李艳娇[1]2002年在《NO在内毒素诱发肝硬化大鼠肝衰竭发生中作用及其机制的研究》文中指出目的：研究肝硬化大鼠在内毒素诱发肝衰竭中NO对微循环和血液流变学的影响，探讨NO在肝衰竭发生中的作用及其机制。 方法：以皮下注射四氯化碳(CCl_4)结合饮食因素的方法复制肝硬化动物模型。肝衰竭由腹腔内注射脂多糖(LPS)诱发。大鼠随机分为5组：CH组复制10周肝硬化模型；CH+L-NNA组和CH+L-Arg组在复制10周肝硬化模型的基础上，从第9周开始至第10周末，分别行NOS抑制剂L-NNA(2mg／100g BW)和NO供体L-Arg(10mg／100gBW)灌胃处理；另外两组分别N组(正常对照组)和LPS组(内毒素对照组)。第10周末，除N组外，所有动物均在处死前4小时腹腔内注射LPS。根据动物一般表现和EEG判定HE，根据肾功能指标肌酐清除率(Ccr)、尿钠排泄量(U_(Na)V)判定功能性肾衰的发生。测定全血粘度和血小板聚集功能反映血液流变学变化，同时检测脑、肾组织NO浓度、MDA和SOD水平、LDH和TXB_2含量。特殊染色显示肝脏微血栓。免疫组化法检测ICAM-1在肝组织中的表达。 结果：LPS注射4小时后，CH组和CH+L-NNA组均发生肝衰竭，山西医科大学硕士学位论文2002EEG出现临床肝硬化病人的特征，Cer和呱aV水平较正常明显降低。L-沁g处理组大鼠未发生HE，Cer和UNaV明显升高，与正常组相比无差异。光镜下观察到的肝组织微血栓经统计学计数分析，仓Al，g处理组明显少于CH组和CH+L一NNA组(p<0.05)。L一A吧处理组大鼠随着脑、’肾组织NO水平的升高，MDA水平明显下降，SOD水平明显升高，与CH+L.NNA组相比差异显着(P<0.05);同时TXB:和LDH含量亦明显下降;全血粘度和血小板聚集率显着降低(vs CH组和CH+L.NNA组，P<0.05)。肝脏ICAM一l免疫组化显示CH组和CH+L一NNA组表达增强，以肝细胞和汇管区为主，而L一Arg处理组表达明显减弱。 结论:肝衰竭的发生与内毒素血密切相关。内毒素诱发肝硬化大鼠发生肝衰竭时有血液流变学异常与微循环障碍的发生。NO抑制血小板聚集，有很强的抗血小板、抗血栓及抗凝能力，减少肝衰竭发生中肝脏微血栓的形成，改善肝脏微循环。L.A堪处理组氧自由基减少，而后者可降低全血粘度，对NO改善血液流变学异常可起到积极的作用。外源性NO供体L一匆g增加脑、肾组织NO含量，使小血管收缩程度减轻、改善组织缺血缺氧状态，阻止肝衰竭的发生。
张慧英[2]2005年在《肠源性内毒素血症在肝肺综合征发病中作用的实验研究》文中研究指明肝脏疾病可以影响全身各个器官的功能。慢性肝病对肺脏的影响临床上主要表现是肝肺综合征(hepatopulmonary syndrome,HPS)。肝肺综合征主要包括叁个方面的表现,其一是基础肝脏疾病;其二是肺血管扩张;其叁是动脉血氧合功能障碍所致的严重低氧血症。故肝肺综合征实际上是基础肝脏疾病-肺血管扩张-动脉血氧合功能障碍构成的叁联体。肠源性内毒素血症(Intestinal endotoxemia, IETM)和肝病的关系日益受到重视。临床观察表明,各种急、慢性肝炎、肝硬化和重症肝炎患者血浆内毒素水平均有不同程度的升高,而且肠源性内毒素血症水平的高低与肝病患者肝功能受损的严重程度密切相关。临床观察结果在动物实验中也得到了证实。研究发现,内毒素(endotoxin)是肝脏枯否细胞最为敏感的激活剂。内毒素激活枯否细胞产生和释放大量以TNF-α为主的细胞因子、脂类炎性介质、一氧化氮(nitric oxide, NO)、内皮素(endothelin, ET-1)及自由基等损伤肝细胞。这些具有生物活性的化学物质在肝炎、肝纤维化与肝硬化形成以及肝硬化失代偿与肝功能衰竭中均发挥着极其重要的作用,除可加重原有肝脏的损害以外,还可诱发全身代谢和血液动力学的紊乱并引起各种并发症的发生和发展,从而严重影响肝病患者的预后。我所曾在肝硬化动物用小剂量脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱发肝性脑病和肝肾综合症,并且证实其发病的关键是肠源性内毒素血症的形成[6-8],与其相伴而生的诸多细胞因子在其中均发挥着重要作用。因此,在前述的实验研究基础上,该项研究仍采用本所复合因素复制的大鼠肝硬化模型,探讨肠源性内毒素血症以及相关细胞因子如TNF-α(tumor necrosis factor-α)、NO、ET-1、CO (carbon monoxide) 等在肝肺综合征发生中的作用,并利用原位细胞分离方法探讨内毒素对体外培养的枯否细胞吞噬和分泌功能影响的信号机制。有关肝肺综合征发病机制与肠源性内毒素血症关系的研究,罕见报道。该项研究共分叁部分:第一部分肝硬化大鼠肠源性内毒素血症时肝肺综合征的形成第二部分肠源性内毒素血症在肝硬化大鼠肝肺综合征发生机制中的
