王春红 李哲 王明菡 邓丽丽 王欢
[摘 要] 目的：本研究通过克隆人多巴胺受体（dopamine receptor，DRD）1基因的启动子区，构建含有该基因启动子序列的双荧光素酶报告基因载体并检测其活性，为研究DRD1基因的转录调控提供基础工具。方法：以人静脉血基因组DNA为模板，通过PCR扩增DRD1基因启动子序列并克隆至pGM-T载体，测序验证无误后酶切连接至萤火虫荧光素酶报告基因质粒pGL3-Basic，构建含有DRD1基因启动子的荧光素酶报告基因载体，采用阳离子脂质体法与内对照质粒pGL3-TK共转染人真核细胞系HEK-2293，同时以不含启动子的pGL3-Basic载体与内对照质粒pGL3-TK共转染作为阴性对照组，化学发光仪检测相对荧光强度。结果：通过酶切和测序验证重组荧光素酶报告基因载体的DRD1基因启动子区序列正确。与阴性对照组相比，该重组载体转染HEK293细胞后具有转录活性。结论：成功构建了含有DRD1基因启动子区的荧光素酶报告基因载体，为研究该基因的转录调控提供了基础工具。
[关键词]多巴胺受体D1基因 双荧光素酶报告基因 启动子 克隆
DOI:10.3760/cma.j.issn.0376-2491.2015.32.25
作者单位：110034，辽宁沈阳，沈阳医学院公共卫生学院毒理教研室
前言
多巴胺作为一种内源性神经递质，主要通过多巴胺受体调控其功能。多巴胺受体是能与多巴胺特异性结合而发挥其调节效应的蛋白类物质。多巴胺受体（dopamine receptor, DRD）为七个跨膜区域组成的G蛋白偶联受体家族，目前已分离出五种类型（DRD1～DRD5）。人类DRD五种亚型的基因位于不同的染色体上。DRD1基因位于第5号染色体短臂37区5带（5p37.5），全长3489bp [1]。人和大鼠的DRD1基因编码产物均为466个氨基酸，其同源性为91%，而跨膜部分的同源性为96%。DRD1受体基因的mRNA在纹状体、伏隔核和嗅结节等部位表达丰富，这些区域中DRD1受体的表达量也非常高 [2]。DRD1基因启动子区的多态性位点会通过调控转录活性来影响多巴胺受体1的产量，进而影响多巴胺神经递质的代谢，有研究发现该基因启动子区的核苷酸多态性位点可能与精神分裂症，双相情感障碍等疾病的发生有关 [3-7]。
目前，对DRD1基因启动子区的研究甚多，但仍未得出一个统一的结论，且很多研究多局限在对单独某一位点与疾病的回顾性分析，并未对具体调控做细致的分析。本研究拟通过构建含有DRD1基因启动子区序列的荧光素酶报告基因载体，细胞转染验证其表达活性，为进一步深入研究该基因的转录调控机制提供基础工具。
材料与方法
人DRD1基因启动子克隆
取枸橼酸钠抗凝的人静脉血3ml置于试管中，应用酚-氯仿法提取基因组DNA，所得DNA沉淀加适量的TE（10mol/L Tris-HCl, 1mol/L EDTA pH8.0）溶解，溶解后的DNA于4℃保存。
应用Primer 5.0软件设计特异性引物，根据pGL3-Basic载体（Promega，美国）多克隆位点选定限制性内切酶（见图1）。
划线部分分别为Kpn1 和Bgl2的酶切识别位点，引物委托生物公司合成（TaKaRa，大连）。PCR反应条件为：预变性95℃ 5min；变性 95℃ 1min，复性 60℃ 30s，延伸 72℃ 2min10S，循环35次；终末延伸72℃ 5min。扩增片段长度2001bp（-1990～+10）。采用浓度1%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增后的PCR产物。紫外光下切胶，并按照Gel DNA Extraction Kit（TaKaRa）说明书的操作步骤进行纯化。纯化后的PCR产物通过DNA A-Tailing Kit（TaKaRa）在3’端加一个碱基A后与pGM-T载体（天跟，北京）连接，转化感受态细胞TOP10（天跟），Kpn1 和Bgl2（Thermo，美国）双酶切及测序验证插入的片段。验证无误的质粒在双酶切后切胶纯化，与pGL3-Basic载体的连接。使用无内毒素质粒大量提取试剂盒（博迈德，北京）提取重组后的报告基因质粒，内对照质粒pGL3-TK和阴性对照质粒pGL3-Basic。
转染
