度。结某显示，’:，J、一鼠微卫星的扩增条件差异很大，M广浓度多数在1.smmol/L左右，退火温度多数为59℃。本中心与上海种子中心的B6、DBA、BALB/c在39个位点上都是纯合的，其余品系有1~3个杂合位点，.但BALB/c在DSMit168、DSMit32O及D13Mit262叁个位点，DZ在D14Mit205位点与数据库记录有差异。我们的研究表明:①在遗传背景的检测中，微卫星较生化位点更有优势，但需要深入开展这方面的研究;②本文选择的39个标记在B6和DZ间都有明显的多态性，而且这两个品系的39个微卫星位点全部是纯合的，符合我们对突变基因定位的需要。叁、对7种白斑突变小鼠突变基因的染色体定位本实验繁殖〕种(B6一136，B6一312，B6一980，B6一1244，B6一1866，B602952吴宝金:ENU诱导小鼠突变及对部分突变墓因的定位克隆及B6一24白斑)白斑突变基因纯合子小鼠及定位用B6DZFI、F2[B6DZFI X DZ』小鼠，发现B6一136、B6一312及B6一1866突变基因纯合子有致死效应，B6一1244、B6一2952及B6一24白斑突变基因纯合子为白毛黑眼，B6一980突变基因纯合子表型需进一步确定;B6一312及B6一1866突变表型在Fl、F:中没有变化，B6一980突变表型消失，其余仅表现为尾端白化，但尚可分辨。针对能够分辨表型的6种白斑F:小鼠，利用39个微卫星标记系统，进行全基因组扫描。B6一312经19个微卫星位点的连锁分析后，发现其与DSMit352的LOD值为4.47，确定连锁;随后扩大B6一312的FZ至537只，选择突变基因附近的微卫星DSMit356、DSMit308进行连锁分析，将突变基因定位在两者之间，距着丝粒约42.19cM。再用DSMit356检测其它突变，发现B6一1244、B6一2952及B6一 1866也位于相同位置。采用同样的全基因组扫描策略，将B6一136突变基因定位于1号染色体DIMit300附近，距着丝粒约41.6cM处;将B6一24白斑突变基因定位于10号染色体D10Mit7O附近，距着丝粒约57.9
卢增兰[2]2012年在《ENU诱导小鼠突变及对一种白斑突变基因的定位鉴定》文中研究说明乙基亚硝基脲(即ENU)诱变是表型驱动法研究基因功能的重要手段。本实验室开展了一定规模的小鼠ENU诱变实验,培育了9个突变系小鼠,并采用基因组扫描及位置候选策略,对一种白斑突变基因Kitl-2Bao进行了染色体定位及鉴定。具体工作如下：1.利用ENU处理C57BL/6J(B6)成年雄鼠123(G0代)只,与同品系雌鼠配种繁殖3048只G1代小鼠,经筛查获得表型异常小鼠154只。将所有存活的G1代突变小鼠分别与正常B6交配,观察后代是否有亲代的异常表型,获得9种突变系小鼠：5种白斑、1种卷尾、3种眼睛异常。其中,504#号突变小鼠表现为腹部白斑、尾端及四肢端白化,遗传模式为单基因显性,外显率100%,该突变系小鼠被命名为Kitl-2Bao。2.以Kitl-2Bao白斑突变小鼠为研究对象,利用连锁分析法对突变基因进行染色体定位,发现其与D10Mit70之间的LOD值为7.08,确定连锁,进一步将该突变基因定位在第10号染色体距着丝粒47.06cM到54.72cM之间。根据表型特征及小鼠基因组信息,确认白斑候选基因为Kitl。随后设计引物,RT-PCR扩增Kitl基因的mRNA,测序发现Kitl基因ORF第697位碱基由G转换为T,造成相应氨基酸G不能合成。本实验培育的突变系小鼠可望开发成为数种人类疾病模型；对Kitl-2Bao的工作不仅确认了一种新的人类斑驳病模型,而且丰富了小鼠遗传图,为Kitl基因的功能研究打下坚实基础。