余立敏[3]2007年在《茵陈泽兰方对急性肝衰竭大鼠肝损伤及肝再生的影响》文中进行了进一步梳理目的观察茵陈泽兰方对急性肝衰竭模型动物的防治作用，并在此基础上观察其防治急性肝衰竭的作用机制，为临床治疗急性肝衰竭提供新的思路。方法选取健康清洁级Wistar大鼠110只，雌雄各半，体重200±20g，随机分为6组，即正常组，模型组，促肝细胞生长素组和茵陈泽兰方低、中、高剂量组。其中正常组10只，其余各组均为20只。大鼠禁食过夜(14h以上)后，除正常组外，其余各组用硫代乙酰胺(TAA)600mg／kg皮下注射2次(间隔24h)造模；正常组皮下注射同等剂量的生理盐水。开始至实验结束，正常组、模型组和西药组予生理盐水5ml／kg灌胃，茵陈泽兰方低、中、高剂量组分别给等体表面积比的相应药物灌胃(叁组分别给予茵陈泽兰方成人等效剂量、成人等效剂量的5倍、成人等效剂量的10倍剂量进行灌胃)。为防止低血糖，造模期间，除西药组外，所有动物每隔8h皮下注射5ml混合液(3ml 10％葡萄糖、2ml含等量生理盐水与20μmol／L KCl)；西药组予促肝细胞生长素2mg／kg，溶于上述防止低血糖的混合液中，每日皮下注射1次，持续3d。动物自由饮食。实验48h后，所有大鼠用3％戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉后取腹中线迅速剪开腹腔，用10ml注射器无菌采取腹主动脉血8ml，常规分离血清，-20℃冻存备测。各组随机取大鼠9只，取相同部位的肝组织放入10％中性福尔马林液固定，常规石腊包埋，切片厚4μm，并取部份肝、脑组织迅速放入液氮中冻存。主要观察48h内各组大鼠行为学变化、死亡情况和常规生化方法检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBil)；SABC免疫组织化学法检测肝组织肝细胞增殖细胞核抗原(PCNA)、肝再生信号调节蛋白α1(SIRPα1)水平；双抗体夹心ELISA法检侧血清TNF-α和IL-6含量；RT-PCR法检测肝组织HMGB1、CD14mRNA和脑组织AQP-4mRNA水平。结果1．造模后动物出现活动进食减少，行动变缓，出现昏迷，部分死亡(死亡率为55.0％)。中药组大鼠肝损伤得到较大改观，有部分大鼠可逐渐恢复正常。死亡率方面，用药各组与模型组比较均具有显着性差异(p＜0.01)。病理上，与模型组相比较，茵陈泽兰方中、高剂量组肝细胞坏死程度最轻微，其次为西药组和低剂量组；透射电镜下残留肝细胞病理变化较模型组也轻。造模后，反映大鼠肝功能的血清ALT，AST，Tbil水平均明显升高，模型组明显高于正常组，有非常显着差异(P＜0.01)；西药组及中药各剂量组较模型组低，统计有显着性差异(P＜0.01)；茵陈泽兰方中、高剂量组与西药组均低，组间无差异(P＞0.05)；中药低剂量组与西药组之间有差异(P＜0.01)。降低血氨方面，中西药各组均有显效(P＜0.01)，但茵陈泽兰方中、高剂量组较西药组强(P＜0.01)；有效缩短凝血酶原时间方面情况相似，只是西药组比中药低剂量组更有效(P＜0.05)。2．正常组大鼠肝组织有丝分裂指数(MI)极少，造模后大鼠肝组织MI显着升高(P＜0.01)，用药后各组肝组织有丝分裂有不同程度增加(P＜0.01)，以中高剂量组最明显，分别是模型组的2.6倍和3.1倍。低剂量组有丝分裂指数最少，与其它各用药组比有显着性差异(P＜0.05-0.01)。正常组大鼠肝组织内仅见少数增殖细胞核抗原(PCNA)阳性细胞，表达也较弱。造模组大鼠PCNA表达明显增加，与正常组大鼠相比差异显着(P＜0.01)；促肝细胞生长素组PCNA染色也明显增多，浓度高，表达范围广；茵陈泽兰方治疗后，大鼠肝组织PCNA表达升高，且随着茵陈泽兰方剂量的增加表达增强，与模型组相比，明显升高(P＜0.01-0.05)。但相对于西药组，中药低剂量组表达较少(P＜0.01)。3．正常组大鼠肝组织中，SIRPα1表达水平较低，模型组和促肝细胞生长素组大鼠与其相比，差异均显着(P＜0.01)。茵陈泽兰方治疗后，大鼠肝组织SIRPα1表达升高，高、中、低剂量SIRIα1表达均明显高于模型组(P＜0.01)。且SIRPα1的表达随着茵陈泽兰方剂量的增加而增加，茵陈泽兰方中高剂量组与模型组比较有显着差异(P＜0.01)；且与西药组作用相当(P＞0.05)；但茵陈泽兰方低剂量组大鼠肝组织SIRPα1阳性表达虽然比模型组明显升高(P＜0.01)，但不及西药组及中高剂量组(P＜0.05)。4．大鼠在皮下注射TAA造模后，模型组、西药组和茵陈泽兰各剂量组血清TNF-α和IL-6含量均较正常组高(P＜0.01)；但西药组和茵陈泽兰各剂量组较模型组比较则明显下降，其结果有显着性差异(P＜0.01)；中药茵陈泽兰方低剂量组与西药组比较有差异(P＜0.05)，提示其效果不及西药组；中高剂量组与西药组比较有显着性差异(P＜0.01)，提示其效果优于西药组；中药中高剂量组间比较无显着性差异(P＞0.05)。5．