HEK293细胞于DMEM/高糖培养基（含10%胎牛血清）（Hyclone，美国），37℃，5%CO2浓度，100%相对湿度条件下培养。将重组质粒和阴性对照质粒pGL-Basic稀释至100ng/μl，内对照质粒pRL-TK稀释至10ng/μl；然后将重组质粒和阴性对照质粒pGL-Basic与内对照质粒pRL-TK按5:1,10:1,20:1混合。选择对数生长期细胞接种于24孔板（1×105/孔），待细胞生长密度达80-90%，且分布均匀即可进行转染。使用Lipofectamine? 3000（Invitrogen，美国）转染，转染后培养6h后更换新鲜的DMEM培养基，转染后的24h收集细胞。
双荧光素酶活性分析
将上诉24孔板中的细胞用500μl1×PBS洗涤一次，弃液，加入100μl新鲜配置的1×PLB裂解液。与室温下在摇床震荡20min以充分裂解细胞。在0.5ml检测管中依次加入100μl LAR2溶液，20μl裂解液，混匀后将检测管放入Lumat3 LB9508管式发光检测仪（Berthold，德国）检测孔中，延迟3s，检测时间10s，测定出萤火虫荧光素酶的活力，然后在检测管中加入100μl新鲜配置的1×STOP液，混匀后再检测海肾荧光素酶的活力。计算两种荧光素酶的活力比值，即相对荧光强度。
结果
用PCR扩增和DNA重组技术，将5’端调控区片段（-1990～+10）定向克隆到pGL3-Basic质粒中，构建重组的荧光素酶报告基因质粒。重组质粒经过Kpn1 和Bgl2限制性内切酶的双酶切后，酶切片段长度2001bp，琼脂糖凝胶电泳鉴定结果见图2，酶切片段的长度与设计长度一致。测序结果显示插入片段与目的片段的序列完全一致。
重组质粒的荧光素酶活性分析
以pRL-TK载体作为转染的内参，pGL3-Basic载体作为荧光素酶活性的阴性对照，测定DRD1基因5’端启动子区的重组载体转染人胚肾293细胞后的荧光素酶相对活性。实验结果表明 DRD1基因5’端启动子区重组载体能表达荧光素酶。细胞共转染的效率受多种因素的影响，如细胞密度、脂质体和质粒的比例以及两个质粒之间的比例等，为了优化重组载体和内对照载体的比例，本实验使用3种不同比例进行共转染后发现以10:1比例转染的效果最好（图3）。
讨论
本研究选择位于起始密码上游的片段作为目的片段（-1990～+10），片段长度2001bp。通过对pGL3-Basic载体多克隆位点的查阅，我们选择Kpn1 和Bgl2限制性内切酶识别位点来构建克隆载体。由于待插入的片段较长，我们先通过TA克隆筛选出具有黏性末端的片段，再与表达载体进行连接。因为TA克隆简单，成功率高，PCR扩增产物通过加A反应在末端加一个碱基A，而T载体的缺口有一个凸出的T，正好可以配对。该TA克隆技术比其他的PCR克隆方法有更高的重组效率，一般超过90%的阳性克隆含有目的DNA片段 [8,9]。
我们选用萤火虫荧光素酶表达载体检测转录活性主要有如下的优点：荧光素酶的测定非常灵敏，不需要放射性物质；其分析的线性范围可以超过8个数量级，因此少量细胞的裂解产物就可以满足实验需要；荧光素酶分析还可以在96孔板里进行，方便大量转染细胞后的测定。在双荧光素酶报告基因系统中，以TK启动子转录的海肾腔肠荧光素酶作为内对照，可以降低细胞数目和状态、转录和裂解效率等差异造成的误差，使得结果更加可靠和准确[10,11]。
人HEK293细胞系胚胎肾细胞经腺病毒DNA剪切后转化而来。免疫染色，免疫印迹和微列阵分析表明该细胞表达神经丝（neurofilament，NF）亚基，NF-L，NF-M和NF-H以及通常在神经元表达的许多蛋白质 [12]。这表明此细胞和神经元会有意外的关联，也可能具有更多神经元特性的转录因子。而另一个可能的解释是与神经细胞系相比，该细胞生长代谢速率更快，因而在转染后的相同时间内，荧光素酶产量更多。
综上，本实验构建了含人DRD1基因启动子区的双荧光素酶报告基因系统，通过转染人真核细胞HEK293验证了其具有较强的转录活性，为进一步研究DRD1基因表达及转录调控机制提供了基础工具。
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论文作者:王春红, 李哲, 王明菡, 邓丽丽, 王欢
论文发表刊物:《中华医学杂志》2015年8月32期
论文发表时间:2015/11/6
标签：基因论文; 质粒论文; 转染论文; 子区论文; 荧光论文; 载体论文; 转录论文; 《中华医学杂志》2015年8月32期论文;