陈兵[3]2012年在《ENU诱变瞳孔散大小鼠模型的分子机制与遗传特性研究》文中研究表明乙烷亚硝基脲(ethylnitrosourea, ENU)是一种能够引起基因高效突变的烷化剂,通过使用ENU诱导小鼠突变的手段,经过筛选可获得大量具有突变表型的G1代小鼠,用于基因功能的研究及人类疾病动物模型的建立。通过ENU诱导小鼠突变,我们获得一种瞳孔散大小鼠,研究发现该突变表型是由Nrg1基因突变引起,药理及免疫组化实验表明该突变导致小鼠瞳孔括约肌上M受体减少。该小鼠被命名为NrglmlYzcm (neuregulin1; mutation l,Yangzhou University Comparative Medicine Center, hereafter Dp1)。遗传实验表明突变杂合子小鼠瞳孔散大表型外显率极低,而纯合子小鼠外显率为100%。本研究工作分为以下五个部分：1ENU诱变获得一种瞳孔散大小鼠通过ENU诱导小鼠突变手段获得一种瞳孔部分散大杂合子小鼠,当用光线照射小鼠眼球时,该小鼠瞳孔对光线无明显反射现象(无明显收缩)。将瞳孔散大杂合子小鼠与正常B6小鼠配种后共观察并记录115只后代小鼠,其中3只小鼠出现单侧且部分瞳孔散大表型；将瞳孔散大杂合子互交,观察并记录34只后代,共有5只后代小鼠表现为瞳孔散大表型,其中1只小鼠表现为单侧且部分瞳孔散大表型,4只小鼠表现为双侧且严重瞳孔散大表型；4只双侧且严重瞳孔散大表型小鼠互交后代全部表现为瞳孔散大表型。2瞳孔散大突变基因的定位在初步染色体定位过程中,采用B6背景瞳孔散大突变小鼠与C3H或D2小鼠配种获得的F1代小鼠,并将F1代小鼠与B6背景野生型小鼠回交获得的N2代突变小鼠配种方案繁殖用于定位小鼠。定位结果发现在25个N2瞳孔散大小鼠样品中突变基因与微卫星D8mit171(距着丝粒11.43cM)和D8mit4(距着丝粒18.89cM)均未发生交换,从而确定该突变基因位于小鼠第8号染色体D8mit171和D8mit4之间(或附近)。另外突变基因与其他染色体上所选微卫星均无明显连锁。由于以上配种方案获得具有突变表型的N2代小鼠的外显率极低。在精确定位过程中改用将瞳孔散大突变小鼠与D2或C3H小鼠配种得到F1代,再将Fl代小鼠互交获得F2代突变小鼠方案进行定位。结果共获得118只F2代突变小鼠,最终将瞳孔散大突变基因定位于遗传标记rs32829041(单核苷酸多态性标记)与D8Mit4之间,两标记间距离约1.52Mb。在此区间目前已报道Dusp26, Rnfl22, BC019943, Mak16, Fut10,7420700N18Rik, Snord13,Mir1186, Nrg1共9种基因,但无相关基因突变引起瞳孔散大异常表型的相关报道。3瞳孔散大突变基因的克隆与序列分析对上述9种基因分别进行测序分析。序列比对结果显示Dusp26、Mir1186、 Rnf122、Snordl3、BC019943、Mak16、Fut10、7420700N18Rik序列与数据库或本中心B6小鼠相应基因序列一致,基本排除这些基因的突变引起Dp1小鼠瞳孔散大表型的可能。在对Nrg1基因测序分析后发现在Nrg1外显子E59(该外显子编码NRG1蛋白EGFβ结构域)后第5个碱基处发生G到A的转换。由于瞳孔散大小鼠G到A的碱基突变位于mRNA剪接供体位点,推测该突变可能影响剪接体对该位点剪接能力,从而引起Dp1小鼠瞳孔散大表型。