正常组HMGB1 mRNA表达很低(0.136)，模型组肝组织HMGB1 mRNA表达明显增高(0.429)，与正常组比较有显着性差异(p＜0.01)。应用茵陈泽兰方后，HMGB1 mRNA相对含量明显下降(0.351，0.246，0.241)，与模型组比，各用药组均有明显降低(p＜0.05-0.01)，中高剂量比西药组和低剂量组都要低(p＜0.01)。低剂量组效果最差(p＜0.01)。6．正常组AQP-4 mRNA表达很低，模型组肝组织AQP-4 mRNA表达明显增高，与正常组比较有显着性差异(p＜0.01)。应用茵陈泽兰方后，AQP-4 mRNA表达受到了抑制，其相对含量明显下降(0.472，0.336，0.302)，与模型组比，各用药组均有明显降低(p＜0.05-0.01)，而中高剂量组相比西药组和低剂量组都要更低(p＜0.05-0.01)。7．正常组CD14 mRNA表达很低(0.193)，模型组肝组织CD14 mRNA表达明显增高(0.697)，差异显着(p＜0.01)。应用茵陈泽兰方后，CD14 mRNA表达受到了抑制，其相对含量明显下降(0.564，0.419，0.306)，与模型组比各用药组均有明显降低(p＜0.05-0.01)，中、高剂量比西药组和低剂量组都要低(p＜0.01)。结论1．茵陈泽兰方对急性肝衰竭模型大鼠肝损伤有较好的防治作用，能在一定程度上恢复肝功能，改善肝组织病变，降低死亡率。2．茵陈泽兰方对模型大鼠急性肝衰竭防治作用的机制可能是：(1)通过降低TNF-α、IL-6和HMGB1等的水平，平衡炎性细胞因子的释放，抑制肝细胞坏死和凋亡，延缓肝细胞进一步损伤，从而阻断急性肝衰竭的发生发展；(2)提高肝细胞有丝分裂指数(MI)及PCNA、SIRPα的表达，促进和调节残留肝细胞的再生；(3)降低脑组织AQP-4 mRNA的表达，调整脑组织的水液代谢平衡，防止急性肝功能衰竭时伴发严重脑水肿，从而降低死亡率。(4)降低肝组织中CD14 mRNA水平，阻止内毒素对肝组织的直接损害，并且抑制内毒素激活各种细胞因子和炎症介质的释放，导致肝损伤。
徐正婕[4]2003年在《Kupffer细胞在非酒精性脂肪性肝炎发病中的作用》文中认为研究目的1. 通过高脂饮食建立大鼠非酒精性脂肪性肝炎（NASH）肝纤维化模型。2. 观察大鼠NASH形成过程中Kupffer细胞活性的变化，以及NASH大鼠对内毒素敏感性的改变，明确NASH时Kupffer细胞功能的改变。3. 探讨NASH大鼠Kupffer细胞功能改变的机制，包括肠道环境的变化、肠源性内毒素血症，以及游离脂肪酸、极低密度脂蛋白（VLDL）的作用等方面。研究方法1. 以普通饲料+2%胆固醇+10%猪油组成的高脂饲料喂养雄性SD大鼠，在实验4、8、12、16和24周分批处死。测定体重、肝脏湿重、血脂和血清转氨酶。通过HE染色和VG苦味酸染色观察肝脏肝细胞脂肪变性、炎症和纤维化程度。通过免疫组化了解肝脏Ⅲ型胶原、转化生长因子β1（TGFβ1）、α－平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达。2. 在不同实验阶段，免疫组化染色法动态观察高脂饮食模型大鼠肝脏溶菌酶和内毒素结合受体CD14抗原表达，RT-PCR法观察肝脏内毒素信号受体TLR4 mRNA细胞因子TNF-α mRNA表达，ELISA法测定血清细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6水平。3. 实验24周，高脂饮食模型大鼠腹腔内注射小剂量的内毒素（0.5mg/kg）后观察24小时生存率，测定血脂、血糖、血清转氨酶，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，肝组织行HE染色和VG染色观察肝脏病理。4. 在实验不同阶段，鲎试剂偶氮显色法测定高脂饮食模型大鼠外周血和门静脉血血清内毒素水平。乳果糖组大鼠高脂饮食8周后口服乳果糖水溶液，16周处死，观察体重、肝脏湿重、血脂、血清转氨酶以及肝脏病理改变。5. 免疫细胞化学法和放射免疫法观察软脂酸、油酸、VLDL对巨噬细胞RAW264.7核因子κB（NFκB）活性和内毒素敏感性的影响。研究结果1. 高脂饮食大鼠，4周出现肝细胞脂肪变性，8周表现为单纯性脂肪肝，12周~24周进展为脂肪性肝炎，24周还出现肝纤维化。第4周起高脂饮食模型大鼠肝组织CD14表达上调，溶菌酶阳性的Kupffer细胞被激活，并随着实验的进行更加明显。肝脏TLR4mRNA表达从8周开始上调，16周和24周表达最强，TNF-α mRNA在8周~24周均有表达。血清TNF-α水平从<WP=6>2. 8周起明显增高，IL-1β从16周起升高，IL-6水平则无明显变化。3. 注射内毒素后24小时，24周高脂饮食模型大鼠出现急性肝功能衰竭，表现为存活率明显降低，血糖明显降低，血清ALT和AST明显升高，血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均显着升高，肝组织炎症活动度计分明显升高，肝窦内还有大量血细胞淤滞。