王宇婧[1]2003年在《海洋低温碱性蛋白酶的化学特性研究》文中提出本论文对碱性蛋白酶在国内外的研究与进展及目前海洋低温酶的研究状况进行了综述，阐明了海洋低温碱性蛋白酶的研究对国民经济的发展所起的重大作用，并指出了现有研究工作的不足之处和今后的发展方向。 论文首次对一种应用我国海洋嗜极微生物代谢产物并通过现代生物工程手段开发出的一类新型酶——海洋低温碱性蛋白酶(YS-80-122)的化学特性展开研究，通过对其分离纯化与制备工艺的探讨，理化性质和催化动力学的研究，及利用计算机模建方式对该酶的结构进行预测，获得了该碱性蛋白酶的各项性能参数和许多有关于结构与活性中心的有价值信息，为今后进一步开展该酶的研究与改造、生产与应用奠定理论基础。本文主要开展了以下几个方面的工作： 海洋低温碱性蛋白酶的分离纯化与制备工艺研究：①将该酶的发酵液分别经过高速冷冻离心机离心(6000转／分，4℃)去除菌体和其它有机粘性物质，错流超滤系统(截留分子量10，000Dal)去除小分子量杂质，并经冷冻干燥获得可供工业使用的粗酶；②将上一步经超滤获得的澄清发酵液分别经过盐析(30％-65％)，等电聚焦制备电泳(12W)，SephacryI S-200凝胶过滤，最后冷冻干燥，获得试剂酶，经反相C8 HPLC和SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，该酶纯度已达色谱纯及电泳纯。 海洋低温碱性蛋白酶的化学性质研究：①该酶经SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳和HPLC凝胶过滤测得其分子量为49300±1000Dal，经薄层聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦测定酶的等电点为pH8.5，与已知碱性蛋白酶不同，由于其来自于海洋，属于一种新型碱性蛋白酶。②讨论了pH和温度对酶活性和稳定性的影响。通过采取两维实验数据结果和叁维数据模拟相结合的手段，计算出酶活方程，r~2＞0.9，求得其反应最适pH为9.5，最适温度为30℃。在对该酶的pH和温度稳定性研究中发现，该酶在低温条件下(t≤30℃)具有较好的稳定性，保持相对低pH(pH≤8)有利于保持酶的稳定，且酶活性随pH和温度的升高而下降。⑧研究了常见金属离子，增稠剂、表面活性剂和氧化剂H_2O_2对酶活的影响。研究发现多数的金属离子对该酶不具有抑制作用，Pb~(2+)、Ag~+、Cu~(2+)对该酶有较强的抑制作用。该酶与常见海洋低沮碱性蛋白醉的化学特性研究的增稠剂、表面活性剂、氧化剂H八有良好的配伍性，其性质十分有利于今后该酶在洗涤行业的进一步开发。但实验也发现，金属鳌合剂如EDTA能严重引起该酶失活，这一性质与以往发现的碱性蛋白酶有很大的不同，这与其独特的活性中心有关。 海洋低温碱性蛋白酶的催化动力学研究:①在以酪蛋白为底物的催化反应体系中研究了PH和温度对酶催化反应动力学参数的影响。求得其反应活化能Ea=33.ZkJ/mol;反应的温度系数Q:0=10，，‘33f“‘’，、习;pKa=9.3、p介10.7、最适p除10.0，并根据所测的PK值可以推断出该低温碱性蛋白酶的活性部位可能会存在酪氨酸酚轻基或疏基等结构，而不包含a一梭基、a一氨基、门冬氨酸p一梭基、以及谷氨酸丫一竣基等常见氨基酸侧链基团。②EDTA对酶的抑制作用研究，通过动力学参数凡的变化，经过计算得到EDTA种酶主要产生“竞争性”抑制，所以该酶应该具有某些金属蛋白酶的性质，其活性中心应该包含M扩+，znz十，c尹，Fe2+，cu2+等金属元素，EDTA的加入将金属原子从酶蛋白剥离而引起失活，在实验中发现，加入乙萨+后，失活的酶活性又逐渐恢复，因此根据动力学数据推断，ZnZ+是该酶活性中心所包含的金属元素。 海洋低温碱性蛋白酶的同源模建与结构预测:①用DNASTAR分析此酶得出其分子量为49903.92Dal，等电点PI为8.52，与前面实验基本吻合。此酶含有459个氨基酸。疏水性氨基酸148个，极性氨基酸153个。BLAST同源性分析其与碱性蛋白酶的相似性很高，同源性可达76%，应该具有的碱性蛋白酶性质。②进行结构模建获得结构比较合理的模建结果，显示了锌离子的叁个组氨酸残基结合位点，也是其催化位点。与前述实验推断其活性中心应有金属离子ZnZ+存在的结果吻合，表明该模建具有较高的理论价值和实际意义。