为了证实以上设想,设计分别扩增Ig及CRD型Nrg1局部序列的引物(扩增区域包含突变位点)。通过RT-PCR方法,分别从瞳孔散大及野生型B6小鼠脑组织总RNA中扩增相应片段,RT-PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳。电泳结果显示对瞳孔散大及野生型B6小鼠Ig及CRD型Nrg1基因分别扩增出3个条带(band a、band b、band c)。其中band b对应于β1-type EGF Nrgl,该类型Nrgl在大脑中高度表达。定量分析结果表明与野生型小鼠相比突变纯合子小鼠Nrg1的CRD及Ig型Nrg1中band b基因表达量仅分别为野生型小鼠的42.6%和32.8%。对野生型B6和瞳孔散大小鼠Ig型及CRD型条带a直接测序表明：野生型B6和瞳孔散大小鼠Ig型及CRD型4种a条带测序信号图都出现明显的重迭信号。对野生型B6小鼠Ig型及CRD型b条带直接测序表明：所测序列测序信号无明显重迭,序列分别对应于CRD-β1和Ig-β1Nrg1基因序列,而对瞳孔散大小鼠Ig型及CRD型条带b测序都出现明显的重迭信号。对野生型B6和瞳孔散大小鼠Ig型及CRD型c条带测序结果表明：1)野生型B6和瞳孔散大小鼠Ig型c带序列一致,野生型B6和瞳孔散大小鼠CRD型c带序列一致；2)与对应野生型B6小鼠b条带相比c条带缺少外显子E59和E24对应序列共83个碱基,该转录产物目前尚未有文献报道。将以上RT-PCR产物直接测序出现重迭信号的条带进行T-A克隆后进一步测序分析,结果显示：所有所测序的野生型B6克隆的mRNA模板在剪接过程中,剪接体在外显子E59后发生剪接；而由于G到A碱基突变,削弱剪接体对该剪接位点的剪接能力,从而绝大多数测序的严重瞳孔散大小鼠克隆的mRNA模板在剪接过程中,剪接体未对紧接外显子E59后的剪接位点进行剪接,部分克隆序列显示剪接体对其他潜在的剪接位点进行了剪接。所以在测序的克隆中存在部分克隆不包含外显子E59、部分克隆存在正常情况下尚未检测到得“异常”剪接所产生的外显子、剪接体跳过紧接外显子E59后剪接位点而对其后潜在的剪接位点进行剪接等结果。蛋白预测表明突变引起部分EGFβ-type Nrg1蛋白的减少,并被部分EGF a-type Nrg1蛋白代替。4Nrg1基因突变对瞳孔括约肌毒蕈碱受体表达的影响单独使用毛果芸香碱眼药水滴眼后,瞳孔散大纯合子及瞳孔部分散大杂合子小鼠瞳孔大小无明显变化。单独使用新斯的明或与毛果芸香碱联合对瞳孔散大纯合子滴眼后,瞳孔散大纯合子小鼠瞳孔大小无明显变化。毛果芸香碱、新斯的明腹腔注射后,瞳孔散大纯合子小鼠瞳孔大小无明显变化,但注射后小鼠出现较严重的流涎及轻度流泪反应。阿托品腹腔注射瞳孔部分散大杂合子小鼠后,小鼠瞳孔出现完全散大表型。以上结果显示,瞳孔散大小鼠括约肌上M受体可能减少,且杂合子小鼠M受体比纯合子数量多,其M受体经过阿托品的封闭后,使得肌肉不能收缩。肌肉收缩程度在一定范围内与神经递质(配体)与受体数量有关。过量的神经递质,但有限的受体同样不能使瞳孔散大杂合子小鼠括约肌完全收缩。胆碱型受体可分为烟碱型受体(Nicotinic Acetylcholine receptor,N受体)和毒蕈碱型受体(Muscarinic Acetylcholine receptor,M受体)两大类。M受体分为M1-M5五个亚型,括约肌上受体属于M受体且其中以M3受体为主,M3基因敲除小鼠表现为部分瞳孔散大表型。文献报道Nrg1对神经-骨骼肌接头处骨骼肌表面N受体具有聚集作用。