4. 高脂饮食模型大鼠腹主动脉血血清内毒素水平在24周明显升高，门静脉内毒素水平在4周~16周未见明显升高，但同期门静脉血清内毒素水平高于腹主动脉血水平。乳果糖口服明显改善高脂饮食大鼠血清转氨酶和肝组织炎症，但未减轻肝细胞脂肪变性程度。5. 软脂酸、油酸、VLDL处理24小时可以使RAW264.7细胞核NFκB阳性率明显增加，以软脂酸最为明显；软脂酸、油酸、VLDL处理24小时还可使100μg/ml内毒素刺激后RAW264.7细胞生成的TNFα不同程度的增多。研究结论1. 持续24周的高脂饮食可以诱导雄性SD大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纤维化模型。2. Kupffer细胞活化，伴随内毒素受体TLR4和CD14表达上调，TNFα等细胞因子生成增多，是大鼠NASH形成过程中的早期事件，也是NASH大鼠对内毒素肝损伤的敏感性增强的重要原因。3. 肝脏游离脂肪酸和VLDL增多可能是NASH大鼠的Kupffer细胞活化和内毒素敏感性增强的原因之一。4. 大鼠NASH的早期，并不存在肠源性内毒素血症，但由于Kupffer细胞内毒素敏感性增强，肠道细菌过度生长以及肠源性内毒素仍在NASH的发病中起了一定的作用。
李夏[5]2004年在《肠源性内毒素血症在非酒精性脂肪性肝病发生发展中的作用》文中研究指明近年来，随着社会经济的发展和人民生活水平的提高，高脂血症、糖尿病、肥胖等发病率逐渐上升。在上述脂肪代谢障碍的病理情况下，人体容易并发非酒精性脂肪肝（Nonalcoholic fatty liver）、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）等非酒精性脂肪性肝脏疾病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）。NAFLD是一类肝组织学改变与酒精性肝病相类似但无过量饮酒史的临床综合征。我肝病研究所致力于肠源性内毒素血症（intestinal endotoxemia, IETM）在各种肝脏疾病发生发展中的作用及其机制研究20余年。肠源性内毒素通过过度或持续活化枯否细胞（Kupffer cell, KC）在导致各种急、慢性肝脏疾病的慢性化、重症化乃至肝功能衰竭中发挥重要作用。人体在发生NAFLD时是否伴有肠源性内毒素血症，内毒素对非酒精性脂肪肝，特别是在脂肪肝向NASH的发展过程中有何作用和影响，至今国内外尚未见报道。为了证实IETM在NAFLD中的作用及其作用机制，故设计下列诸多实验，同时由于甘氨酸可降低肠源性内毒素水平，并能阻断内毒素生物学效应的发挥，因此，从另一方面进一步证明肠源性内毒素在NAFLD发生发展中的作用。实验共分四部分：第一部分 非酒精性脂肪性肝病动物模型复制的研究第二部分 玉米油引起肠源性内毒素血症发生的机制及其对非酒精性脂肪性肝病形成的影响<WP=5>第叁部分 非酒精性脂肪性肝炎时肝脏枯否细胞在体外吞噬功能的变化及其机制研究第四部分 甘氨酸在非酒精性脂肪性肝病中拮抗肠源性内毒素血症研究第一部分 非酒精性脂肪性肝病动物模型复制的研究实验一 玉米油在非酒精性脂肪性肝炎形成中的作用结果表明：20%玉米油喂养9周末，动物血清与肝脏脂质水平增高，血浆内毒素、ALT含量升高。组织学检查发现，肝脏出现脂肪性肝炎病理变化。实验二 玉米油在非酒精性脂肪性肝纤维化形成中的作用结果表明：20%玉米油喂养第12周末动物肝脏TG水平增高，血浆内毒素、ALT水平升高，血浆中TGF-β1、HA、LN含量增加。组织学检查发现，肝脏在脂肪性肝炎变化的基础上，炎性细胞浸润和肝细胞点状坏死加重。VG染色，可见沿血管走行分布的束状的胶原纤维。肝脏病理学诊断为：轻、中度脂肪性肝炎，在肝脏腺泡3区出现局灶性窦周纤维化。实验叁 饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸在大鼠非酒精性脂肪性肝炎形成中的作用结果表明：以四氯化碳为主的复合因素中分别加入饱和脂肪酸（猪油）或不饱和脂肪酸（玉米油）喂养大鼠3周，均可使动物体重降低，发育延缓。肝脏脂质聚集，血浆内毒素、ALT、MDA、TNF-α、TGF-β1以及HA、LN和肝脏羟脯氨酸含量均高于对照大鼠。肝脏组织学检查均出现脂肪性肝炎变化。但不饱和脂肪酸组血浆ET、TNF-α明显高于饱和脂肪酸组，血浆HA、LN、TGF-β1及肝脏羟脯氨酸含量均显着高于饱和脂肪酸组。组织学检查发现，饱和脂肪酸组大鼠有较明显的脂肪浸润，少数脂变肝细胞融合而成脂肪囊肿。不饱和脂肪酸组胶原纤维增生比饱和脂肪酸组显着。<WP=6>实验四 性别在非酒精性脂肪性肝病发生中的作用结果表明：在复合因素中用玉米油分别喂养雌、雄性大鼠3周，结果发现雌性动物肝脏TG水平和MDA含量明显高于雄性，血浆ALT活性增高。但雄性大鼠血浆HA、LN、TGF-β1明显高于雌性动物。