郝建华[2]2003年在《海洋低温碱性蛋白酶的基因克隆、序列分析及结构模建和功能研究》文中研究说明海洋低温碱性蛋白酶(Marine Low-temperature Alkaline Protease，MLAP)是由一海洋杆菌—QD80产的一种胞外酶。本论文主要进行了海洋低温碱性蛋白酶的克隆和生物信息学分析及其空间结构的模建： 利用末端半补齐技术构建了海洋杆菌QD80的基因文库。末端半补齐技术的优点有：(1)彻底消除载体自环化的可能性；(2)消除了插入片段自身相互连接的可能性；(3)同常用的碱性磷酸酯酶法相比较，采用半补齐技术其连接产物的转化率不受影响。 用酪蛋白平板法和电泳图相比较法的活性筛选方法从基因文库中筛选到一株阳性克隆(命名为pHH1)。序列测定分析表明，此重组质粒包含有长度为1377bp低温碱性蛋白酶基因的完整的开放读码框架(ORF)和上游基因调控序列。此片段编码由459个氨基酸组成的酶，计算分子量为49903.92Dal。通过构建表达载体在大肠杆菌中得到了表达。 利用已有的生物信息学软件对其进行了分析。结果表明：它与铜绿假单胞菌的同源性较高，有可能是假单胞菌属。该酶含有两个结构域，分别为Zincins催化结构域和金属蛋白酶羧基端结构域。同源性分析表明此蛋白酶含有一个(?)xx(?)x(?)x(?)的基元。 采用不同的模建方法对海洋低温碱性蛋白酶进行了同源模建，然后对其模建结果进行了分析。结果表明用Geno3d预测方法得到的结果比用其它方法的模型更符合立体化学特性和生物学功能的规律。模建的结果表明此蛋白酶含有一个狭缝，底物就在此处进行催化水解反应。同时对其低温适应性进行了预测，结果表明氢键发挥了重要作用。 为了验证碱性蛋白酶的生物信息学分析结果和模建的结果，我们对其等电点、分子量、催化性基团组氨酸以及锌离子、钙离子和EDTA的影响进行了实验分析。同时对其低温适应性进行了验证。结果表明模建的结果是符合酶的功能和结构的。 本结果有相当的先进性和技术创新性，填补了国内在海洋低温酶研究领域的一些空白，对加速开发我国海洋生物活性物质资源有重要的理论和实际意义。
陈静[3]2005年在《交替假单胞菌（Pseudoalteromonas）CHS菌株产碱性蛋白酶的研究》文中研究说明采集连云港海域的贝类、海水、深海鱼类、海底沉积物等样品,筛选产碱性蛋白酶的菌株。从分离到的217株细菌中,获得23株碱性蛋白酶酶活高的菌株,对其中两株海洋细菌CHS和SY菌株进行生理生化和16SrDNA序列分析,初步鉴定为交替假单胞菌。以CHS和SY两株菌为出发菌株,研究它们发酵产碱性蛋白酶的条件,并分离提纯了CHS菌株产生的碱性蛋白酶,初步研究了其酶学性质。 CHS和SY菌株最适产酶发酵条件为:15℃,24h,种龄16h,2.5%接种量,摇床转速180r/min;CHS菌株起始pH为9.0,SY菌株为pH8.0。葡萄糖,蛋白胨是两菌株发酵产酶较好的碳、氮源。 CHS菌株发酵液经离心、硫酸铵盐析、透析、离子交换层析和分子筛层析后,酶的比活由59.4U/mg提高到860.8U/mg,提高了14.5倍,回收率为3.24%。在SDS-PAGE上显示一条带,达电泳纯,由SDS-PAGE初测分子量为56.9kDa。 对CHS菌株碱性蛋白酶的性质研究表明,酶最适作用温度为40℃,最适作用pH为10.0,在40℃保温30min酶活下降约50%,热稳定性较差,在pH8.0-11.0有较好的稳定性。PMSF能强烈抑制酶的活性,而EDTA和IAA对该酶的抑制作用不太明显。Ca~(2+)、Cu~(2+)对酶有一定激活作用,Ag~+对酶有抑制作用;酶对乙醇和尿素有较强的抗性,对吐温有一定抗性,SDS对其有抑制作用。