为进一步验证瞳孔散大小鼠瞳孔括约肌上M受体减少的可能,使用免疫组化技术对括约肌上M3受体进行分析,结果显示与野生型小鼠相比Dp1/Dp1小鼠瞳孔括约肌上M3受体分布明显减少。5瞳孔散大小鼠模型的遗传特性在使用酶切进行基因分型基础上,将Nrg1突变杂合子(Dp1/+)互交,Nrg1突变纯合子(Dp1/Dp1)与突变杂合子(Dp1/+)配种,将Nrg1突变纯合子(Dp1/Dp1)与野生型小鼠(+/+)配种,将Nrg1突变纯合子(Dp1/Dp1)互交,分别记录后代正常与瞳孔散大表型小鼠的数目(包括散大严重程度)及对应的基因型。结果表明所有突变纯合子小鼠表现为瞳孔散大表型,而杂合子小鼠瞳孔散大表型外显率极低(5/111)。另外Dpl/+×Dp1/+配种后代小鼠基因型Dp1/Dp1:Dp1/+:+/+为16：63：29,与孟德尔遗传理论比1：2：1不符(0.01 耿滕[4]2015年在《ENU诱变小眼畸形小鼠模型的分子机制研究》文中研究表明乙烷基亚硝基脲(Ethylnitrosourea, ENU)是一种人工合成的能导致多种生物体发生随机、单碱基突变的化合物。ENU能不依赖于任何代谢过程,而通过烷化反应将其乙烷基加入DNA碱基的部分基团,从而引起碱基配对错误,在较短时间内诱导小鼠产生大量随机突变表型。采用ENU诱变手段,本实验室得一种常染色体显性小眼畸形小鼠,该突变小鼠表现为一侧或双侧小眼畸形,且严重程度不一,该小鼠突变纯合子表现为出生时无眼且很快死亡。本研究以该突变系小鼠为研究对象,从以下叁个部分开展研究工作：1 ENU诱变获得一例小眼小鼠通过ENU诱变,在G1代小鼠中筛查发现了小眼表型的小鼠, 将其中一例小眼畸形C57BL/6(B6)雄性小鼠与正常B6雌鼠合笼,获得B6背景的杂合子小鼠,观察并记录100只后代中,其-中23只小鼠具有小眼表型。将B6背景杂合子小鼠与DBA(D2)小鼠配种获得F1代小鼠,F1代小鼠回交B6得到N2代小鼠,记录的561只N2代小鼠中有21只表现为小眼表型。2小眼突变基因的定位及鉴定为了定位该突变基因,将(B6-D2)F1突变杂合子小鼠回交B6获得N2代小鼠,提取N2代小鼠的鼠尾DNA,利用微卫星对突变小鼠的染色体进行全基因组扫描。定位结果表明在44个样品中突变基因与微卫星D18mit124与D18mit184之间未发生一例交换,最终将突变基因定位于微卫星D18mit124与D18mit184之间。通过对局部区域基因功能分析,初步判定RAX基因为本突变候选基因。设计扩增针对RAX基因编码区引物,对野生型及小眼小鼠DNA进行PCR扩增。产物回收后进行测序比对,结果显示突变小鼠RAX基因编码第559位碱处发生C到T的转换,导致编码区第187位密码子CGA(编码精氨酸)变为终止密码子TGA,引起蛋白编码提前终止。3 R187X无义突变对RAX蛋白功能影响分析RT-PCR扩增野生型及突变纯合子小鼠RAX基因,将其克隆到pMD19-T载体上,然后再亚克隆到pCMV-tag2B真核表达载体,分别命名为pCMV-tag2B-wRAX、 pCMV-tag2B-mRAX。用脂质体2000将以上重组载体转染于COS-7细胞,分别用于后续的间接免疫荧光、PI染色以及EMSA实验。间接免疫荧光及PI染色结果显示正常及突变RAX蛋白都定位于细胞核,故排除R187X突变对RAX蛋白核定位的影响。EMSA实验结果显示R187X无义突变影响RAX蛋白与相关DNA序列结合,从而导致小鼠小眼表型。 倪俊达[5]2015年在《角膜混浊小鼠模型获得及其分子基础研究》文中研究表明乙烷基亚硝基脲(ENU)是一种人工合成的高效基因诱变剂,通过ENU诱导小鼠可获得大量的人类疾病动物模型,用于研究相关疾病的发生、发展机制以及对突变基因的功能研究。