组织学检查和肝脏脂肪变性、纤维化分级也发现雌性动物脂变明显，雄性动物有较显着的纤维化趋势。综合上述实验结果可以概括为：①用含20%玉米油饲料分别喂养大鼠9周、12周，可以复制出伴有肠源性内毒素血症的非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝纤维化模型。②在复合因素中分别加入饱和脂肪酸或不饱和脂肪酸处理大鼠3周，均可出现脂肪性肝炎病理变化，并伴有内毒素血症。但饱和脂肪酸组有较明显的脂肪变性，不饱和脂肪酸组纤维化趋势较显着。③在雌性、雄性大鼠以复合因素含不饱和脂肪酸处理3周后，雌性大鼠脂肪变性显着，雄性大鼠有显着的纤维化改变。第二部分 玉米油引起肠源性内毒素血症发生的机制及其对非酒精性脂肪性肝病形成的影响实验五 玉米油导致肠源性内毒素血症发生机制研究一、非酒精性脂肪性肝病时肠黏膜屏障的变化（一）非酒精性脂肪性肝病时肠黏膜及肠血管通透性的观察结果表明：非酒精性脂肪性肝病7周时，肠粘膜及肠血管通透性增高。（二）非酒精性脂肪性肝病时血浆和肠组胺含量的变化结果表明：非酒精性脂肪性肝病7、9周时，血浆、肠内组胺水平增加，提示组胺在肠黏膜通透性增高中发挥作用。（叁）非酒精性脂肪性肝病时血浆和小肠谷氨酰胺含量改变结果表明：非酒精性脂肪性肝病7、9周时，血浆谷氨酰胺合成酶活性显着降低，小肠谷氨酰胺含量降低，提示小肠能源缺乏是肠黏膜屏障功能减弱之根本。二、非酒精性脂肪性肝病时大鼠吞噬指数和廓清指数的变化<WP=7>结果表明：非酒精性脂肪性肝病7、9周时，大鼠吞噬指数和廓清指数均降低，这是血浆内毒素水平升高的机制之一。叁、非酒精性脂肪性肝病发生发展过程中血清高密度脂蛋白胆固醇的动态变化结果表明：非酒精性脂肪性肝病发展过程中，血清高密度脂蛋白胆
王玉梅[6]2002年在《在暴发性肝衰竭中细胞凋亡调控基因及NO、TNF-α对肝细胞凋亡的作用》文中研究表明目的 暴发性肝衰竭(fulminant hepatic failure，FHF)是病毒性肝炎死亡的主要原因，严重危害着人体健康，其发病机制复杂，至今尚未完全阐明。近年来的研究表明，肝细胞凋亡和肝细胞坏死有着非常密切的关系，但在暴发性肝衰竭中肝细胞凋亡的确切机制尚不十分清楚。已有的研究表明，TNF-α和NO对肝细胞凋亡均具有重要作用，在TNF-α诱导肝衰竭的实验研究中肝细胞凋亡与肝细胞坏死有着非常密切的联系，而NO一方面可诱导多种细胞发生凋亡，另一方面在某些条件下又对细胞凋亡起抑制作用。本研究通过动态观察，对TNF-α和NO在暴发性肝衰竭动物模型肝细胞凋亡中的作用进行研究，旨在从细胞凋亡的角度进一步探讨TNF-α和NO在暴发性肝衰竭中的作用。 有许多基因在肝细胞凋亡中起着调控的作用，通过这些基因的作用，肝细胞凋亡才能得以发生。细胞凋亡的调控基因包括Caspase家族、Bcl-2家族、Fas系统等，其中Caspase的作用尤为重要，被誉为“凋亡刽子手”或“凋亡步兵”，在肝细胞凋亡中起着关键性的作用。Fas系统和Bcl-2家族成员在肝细胞凋亡中的作用亦不容忽视，有研究表明，在肝脏疾病中，肝细胞的凋亡主要是通过Fas/FasL途径介导所致，而Bcl-2为重要的抗凋亡因子，定位于线粒体膜的Bcl-2蛋白可通过调节线粒体功能而制约着凋亡的发生。在对Bcl-2和Fas调控细胞凋亡的研究中发现，Caspase-3的激活在其中起着重要的作用。本研究通过对上述调控基因在暴发性肝衰竭中对肝细胞凋亡的作用研究，进一步探讨肝细胞凋亡的发生机制，为临床治疗提供一定的实验依据。材料与方法 实验动物为雄性昆明小鼠，体重20一259，根据4种不同处理对其进行分组，其中28只联合应用LPS和D一GdN，为模型组;28只联合应用IJS、D一GalN和抗TNF一a抗体，为抗TNF一a组;28只联合应用L玲、D-GalN和iNOS的抑制剂L一NMMA，为抗NO组;20只注射同样体积的生理盐水，为对照组。各组均于给药后2、4、8、12小时分别采取血和肝脏标本(模型组、抗TNF一a组和抗NO组每个时间点为7只小鼠，对照组每个时间点为5只小鼠)，进行以下检测。 一、应用生化方法检测血清ALT和TBil水平，并对肝组织进行IIE染色，以明确肝细胞坏死程度和生化变化。 二、肝细胞凋亡的检测:应用酚氯仿提取法在冻存的肝组织中提取DNA，去除RNA后于0 .7%琼脂糖凝胶电泳观察DNA梯形带，并应用原位末端脱氧核昔酸转移酶标记法(，rU NEL)对石蜡包埋的肝组织切片进行凋亡细胞的检测，DAB显色后细胞核呈棕褐色染色的为阳性细胞，于显微镜下判断阳性程度。 叁、TNF一a和NO的检测:应用异硫氰酸肌一酚一氯仿方法提取肝组织RNA后，逆转录合成cDNA，再行PCR反应检测肝组织TNF一。mRNA及肝组织iNOSmRNA表达，引物序列如下:TNF一a一1 5丁一ACCAGAGCGGCAAGAAGAACCAT一3‘;TNF一a一25‘一CATCA-GACATCGGAGGCAGGAAG一3‘(产物长329bp)，iNOS一1 5‘一TCGGTGCAGTC『l’1’ltl’CCTATGG一3‘;iNOS一25‘一TATTAGAGCGGCGGcATGGT一3‘(产物长404bp)，同时设内参照，进行，rNF一。