郝建华, 王跃军, 袁翠, 孙谧[4]2006年在《海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶的化学修饰》文中提出海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶(QDAPr)具有良好的低温适应性,且与常见的增稠剂及表面活性剂有良好的配伍性.因此该蛋白酶在日用化学领域,尤其是低温洗涤领域,具有广泛的应用价值.为研究其结构与功能之间的关系,用EDC、PMSF、N-AI、2,3-丁二酮等8种化学修饰剂修饰该低温碱性蛋白酶,然后检测残余酶活力,借以研究酶分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系.结果表明,羧基、丝氨酸、ε-氨基、巯基等残基与酶活性无关;而色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基侧链的化学修饰引起酶活性的大幅度下降,说明色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基是酶活力所必需的基团.精氨酸残基侧链的化学修饰引起酶活性的轻微下降,说明精氨酸对酶活性具有一定贡献,但不处于活性中心.图5表2参18
郝建华, 孙谧, 王跃军, 刘均忠[5]2005年在《海洋细菌QD80低温碱性蛋白酶的基因克隆和性质》文中研究指明对海洋细菌QD80所产低温碱性蛋白酶进行了基因克隆和序列分析,对此酶的性质进行了初步研究.此酶基因开放阅读框架为1377bp,分子量为49.9kD.此序列上游-8bp处为该基因的SD序列,-10区和-35区分别有5′TAGAAT3′和5′TTGACC3′的保守序列.该酶最适pH为9.5,最适反应温度为30℃,在10℃酶活力仍能保持30%以上.该酶对氧化剂H2O2的抗氧化作用明显,浓度达到4gL时酶活仍保留85%.该蛋白酶的低温适应性和抗氧化特性将对其在低温洗涤领域的应用提供广泛的潜在应用价值.
刘瑶[6]2015年在《一株来自海洋淤泥的铜绿假单胞菌株DES-3的鉴定及基因ap02对其产碱性蛋白酶的影响研究》文中研究指明海洋是地球上最大的生态系统,其多样独特的环境造就了有别于其它生态环境的微生物资源,仅海底软泥中的生物量就占地球总生物量的10%-30%之多。碱性蛋白酶广泛存在于细菌、真菌和动植物体内,可用于洗涤、食品、纺织、医药和生命科学等领域,其中洗涤行业应用最为广泛。从海洋环境中筛选出高产碱性蛋白酶菌株已成为研究热点。本研究以辽宁营口海洋淤泥为环境样品,采用蛋白酶的活性筛选策略,得到一株产蛋白酶优势菌株。通过微生物形态学特征、生理生化性质、16SrDNA基因鉴定以及系统发育树等方面的分析,判断该菌属于铜绿假单胞杆菌属,命名为Pseudomonas aeruginosa sp. DES-3。其发酵液经硫酸铵分级沉淀和超滤后,测得其最适反应温度和pH分别为55℃和9.0,在4-55℃和pH 7.0-9.0的范围内有很好的热稳定性和pH耐受性。Fe~(2+)、Ca~(2+)对酶活有明显促进作用；Zn~(2+)、Cu~(2+)、Fe3+、Pb~(2+)、Ni~(2+)对酶活有明显抑制作用。PMSF会彻底抑制酶活,推测该酶是丝氨酸蛋白酶类,能与部分表面活性剂较好的互溶。前期实验室构建了宏基因组AL01文库,编号pGXAA2011拥有一个完整蛋白酶基因的阳性克隆。生物信息学分析结果表明,该阳性克隆包括的一个长为1146 bp的ORF,编码381个氨基酸,蛋白分子量约为39.46 kDa,命名该基因为ap02。在氨基酸水平上,与Salinibacillus aidingensis(登录号为WP 044156525.1)的peptidase基因一致性为100%,该序列来自全基因组测序的功能注释,暂无其他生化特性研究。扩增基因ap02与表达载体pET-32a(+)连接转化至Escherichia coli BL21(DE3)pLysS表达宿主中,构建重组表达载体。测得粗酶最适反应温度和pH分别为65℃和9.0,在4-45℃和pH 7.0-9.0范围内有很高的热稳定性和pH耐受性。Ca~(2+)、Mn~(2+)对酶活有明显激活作用,Fe~(2+)、Cu~(2+)、Ba~(2+)、Zn~(2+)对酶活有明显的抑制作用。