本文通过ENU诱变技术获得一例角膜混浊小鼠模型,并对其突变基因进行成功定位与鉴定,现汇报如下：1、ENU诱变获得一例角膜混浊小鼠模型ENU腹腔注射40只雄性C57BL/6J(B6)小鼠,待其恢复生殖能力后与同品系雌鼠配种,并对其后代进行筛选,获得多趾、小眼、短尾、瞳孔散大、角膜混浊等异常表型小鼠。本文以其中一例角膜混浊小鼠为研究对象,将该小鼠与正常B6小鼠配种,观察并记录63只后代,其中15只小鼠具有角膜混浊表型。组织学分析角膜混浊小鼠眼球发现,突变小鼠角膜基质层可见明显的新生血管,成纤维细胞明显增多,角膜上皮出现明显的角质层且通透性增加。2、角膜混浊小鼠突变基因的定位将B6背景角膜混浊小鼠与DBA(D2)小鼠配种获得F1代小鼠,再将F1代小鼠继续回交野生型B6小鼠获得[(B6×D2)F1×xB6]N2代小鼠。筛选F1突变杂合子所生N2代小鼠612只,其中26只小鼠携带角膜混浊表型。突变基因连锁分析结果显示,突变基因与微卫星D12Mit285连锁(LOD值3.78),初步将该基因定位于12号染色体上。在此基础上继续选择可用的微卫星对该突变基因进行精确定位,最终将该突变基因定位于12号染色体9.04cM之内。3、角膜混浊小鼠突变基因的鉴定通过对突变基因定位区域内逐个基因功能的分析,发现与眼球发育相关4个候选基因：mycn、adam17、sdc1、osr1,故分别PCR或RT-PCR扩增候选目的基因,切胶回收后测序,将以上测序结果与本中心野生型B6小鼠基因序列进行对比,筛查突变位点。序列比对结果显示在mycn基因编码区1217bp处发生T到C的转换,导致MYCN蛋白编码区第406位氨基酸发生由V(缬氨酸)到A(丙氨酸)突变,该突变位于MYCN蛋白螺旋-环-螺旋结构域(bHLH)。结论：本文获得一例角膜病小鼠模型,为相关疾病的研究提供动物模型。首次发现mycn基因突变可引起小鼠角膜混浊表型,但其机制不明,深入研究将丰富对mycn基因生物学功能的了解。 陈兵[6]2005年在《瞳孔异位与白斑两种突变小鼠的基因定位和白斑候选基因的序列分析》文中研究说明B6-24~(?)瞳孔异位小鼠是本实验室采用乙烷基亚硝基脲(ENU)诱变获得的一种突变系,在对其保种繁殖过程中分化出B6-24~(?)白斑突变系小鼠。本研究以这两种突变系小鼠为对象,对它们的突变基因进行染色体定位,并在分子水平上鉴定出B6-24~(?)白斑突变的基因型。我们的工作分两个部分: 一、两例突变系小鼠突变基因的染色体定位 以本中心C57BL/6J(B6)背景的ENU诱变获得的B6-24~(?)瞳孔异位小鼠与B6-24~(?)白斑小鼠为研究对象,将B6-24~(?)瞳孔异位突变杂合子小鼠(m/+)与背景品系(B6)回交得到105只后代小鼠,其中具有突变表型的有45只(x~2=1.08,0.25 糜婷[7]2014年在《ENU诱变巨结肠小鼠模型的分子机制研究》文中进行了进一步梳理乙烷基亚硝基脲(Ethylnitrosourea,ENU)是一种人工合成的能导致多种生物体发生随机、单碱基突变的化合物。ENU能不依赖于任何代谢过程,而通过烷化反应将其乙烷基加入DNA碱基的部分基团,从而引起碱基配对错误。利用ENU可在较短时间内诱导小鼠产生大量随机突变表型。采用ENU诱变手段,本实验室筛选获得了一种显性遗传的腹部白斑小鼠,该小鼠突变纯合子表现为严重花斑表型且出现巨结肠症。