mRNA及iNOSmRNA表达的定量检测。用EUSA方法检测血清，INF一a水平，采用硝酸还原酶法检测血清NO水平，明确翎F一。和NO在暴发性肝衰竭模型中的动态变化。 四、应用免疫组化技术检测Bcl一2和Fas在肝组织中的表达，DAB显色后细胞浆呈棕褐色染色的为阳性细胞，于显微镜下判断阳性程度。 五、应用原位杂交的方法检测CasPase一3在肝组织中的表达，Caspase一3寡核昔酸探针序列如下: (l)5’一AGGATAATCCA‘l’1’l“l人TAACTGTTGTCCAG一3‘; (2)5’一TCCAg件CT创队CCACGGCAGGCCTGAATA一3‘; (3)5‘一GACTCAAATTCTGTTGCCACCTTrCGGTTA一3‘，DAB显色后细胞浆呈棕褐色染色的为阳性细胞，于显微镜下判断阳性程度。结果 一、暴发性肝衰竭动物模型的建立:经动态观察，小鼠经给予LpSIO林扩kg+D一G滋N 80Om岁kg后12h内无死亡，用药后8h可有点片状肝细胞坏死，12h则见肝细胞大块状坏死，同时伴有血清ALT和TBil的显着升高，符合暴发性肝衰竭的病理和生化改变。肝细胞凋亡的检测结果表明，模型组8h可见典型的DNA梯形带，且TUNEL检测阳性细胞增加最显着，12h则出现坏死带，，rU NEL检测亦存在较多的阳性细胞，但较 sh时减少，二者比较P<0 .05。 二、TNF一a在暴发性肝衰竭中对肝损伤及肝细胞凋亡的作用:模型组2h、4h、8h血清TNF一a水平、肝组织，rNF一amRNA的表达均显着升高，与各时间点的对照组比较P<0.01，尤以2h升高最为显着，以后逐渐下降。抗TNF一a组血清TNF一a水平及肝组织TNF一amRNA的表达均为正常水平。模型组4h、sh、12h，ALT、TBil均明显升高，与各时间点对照组相比有显着差异，p<0.01，其中sh、12h升高更明显，与4h相比p<0.01。抗TNF一a组各时间点ALT、TBil水平均为正常水平。抗TNF一。组各时间点均无DNA梯形带或坏死带的出现，TUNEL检测仅出现少量阳性细胞。 叁、NO在暴发性肝衰竭中对肝损伤及肝细胞凋亡的作用:模型组2h
杨龙飞[7]2006年在《复方小花清风藤浸膏抗急性肝损伤作用及对炎症干预作用的机制研究》文中进行了进一步梳理很多因素都可以引起肝脏损伤,包括外伤导致的肝损伤、化学性肝损伤(包括药物性肝损伤和非药物性肝损伤,主要是由于平时用药及酒精等因素造成的肝脏损伤)以及病毒性肝炎所导致的肝损伤等。其中以病毒性肝炎引起的肝损伤最为常见。我国是HBV感染的高发区,根据1992-1995年全国病毒性肝炎血清流行病学调查,人群HBsAg携带率达9.75%,约1.2亿人。探讨中药对肝脏的保护作用以及抗炎的机制对开发新的抗肝炎药物有重要意义。近年的研究表明:肝炎的发生机制除与引起炎症的病毒有关外,还与机体的免疫机制引起的肝脏损伤有关。炎症的组织学特征是炎性细胞浸润,细胞因子、炎症介质和转录因子等都在肝炎发病的病理过程中起关键性作用。小花清风藤(Sabia. parviflora Wall. ex Roxb)为苗族民间药物,是清风藤科清风藤属藤本植物,主要分布于云南、广西、贵州等地,以前的研究资料表明,其对甲肝及乙肝的治疗效果均较显着,有很好的利湿退黄和降转氨酶作用。但相关的药理研究资料极少。贵州省科技产业厅立项,对该药进行化学和活性的系统研究,并研制抗肝损伤的新药。复方小花清风藤浸膏主要由小花清风藤、叁七、石斛组成,有清肝利胆的功效,主要用于治疗病毒性肝炎。本研究采用四氯化碳、α-萘异硫氰酸酯、D-氨基半乳糖、卡介苗联合脂多糖诱发四种肝损伤模型,采用生物化学、酶联免疫分析、免疫组织化学、逆转录聚合酶链反应等手段,从肝脏功能、脂质过氧化、细胞因子的表达、肝细胞凋亡以及转录因子的活化等环节探讨了复方小花清风藤浸膏对不同肝损伤模型的保护作用及其对炎症干预作用的相关机制。第一部分复方小花清风藤对急性肝损伤动物模型的保护作用1复方小花清风藤对四氯化碳(CCL4)、α-萘异硫氰酸酯(ANIT)致小鼠肝损伤模型的保护作用目的:研究复方小花清风藤对四氯化碳致急性化学性肝损伤模型及α-萘异硫氰酸酯致胆瘀症模型小鼠血清中转氨酶、碱性磷酸酶及胆红素含量的影响,探讨复方小花清风藤对肝细胞膜通透性和胆汁排泄功能的影响。方法:分别采用四氯化碳皮下注射、α-萘异硫氰酸酯灌胃致小鼠急性肝脏损伤,观察复方小花清风藤对四氯化碳致肝损伤模型小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)含量的影响;α-萘异硫氰酸酯致肝损伤模型小鼠血清中ALT、AST、碱性磷酸酶(ALP)及总胆红素(T-Bil)含量的影响。结果:两种模型均可见小鼠血清中的转氨酶含量显着升高,α-萘异硫氰酸酯灌胃48小时后,小鼠血清中的ALP及T-Bil显着升高。复方小花清风藤6.5g/kg、3.3g/kg可明显降低四氯化碳致肝损伤模型小鼠血清中的ALT含量,13g/kg、6.5g/kg、