PMSF和EDTA对酶活力有强烈抑制作用,推测该酶属于丝氨酸蛋白酶类,且有一定的金属依赖性。将基因ap02与广宿主表达载体pMP2444和pBBR1MCS-5连接,转化至以0.3 M蔗糖溶液为电转化介质的Pseudomonas aeruginosa sp. DES-3感受态细胞中,构建基因工程菌株。研究发现在同一温度下,两个基因工程菌株的酶活力均比野生菌株DES-3的酶活力稍低,但基因工程菌株DES-3/pBBRlMCS-5-ap02的最适反应温度为60℃C,较野生菌株的提高了5℃。本研究打破常规对菌株改造的方法,尝试将外源蛋白酶基因导入到野生菌株中,改变了发酵液的最适反应温度,对菌株改造和相应工业应用提供一定技术参考。
陈静, 王淑军, 黄炜, 牛天贵, 陆兆新[7]2005年在《产低温碱性蛋白酶海洋适冷菌SY的筛选》文中提出从连云港海域、港口、远洋捕捞船及鱼市等地采集的海水和各类海鱼、贝类等样品中分离到217株产蛋白酶的细菌,并从中得到1株产低温碱性蛋白酶的海洋适冷细菌—SY。研究表明,该菌株最适生长温度和最适产酶温度均在15℃左右,0℃下仍可生长;具有一定的耐盐性和嗜盐性,无盐条件不能生长,在3%的NaCl盐浓度时,生长达到最高峰;最适生长和最适产酶pH均为8.0;SY菌所产的蛋白酶可能为一种丝氨酸蛋白酶,酶最适作用温度为50℃,最适作用pH为9.0;酶的热稳定性差,50℃保温20min,酶活下降40%。
王海亭, 孙谧, 王宇婧, 丁彩凤, 王海英[8]2002年在《黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的应用研究Ⅱ.——洗涤剂用包覆型酶的配伍特性与应用效果评价》文中研究指明论述了洗涤剂中的低温碱性蛋白酶的物理和化学特性、去污性能及它与常规洗涤助剂的配伍性。实验结果表明 ,该包覆型酶最适反应温度为 35℃ ,p H为 10。在温度 4 0℃以下、p H5～ 11范围内均具有良好的稳定性 ,同时对低温有突出的适应性和抗氧化稳定性 ;与常规洗涤剂各成分配伍性良好 ,且低温条件下能有效地降解蛋白污渍 ,主要性能均优于国内外同类产品
庄志凯[9]2011年在《凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶分离纯化与酶学特性研究》文中提出虾头是去头虾、虾仁等产品加工过程中的副产物,全国年产虾头约20万吨,其中凡纳滨对虾虾头占70%。虾头不仅含有丰富的蛋白质等营养成分,还含有丰富的内源蛋白酶,这些蛋白酶在一定条件易导致虾头发生自溶作用,造成虾头腐烂变质,致使虾头得不到高值化利用,这不仅造成了资源的浪费,而且带来了严重的环境污染。为了深刻认识虾头内源酶的特性,有效保持虾头贮藏过程中的品质,充分利用虾头内源蛋白酶廉价回收虾头蛋白等营养成分提供基础数据,本论文首先研究了虾头内源蛋白酶活性随pH的变化规律,确定了虾头中存在两类内源性蛋白酶,其最适pH分别为2.0和8.0,在此基础对两类内源性蛋白酶的提取纯化和酶学特性进行了系统研究,并采用液相-质谱联用技术对这两种蛋白酶的同源性进行了初步分析,主要研究结果如下:1、以温度、pH和料液比等单因素对凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶活性影响结果为基础,采用正交实验对凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶最佳提取工艺条件进行了优化,并对两类内源蛋白酶硫酸铵分级沉淀的最佳饱和度进行了研究。结果表明:酸性蛋白酶最佳提取条件为缓冲溶液pH3.0,料液比1:2,温度30℃。酸性蛋白酶硫酸铵一级沉淀的饱和度为10%,硫酸铵二级沉淀饱和度为50%;碱性蛋白酶最佳提取条件为缓冲溶液pH8.0,料液比1:3,温度50℃。碱性蛋白酶硫酸铵一级沉淀饱和度为20%,硫酸铵二级沉淀饱和度80%。2、采用Q- Sepharose F. F阴离子交换层析和Sephadex G-150凝胶过滤层对凡纳滨对虾虾头内源碱性蛋白酶进行了纯化,并用SDS-PAGE对纯度与分子量进行了评价。