本研究以该突变系小鼠为研究对象,从以下3个部分开展研究工作：1ENU诱变获得一种巨结肠症小鼠通过ENU诱变C57BL/6(B6)雄性小鼠后将其与正常B6雌鼠合笼,在G1代小鼠中筛查发现了一例腹部白斑表型的小鼠。将其与野生型B6小鼠配种后记录的25只后代小鼠中,其中9例小鼠表现为腹部白斑表型。将该杂合子小鼠互交获得42只小鼠,其中12只为花斑表型的突变纯合子小鼠,进一步研究发现突变纯合子小鼠表现为腹部肿大,并于出生后数周死亡。解剖发现,突变纯合子小鼠出现严重的巨结肠表型。2巨结肠突变基因的定位及鉴定为了定位该突变基因,将(B6×D2)F1突变杂合子小鼠互交获得F2代巨结肠小鼠,提取F2代小鼠的鼠尾DNA,利用微卫星对突变小鼠的染色体进行基因组扫描。定位结果表明在24个样品中突变基因与微卫星D14mit165及D14mi265未发生一例交换；最终将突变基因定位于微卫星D14Mit165与D4Mit265之间(或附近),通过对局部区域基因功能分析,初步判定Ednrb基因为本突变候选基因。设计扩增针对Ednrb基因编码区引物,对野生型及巨结肠小鼠脑总RNA进行RT-PCR扩增,产物回收后进行测序比对,结果显示B6小鼠编码区第865位碱基为T,而巨结肠小鼠为C,该突变位于Ednrb基因第4号外显子。氨基酸序列预测表明,该突变引起EDNRB蛋白第286位亮氨酸(L)被脯氨酸(P)所替代(L286P),突变发生在EDNRB蛋白第5跨膜区。3Ednrb (L286P)错义突变对细胞内Ca2+浓度的影响扩增野生型及突变纯合子小鼠Ednrb基因,将其克隆至(?)pCMV-tag2B真核表达载体,分别命名为pCMV-tag2B-WETB、pCMV-tag2B-METB。用脂质体2000将以上重组载体转染于CHO-K1细胞,同时设pCMV-tag2B空载体为对照组。转染24～48h左右加入Fluo4-AM孵育30min后采用叁个不同浓度ET-3刺激15min,最终通过多功能酶标仪检测细胞内荧光强度。结果发现：与转染pCMV-tag2B-WETB组相比,转染pCMV-tag2B-METB组细胞内Ca2+浓度显着降低,进一步表明L286P突变可影响EDNRB蛋白功能,是引起巨结肠表型的主要原因。 李柯[8]2012年在《ENU诱变获得一种多趾小鼠及其突变基因的鉴定》文中研究表明乙酰基亚硝基脲(Ethylnitrosourea,ENU)是一种人工合成能够导致多种生物体产生随机单碱基突变的高效烷化剂,利用ENU诱变可在较短时间内获得大量突变小鼠。本实验室采用ENU诱变手段,筛选获得了一种常染色体显性遗传的多趾突变小鼠,该突变小鼠呈现出轴前多趾现象,严重程度不一。本研究以这种突变系小鼠为对象,对突变基因进行了染色体定位,在初步确定了A1x4为该突变候选基因基础上,对Alx4基因进行了序列分析,确定Alx4基因突变是引起多趾表型的主要原因。我们的工作分以下2个部分：1多趾小鼠的获得及突变基因的定位ENU人工诱变后,在G1代小鼠中筛查发现了一例多趾突变表型的小鼠。将其与野生型C57BL/6J (B6)B6小鼠配种后记录的71只后代小鼠中,有15只后代出现多趾表型。将后代正常表型小鼠进一步与B6野生型交配,部分小鼠后代存在多趾表型,以上结果说明该突变表型属于一种呈不完全外显率的显性遗传。B6多趾小鼠与野生型DBA/2J(D2)配种获得的19只后代小鼠中,有4只多趾突变。(B6×D2)F1代多趾突变小鼠回交B6得到的317只[(B6xD2)F1×B6]N2代小鼠中,有61只多趾突变。N2代突变小鼠互交得到的25只后代中有12只杂合子,6只纯合子,7只正常。