张晓[8]2016年在《丝裂原活化蛋白激酶在腔房转流术后布加综合征患者血清中的表达变化及临床意义》文中指出目的客观评价腔房转流术治疗布加综合征的安全性和临床疗效,并从丝裂原活化蛋白激酶角度初步探讨其可能的作用机制。方法本临床观察开展前瞻性自身前后对照研究。收集符合条件的病例35例,在术前、术后3天、术后1个月分别检测各项相关指标,观察治疗前后患者的肝功能、心功能、肺功能评分或指标变化,以及血清MAPK四大亚族蛋白的表达。同时选择健康志愿者10名作为正常对照组,用于进行血清MAPK相关蛋白的对比观察。结果(1)经手术治疗后,患者肝功能分级、心功能、肺功能手术前与手术后3天比较差异有统计学意义(P<0.05),手术后1个月与手术后3天比较差异有统计学意义(P<0.05)。其中,患者肝功能、心功能主要指标在手术后3天均有所恶化,与手术前比较均有显着性差异(P<0.05),手术后1个月基本恢复到手术前水平(P>0.05),与手术后3天比较有显着性差异(P<0.05)。(2)手术前后患者ERK1/2水平与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),且手术前与手术后3天及手术后1个月相比差异均无显着性意义(P>0.05)。(3)手术前后患者P-ERK1/2水平与正常对照组相比明显上调,差异有统计学意义(P<0.05),且患者手术后3天较手术前血清P-ERK1/2的表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。患者手术后1个月血清P-ERK1/2的表达有所下调,较手术前差异无统计学意义(P>0.05)。(4)手术前后患者血清P38水平与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),且手术前与手术后3天及手术后1个月相比差异均无显着性意义(P>0.05)。(5)手术前后患者血清P-P38水平与正常对照组相比明显上调,差异有统计学意义(P<0.05),且患者手术后3天较手术前血清P-P38的表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。患者手术后1个月血清P-P38的表达有所下调,较手术前差异无统计学意义(P>0.05)。(6)手术前后患者血清JNK水平与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),且手术前与手术后3天及手术后1个月相比差异均无显着性意义(P>0.05)。(7)手术前后患者血清P-JNK水平与正常对照组相比明显上调,差异有统计学意义(P<0.05),且患者手术后3天较手术前血清P-JNK的表达明显上调,差异有统计学意义(P<0.05)。患者手术后1个月血清P-JNK的表达有所下调,较手术前差异无统计学意义(P>0.05)。(8)手术前后患者血清ERK5水平与正常对照组相比差异无统计学意义(P>0.05),且手术前与手术后3天及手术后1个月相比差异均无显着性意义(P>0.05)。(9)手术前后患者血清P-ERK5水平与正常对照组相比明显下调,差异有统计学意义(P<0.05),且患者手术后3天较手术前血清P-ERK5的表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。患者手术后1个月血清P-ERK5的表达有所上调,较手术前差异无统计学意义(P>0.05)。结论(1)腔房转流术治疗能改善布加综合征患者的远期肝功能、心功能、肺功能。(2)MAPK信号通路蛋白磷酸化的表达与布加综合征密切相关,ERK1/2、JNK、P38MAPK通路蛋白磷酸化的表达与布加综合征病情进展呈正相关,但ERK5蛋白磷酸化的表达却呈现负相关。(3)MAPK信号通路蛋白磷酸化的表达可作为评估布加综合征的腔房转流术效果的指标之一。(4)MAPK信号通路蛋白的表达情况对布加综合征的发生、发展及腔房转流术治疗后的预后评估具有重要意义。
李宁[9]2014年在《内毒素、TNF-α与IL-6与重型乙型肝炎关系研究》文中研究表明目的检测重型乙型肝炎患者血清中内毒素（LPS）、肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素-6（IL-6）水平，并同慢性乙型肝炎患者与正常对照组比较，探讨它们与乙型肝炎重型化关系，为慢性肝炎临床治疗和预后判断提供理论和临床依据。方法病例取自唐山市传染病院2012年6月至2013年10月住院患者和健康体检者共120例，其中慢性重型乙型肝炎患者40例（男：34例，女：6例），年龄：22~44岁（平均年龄：33.4±12.0岁）、慢性乙型肝炎患者40例（男：33例，女：7例），年龄：26~48岁（平均年龄：36.1±8.3岁）和40例非乙型肝炎患者(健康体检者)为正常对照组，（男：35例，女：5例），年龄：25~46岁（平均年龄：35.3±10.2岁）。