霍天明 覃秀秀 梁洪华 韦武扬 覃家锦(通讯作者)
（广西医科大学 广西南宁 530021）
【摘要】 目的：探讨丹参酮IIA（TA）对大鼠自体移植静脉移植物内膜增生的影响。方法：28只雄性SD大鼠随机分为实验组和对照组，建立颈外静脉移植颈总动脉模型。实验组予口服TA 13.3mg /（kg?d），对照组同方法予同剂量生理盐水。术后28d采集移植静脉桥，计算新生内膜厚度。人大隐静脉平滑肌细胞同样分为实验组（TA干预）和对照组（PBS干预）。MTT法观察细胞增殖情况，Transwell小室观察细胞迁移情况。结果：相比对照组移植静脉桥，实验组厚度显著减少[(58.13±5.40)μm vs（39.22±6.32)μm,P＜0.05]。实验组相比对照组，人大隐静脉平滑肌细胞增殖与迁移率均受到抑制（P＜0.05）。结论：TA可抑制静脉桥内膜增生，应与抑制静脉平滑肌细胞增殖与迁移有关。
【关键词】丹参酮IIA；静脉桥；内膜增生；再狭窄；平滑肌细胞
【中图分类号】R654 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2015）24-0010-02
Effect of tanshinone IIA on intimal hyperplasia in autogenous vein grafts of rats Huuo Tianming,Qin Xiuxiu,Liang Honghua,Wei Wuyang,Qin Jiajin. Guangxi Medical University,Nanning 530021,China
【Abstract】Objective To study the effects of tanshinone IIA(TA) on intimal hyperplasia in autogenous vein grafts of rats.Methods After jugular vein-to-artery bypass grafting surgery,28 male SD rats were randomly divided into the treatment group by orally administered of TA 13.3mg/(kg?d), and the control group by saline.The vein grafts were harvested after 28 days.HE staining was performed for histological changes of grafted wein intimal membranes. Human saphenous vein smooth muscle cells were treated with TA or PBS. Cell proliferation was assayed by MTT and migration was observed by Transwell chamber. Results Intimal thickness in treatment group was statistically lower when compared to control group[(58.13±5.40)μm vs(39.22±6.32)μm,P＜0.05] after 28 days. Cell proliferation and migration was markedly inhibited(P＜0.01). Conclusion TA can obviously inhibit hyperplasia of intimal thickness after venous transplantation, which may be related to the inhibition of smooth muscle cell proliferation and migration.
【Key words】Tanshinone IIA;Vein graft;Intimal hyperplasia;Restenosis;Smooth muscle cell
冠状动脉旁路移植术是现今治疗终末期冠脉严重病变的重要手段。大隐静脉是最常用的移植血管。但术后5～10年通畅率约50%[1]，使研究如何提高静脉桥血管远期通畅率成为热点。
丹参是一种传统的中药，主要应用心血管病领域。丹参酮IIA（TA）是丹参酮中主要产生药理作用物质。目前并不清楚TA对人大隐静脉平滑肌细胞增殖和迁移的作用及对动物在体模型的血管再狭窄是否有抑制作用。
故本研究通过建立自体静脉移植模型，同时进行人大隐静脉平滑肌细胞实验，探讨丹TA对血管内膜增生的影响。
1.材料与方法
1.1 动物实验
1.1.1主要材料
丹参酮IIA，HE染色试剂盒（南京建成生物技术有限公司），显微外科器械（宁波手术器械厂）。健康雄性SD大鼠28只，体重220～260g（广西医科大学实验动物中心）。胎牛血清，DMEM培养基，胰蛋白酶（南京维森特生物技术有限公司），MTT（美国Sigma公司），人第一代大隐静脉平滑肌细胞（1-0133，江阴齐氏生物科技有限公司）。
1.1.2动物模型建立
10%水合氯醛按300mg/kg腹腔注射麻醉。肝素钠按（200U/kg）使其肝素化。沿颈部正中偏右切开约2cm，暴露右颈外静脉，切取0.8～1cm远心端。于右侧气管旁游离颈总动脉至分叉处，罂粟碱稀释液喷洒动脉表面。阻断血流后中间离断，切除动脉约0.5cm。利用“cuff”管套管技术将切下颈外静脉吻合于颈总动脉，开放血管，清洗术野后缝合伤口。
1.1.3动物实验分组
采用计算机随机法分为TA治疗组（组A，n=14）和对照组（组B，n=14）。两组分别给予TA口服(13.3mg/kg?d)，及等体积生理盐水。
1.1.4标本收集与形态学观察
术后28d取各组移植静脉桥，4%多聚甲醛固定，脱水、透明、浸蜡、包埋，制成蜡块。HE染色后用Image-Pro 6.0软件测量横截面新生内膜厚度，取5处位置测量，计算平均厚度。
1.2 细胞实验
1.2.1血管平滑肌细胞培养
人大隐静脉平滑肌细胞（HSVSMC）购自江阴齐氏生物科技有限公司。胰酶消化后收获细胞，轻轻吹打成细胞悬液后种入25cm2培养瓶，置于37℃CO2饱和湿度孵箱培养。长满瓶底90%，消化传代，选择5～8代HSVSMC用于实验。
1.2.2实验分组及MTT测定