突变杂合子小鼠在后趾内侧(即轴前部)比正常小鼠多出一个脚趾,且严重程度不一；纯合子则更为严重,不仅前后肢都有多趾(多达7趾),而且后肢畸形,另外发现新生纯合子小鼠存在眼睑开裂现象。阿尔新蓝—茜素红染色结果显示突变杂合子小鼠与野生型相比,在后趾轴前部明显多出一趾,纯合子四肢多趾,后肢胫骨畸形,生长不全。多出的趾有的是与正常趾并行长出,有的则在原来的脚趾上长出一个分支,其他骨骼-软骨与正常相比未见明显异常。为了定位该突变基因,提取[(B6×D2)F1×B6]N2代小鼠的鼠尾DNA,利用44个微卫星对突变小鼠的常染色体和X染色体进行基因组扫描。第一轮筛选发现突变基因与2号染色体上的微卫星D2mit58在28个中交换了5例,LOD值为2.71,有可能连锁,而其余微卫星均无连锁倾向。在初步扫描基础上,在D2Mit58附近继续采用高密度微卫星标记并扩大N2代突变小鼠样品的数目,进一步定位结果表明在60个样品中突变基因分别与微卫星D2mit184(53.07cM)交换5例,LOD值为10.59；与D2mit45(50.63cM)交换4例,LOD值为11.68,确定连锁,并将突变基因定位于微卫星D2Mit184与D2Mit45之间,通过对局部区域基因功能分析初步判定Alx4基因为本突变候选基因。2Alx4基因的序列分析针对Alx4基因的4个外显子在其两侧设计了4对引物,对Alx4基因组DNA进行PCR扩增,产物回收后经过测序比对,最终发现多趾杂合子小鼠测序图上单位点存在明显的A-T重迭信号,RT-PCR测序结果与基因组DNA测序结果一致。该突变位于Alx4基因编码区第433位碱基处(位于Alx4基因第2号外显子),突变导致编码区第145位密码子AAA(编码赖氨酸)变为终止密码子TAA,引起蛋白编码提前终止,判定这是出现多趾表型的主要原因。 茅慧华[9]2004年在《ENU诱变获得两例新的稀毛小鼠及其突变基因的染色体定位》文中研究说明脱发或秃发是一种常见的人类疾病，在人群中有一定的发病率。脱发有先天遗传性或受后天外部因素影响而形成，如压力、饮食习惯、神经混乱、X光照射、药物引起等。但目前对于脱发的原因知之甚少，由于小鼠和人类基因组的高度同源，因此被毛突变小鼠是研究毛发生长和秃发机理的难得的动物模型，如无毛小鼠和稀毛小鼠。此类突变小鼠通常由自发或诱发突变得来。本文即用ENU诱变获得了两例新的稀毛小鼠并对突变基因进行了染色体定位。本论文的工作由叁部分组成。 1．ENU诱变获得两例新的被毛突变小鼠 用DNU(100mg／Kg)腹腔注射18只8-10周龄的雄性DBA／2小鼠(G_0)，每周一次共叁次；与同品系小鼠配种，在后代小鼠中针对可见表型筛查突变个体。将在后代小鼠(G_1)筛查到的突变个体与同品系配种，若异常表型传代则可能为显性突变；选择表型正常的G_1雄鼠与C57BL／6J配种得F_1，将F1随机互交得到F_2，依据F_2是否有突变鼠出现确定可能存在的隐性突变。结果表明，在352只G_1小鼠中，14只出现异常表型，但均未传代；对30只G_1雄鼠的隐性遗传试验获得2只稀毛突变小鼠，均表现为被毛稀疏、幼鼠生长缓慢；命名为snthr~(-1Bao)及snthr~(-2Bao)。 2．两例新的稀毛小鼠组织学结构的初步研究 分别取稀毛小鼠和正常DBA／2小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、淋巴结、胸腺和皮肤等脏器，用10％甲醛固定，行石蜡切片，HE染色，观察稀毛小鼠的组织学结构有无异常。结果发现稀毛小鼠除了皮肤比正常小鼠的薄，毛囊数量少，毛囊有角化现象外，其它各脏器均无异常。