入院后未进行治疗前抽取清晨空腹静脉血，检测血清总胆红素（TBil）和谷丙转氨酶（ALT）；并分别用鲎叁肽基质显色法和酶联免疫吸附测定法检测各组LPS、TNF-α及IL-6的含量。应用SPSS13.0版统计软件处理数据。计量资料以均数±标准差（x s）表示，采用方差分析。内毒素与细胞因子间及与患者预后之间关系采用Pearson积矩相关分析。结果1乙型肝炎组患者血清中ALT和TBil含量明显高于健康对照组（P<0.05）；慢性重型乙型肝炎组患者血清中ALT和TBil含量高于慢性乙型肝炎组（P<0.05）；2乙型肝炎组患者血清中LPS，TNF-α及IL-6的含量较健康对照组明显增高（P<0.05），慢性重型乙型肝炎组患者血清中LPS，TNF-α及IL-6的含量明显高于慢性乙型肝炎组患者（P<0.05）；3慢性重型乙型肝炎患者血清中ALT与LPS，TNF-α和IL-6相比无明显相关性；4慢性重型乙型肝炎患者血清中TNF-α含量随着LPS升高而升高，两者间有相关性（rLPS-TNF-α=0.358P<0.005），慢性重型乙型肝炎患者血清中IL-6含量随着LPS升高而升高，两者呈正相关（rLPS-IL-6=0.344P<0.005）；5LPS，TNF-α和IL-6的水平与慢性重型乙型肝炎患者预后存在显着的相关性。结论慢性重型乙型肝炎患者肝功能明显受损；在慢性乙型肝炎重型化过程中，内毒素水平增高可能是其重要诱因之一，内毒素介导TNF-α及IL-6升高可能是肝细胞损伤机制之一；内毒素和TNF-α及IL-6可以作为慢性重型乙型肝炎预后判断的间接指标。
李红[10]2006年在《肠源性内毒素血症对慢性肝炎患者免疫功能的影响及其机制的探讨》文中研究指明目前,越来越多的资料揭示了宿主免疫系统在慢性乙型肝炎病毒(Hepatic B virus,HBV)感染中的重要作用。疾病发展和转归的主要因素在于宿主的免疫功能,肠源性内毒素血症(intestinal endotoxemia,IETM)为其主要的影响因素之一。我所诸多动物实验和临床研究发现,急慢性肝炎、肝硬化动物和患者所伴之IETM与肝脏免疫功能密切相关。然而,具体机制仍有待进一步研究。本论文共分叁个部分。第一部分:IETM阳性与阴性对慢性肝炎患者免疫功能的影响;第二部分:IETM相伴之高组胺血症的发生机制及其对免疫功能的影响;第叁部分:IETM对细胞免疫功能的影响。第一部分:探讨IETM阳性与阴性对慢性肝炎患者免疫功能的影响。实验一、二:选取慢性乙肝患者80例,根据测定的血浆内毒素水平,将其分为内毒素(ET)阳性组和阴性组,分别检测血清白细胞介素10、12(IL-10、IL-12)、干扰素γ(IFN-γ)、白细胞介素4(IL-4)浓度。并结合乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)、乙肝病毒脱氧核糖核酸(HBVDNA)、血清谷丙转氨酶(ALT)以及总胆红素(TBIL)进行分析研究。结果显示,1.肝炎患者(total patients)的各项指标均有不同程度异常。在慢性肝炎患者中,内毒素血症的发生率为41/80(51.25%),内毒素阳性组(ET positive)与阴性组(ET negative)比较,ALT、TBIL、IL-4、IL-10水平均显着升高,而IL-12水平和Th1/Th2比值明显降低。2.HBeAg阳性组IL-4与IL-10水平明显高于阴性组,而IL-12和IFN-γ水平明显低于阴性组。HBVDNA阳性组ET、IL-4与IL-10水平明显高于阴性组,而IL-12水平明显低于阴性组,提示HBeAg阳性与HBVDNA阳性也与IETM有关。3.乙肝患者内毒素水平分别与IL-4、IL-10水平呈显着正相关,与IL-12水平呈明显负相关。在内毒素阳性组患者,内毒素水平分别与IL-4、IL-10水平呈显着正相关,与IL-12、Th1/Th2比值呈负相关,而在阴性组则无此相关性。结果提示:IETM是引起Th1/Th2比值下降的原因之一。IETM可以引起IL-12水平降低即Th1降低,IL-4、IL-10水平升高即Th2升高而导致Th1/Th2失衡,病毒难以清除导致乙肝慢性化。实验叁:连续收集31例患者,根据临床分型:慢性丙型肝炎(chronic hepatitis C,CHC)15例,丙肝后肝硬化(HCV-related liver cirrhosis,CLC)10例,丙肝相关性肝癌(HCV-related hepatocellular carcinoma,HCC)6例,选取18例健康体检人群为正常对照,采血检测血浆内毒素(ET)、血清谷丙转氨酶(ALT)、总胆红素(TBIL)、血清白细胞介素10、12(IL-10、
参考文献：
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