取对数生长期HUVSMCs一瓶，PBS洗涤2次，0.25%胰蛋白酶消化后，无血清DMEM配成单细胞悬液。按150μL细胞（5×103个）接种于96孔培养板。细胞融合至60%，饥饿24h后，分为治疗组，加入不同浓度TA（0.1，0.25，0.5，1.0μg/ml），对照组加入等量PBS。孵育24h后，每孔加入浓度为5mg/mL MTT溶液20μL，37℃孵育4h，吸弃液体，加入150μL DMSO，震荡使结晶溶解。酶标仪选取490nm波长测定各孔光吸收值。细胞增殖率按以下公式计算。
1.2.3迁移实验
按每室200μL（1×104个）将细胞悬液加入Transwell小室上室（8μm）。下室加入含10%胎牛血清800μLDMEM。治疗组于上室加入TA0.1，0.25，0.5，1.0，μg/ml，对照组加入等量PBS。孵箱孵育24小时后，棉签擦去上室内面平滑肌细胞，0.5%结晶紫染色30分钟，流水脱色，晾干。高倍显微镜下照相计数下层细胞：5个相邻视野计数后取平均值即为迁移个数。
1.3 统计学处理
采用SPSS 16.0统计软件进行统计分析，实验数据以均数±标准差(x-±s)表示。两组间比较用t检验，以P<0.05作为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 TA对静脉桥内膜增生的影响
光镜下见静脉桥切片，与对照组比较，治疗组新生内膜相对完整。内膜厚度明显减少，平滑肌细胞明显减少，差异有统计学意义（表1）。表明TA可明显抑制静脉桥狭窄发生。
表1 新生内膜厚度
组别 n 平均内膜厚度（μm）
对照组1458.13±5.40
实验组1439.22±6.32*
注：与对照组新生内膜厚度比较，*P＜0.05
2.2 TA对HSVSMC增殖的影响
TA对HSVSMC增殖有抑制作用。且随着浓度增高，抑制作用越强，呈明显剂量依赖效应（图1）。
图1 HSVSMC增殖率随TA浓度增高而降低
2.3 TA对HSVSMC迁移的影响
TA在浓度为0.1μg/ml时与对照组相比，对HSVSMC迁移率无显著性差异。在0.25、0.5、1.0、μg/ml时，呈浓度依赖性抑制细胞迁移（表2）。
表2 不同浓度TA对大隐静脉平滑肌细胞迁移的影响（x-±s）
浓度
（μg/ml） 0 0.1 0.25 0.5 1.0
迁移细胞数90.4±11.388.2±13.159.9±12.4*33.2±6.8*9.5±4.2*
注：*为P＜0.05与对照组浓度为0μg/ml比较
3.讨论
冠状动脉粥样硬化性心脏病简称冠心病。其病变晚期的主要治疗手段是冠脉旁路移植术。现阶段，大隐静脉以其容易获取、长度足够等优点是最常用的血管桥。但术后再狭窄的发生率较高，一直是扰我们的难题。
本实验通过建立大鼠自体静脉移植模型发现术后28天时，实验组静脉桥内膜厚度明显低于对照组。表明实验组静脉桥再狭窄程度较轻。
丹参是一种传统的中药，在心血管病领域应用较为广泛。丹参酮IIA（TA）是丹参酮的一种提取物。TA目前主要用于治疗冠心病。有研究已表明其在心血管领域的保护作用[2]，可抗血栓形成作用[3]，并有内皮细胞保护作用。也有研究表明TA可对人主动脉平滑肌细胞增殖产生抑制作用[4]。我们知道，静脉桥再狭窄发展过程包括诸多因素，比如：手术操作损伤；血管平滑肌细胞异常增生与迁移；内皮细胞功能紊乱等。其中血管平滑肌细胞的增殖与迁移是此病理过程关键部分[5]。我们猜想TA可通过抑制大隐静脉平滑肌细胞增殖与迁移，抑制静脉桥内膜增生。
本研究发现，人大隐静脉平滑肌细胞在加入TA后，增殖率相比对照组明显下降。同时，其迁移能力也明显受到抑制（P＜0.05）。有研究表明，TA可通过 ERK1/2通路抑制大鼠颈动脉血管平滑肌细胞增殖[6]。而TA对人大隐静脉的抑制作用是否同样经过这个通路，还需进一步研究。
综上所述，TA可通过抑制静脉桥平滑肌细胞的增殖和迁移，抑制新生内膜增生，有效减轻移植静脉再狭窄。但此研究并未作具体机制阐明，还需进一步研究。
【参考文献】
[1]刘巍，周玉杰，刘宇扬等.静脉桥病变的介入治疗及临床预后观察[J].心肺血管病杂志，2013，32：247-250.
[2]Niu XL,Ichimori K,Yang X,et cl.Tanshinone IIA inhibits low density lipoprotein oxidation in vitro[J].Free Radic Res. 2000;33(3):305-312.
[3]Zhou GY,Zhao BL,Hou JW,et al.Protective effects of sodium tanshinone IIA suophonate against adriamycin induced lipid perox-idation in mice hearts in vivo and in vitro[J].Pharmacol Res. 1999;40(6):487-491.
[4]Du.Inhibition of proliferation of human smooth muscle cells by tanshi-none IIA[J].West China Journal of Pharmaceutical Sciences;14, 1-3.
[5]Li FD,Sexton KW,Hocking KM,et al.Intimal thickness associated with endothelial dysfunction in human vein grafts[J].J Surg Res.2013;180(1):e55-62.
[6]Li X1,Du JR,Yu Y,et al.Tanshinone IIA inhibits smooth muscle proliferation and intimal hyperplasia in the rat carotid balloon-injured model through inhibition of MAPK signaling pathway[J].J Ethnopharmacol.2010;129(2):273-279.
基金项目：广西自然科学基金（编号：2013GXNSFAA019151）
论文作者:霍天明,覃秀秀,梁洪华,韦武扬,覃家锦(通讯作者)
论文发表刊物:《心理医生》2015年24期
论文发表时间:2016/6/21
标签：静脉论文; 平滑肌论文; 细胞论文; 内膜论文; 实验组论文; 抑制论文; 对照组论文; 《心理医生》2015年24期论文;