3.两例新的稀毛小鼠突变基因的染色体定位 用连锁分析法对ENU诱变获得的两例稀毛小鼠(s nthLr-’“aO及:nihr-z‘)的突变基因进行定位。选择平均分布于小鼠常染色体且在C57BL/6J和DB刀2间有差异的39个微卫星对B6DZFI互交得到的稀毛F:进行基因组扫描。当扫描了9个微卫星后发现sn廿『l“aO突变基因与DgMit243的LoD值为7.73。突变基因被定位于9号染色体。在此基础上又选择了DgMit355和DgMitls两个微卫星进行检测，并扩大F2的数量至145只。结果，sn廿甘~l“aO与DgMitls间无1例重组，稀毛突变基因与该微卫星紧密连锁，距着丝点71。M。同理，将sn止Lr-ZBaO突变基因也定位于9号染色体，与snuir.l腼相近的区域。检索发现sn廿ir，，“aO是一尚未克隆的新基因。 综上，本研究的结果为开发我国被毛突变小鼠品系打下了基础，提供了依据，为克隆该突变的稀毛提供了必要的研究基础. 邵义祥, 陈兵, 张成香, 陈春波, 薛整风[10]2005年在《ENU诱导获得一种短尾小鼠及其突变基因的初步定位》文中提出用一种化学诱变剂ENU(乙酰基亚硝基脲 )腹腔注射 3 0只 8～ 1 0周龄C5 7BL 6J(简称B6)雄鼠 (G0代 ) ,6周后与同品系正常母鼠配种繁殖后代 (G1代 )小鼠 3 5 1只。对其后代进行筛选获得一种可遗传的显性短尾突变小鼠。为了定位该突变基因 ,运用平均分布于B6和DBA 2 (简称D2 )小鼠常染色体而在这两者间又有差异的 3 9个微卫星对突变小鼠的 (D2×B6)F1代短尾突变小鼠回交D2得到的有短尾表型的[(B6×D2 )F1×D2 ]F2 代小鼠进行基因组扫描。反向运用经典的位置候选基因法 ,将短尾突变基因定位于 1 7号染色体 ,与D1 7Mit3 3的LOD值为 9 0 8。选用该染色体上与短尾表型相关基因Brachyury (T)最近的微卫星D1 7Mit1 43引物扩增 ,在 1 0 9只F2 代短尾小鼠中未发生一例交换 ,表明Brachyury基因是本例短尾突变强有力的候选基因。 [1]. ENU诱导小鼠突变及对部分突变基因的定位克隆[D]. 吴宝金. 扬州大学. 2004 [2]. ENU诱导小鼠突变及对一种白斑突变基因的定位鉴定[D]. 卢增兰. 杭州师范大学. 2012 [3]. ENU诱变瞳孔散大小鼠模型的分子机制与遗传特性研究[D]. 陈兵. 扬州大学. 2012 [4]. ENU诱变小眼畸形小鼠模型的分子机制研究[D]. 耿滕. 扬州大学. 2015 [5]. 角膜混浊小鼠模型获得及其分子基础研究[D]. 倪俊达. 扬州大学. 2015 [6]. 瞳孔异位与白斑两种突变小鼠的基因定位和白斑候选基因的序列分析[D]. 陈兵. 扬州大学. 2005 [7]. ENU诱变巨结肠小鼠模型的分子机制研究[D]. 糜婷. 扬州大学. 2014 [8]. ENU诱变获得一种多趾小鼠及其突变基因的鉴定[D]. 李柯. 扬州大学. 2012 [9]. ENU诱变获得两例新的稀毛小鼠及其突变基因的染色体定位[D]. 茅慧华. 扬州大学. 2004 [10]. ENU诱导获得一种短尾小鼠及其突变基因的初步定位[J]. 邵义祥, 陈兵, 张成香, 陈春波, 薛整风. 动物学杂志. 2005 标签：生物学论文; 杂合子论文; 微卫星标记论文; 基因合成论文; 突变理论论文; 人类染色体论文; 角膜反射论文; 外显子测序论文; 科学论文; 生物技术论文; 科普论文; icr小鼠论文; 参考文献：