结果表明,纯化后的碱性蛋白酶比活为1386.16U/mg,纯化倍数达到了26.50,得率为32.8%,分子量为79.95kDa。3、采用Sephadex G-100凝胶层析和DEAE-Sepharose F.F阴离子交换层析对凡纳缤对虾虾头内源酸性蛋白酶进行了纯化,并用SDS-PAGE对纯度与分子量进行了评价。结果表明,纯化得到电泳纯级的内源酸性蛋白酶,其比活为698.09U/mg,纯化倍数达到15.7倍,得率为20.20%,分子量为27.45kDa。4、凡纳缤对虾虾头内源碱性蛋白酶酶学特性研究结果表明,该酶最适pH和最适温度分别为8.0和50℃,热稳性定较好,动力学参数Km和Vmax值分别为2.54g/L和7.11μg/min,金属离子Fe~(3+)、Mn~(2+)、Hg~+,TryPsin inhibitor均能完全抑制其活性,DTT对其有激活作用,该蛋白酶属于胰蛋白酶酶类。5、凡纳缤对虾虾头内源酸性蛋白酶酶学特性研究结果表明,该酶最适pH和最适温度分别为3.0和30℃,热稳定性和pH稳定性均较差,动力学参数Km和Vmax值分别为2.01g/L和26.39μg/min,金属离子Hg~+,Pepstatin A和EDTA均能完全抑制其活性,Ca~(2+)对其有激活作用,该酶属金属蛋白酶,性质类似于胃蛋白酶类。6、采用分子荧光法和傅里叶红外光谱法研究了凡纳缤对虾虾头两类内源蛋白酶空间构象特性,结果表明,在λex = 278nm和295nm为激发波长条件下,内源碱性蛋白酶随着pH和离子强度的增大荧光强度上升,但荧光发射峰的位置并未发生移动,不过内源酸性蛋白酶二级结构发生了改变。在红外光谱扫描范围为900-1700cm-1,分辨率为为4cm-1条件下,两种内源性蛋白酶红外光谱都呈现出α-螺旋和β-折迭的特征,但两类蛋白酶谱带数据有所差异。7、利用LC-ESI-MS/MS对凡纳滨对虾虾头两类内源性蛋白酶同源类进行了初步分析,将检测到两种内源性蛋白酶的部分氨基酸序列分别与不同物种的胰蛋白酶和胃蛋白酶氨基酸序列于Vector NTI suite 8.0软件上进行序列比对,结果表明,发现凡纳滨对虾虾头内源碱性蛋白酶与猪的胰蛋白酶具有很高的同源性,均含有氨基酸序列LSSPATLNSRVATVSLPR;凡纳滨对虾虾头内源酸性蛋白酶与非洲蟾蜍的胃亚蛋白酶具有很高的同源性,均含有氨基酸序列EFGLSETEPGTNF。
杨胜远, 陆兆新[10]2004年在《微生物低温碱性蛋白酶的研究进展》文中研究表明综述了微生物源低温碱性蛋白酶的研究状况 ,包括酶的微生物来源、生产菌株的选育、酶学特性、酶的结构及人工进化和安全性评价 ,并对其前景进行了展望
参考文献：
[1]. 海洋低温碱性蛋白酶的化学特性研究[D]. 王宇婧. 中国海洋大学. 2003
[2]. 海洋低温碱性蛋白酶的基因克隆、序列分析及结构模建和功能研究[D]. 郝建华. 中国海洋大学. 2003
[3]. 交替假单胞菌（Pseudoalteromonas）CHS菌株产碱性蛋白酶的研究[D]. 陈静. 中国农业大学. 2005
[4]. 海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶的化学修饰[J]. 郝建华, 王跃军, 袁翠, 孙谧. 应用与环境生物学报. 2006
[5]. 海洋细菌QD80低温碱性蛋白酶的基因克隆和性质[J]. 郝建华, 孙谧, 王跃军, 刘均忠. 中国生物化学与分子生物学报. 2005
[6]. 一株来自海洋淤泥的铜绿假单胞菌株DES-3的鉴定及基因ap02对其产碱性蛋白酶的影响研究[D]. 刘瑶. 广西大学. 2015
[7]. 产低温碱性蛋白酶海洋适冷菌SY的筛选[J]. 陈静, 王淑军, 黄炜, 牛天贵, 陆兆新. 微生物学杂志. 2005
[8]. 黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的应用研究Ⅱ.——洗涤剂用包覆型酶的配伍特性与应用效果评价[J]. 王海亭, 孙谧, 王宇婧, 丁彩凤, 王海英. 海洋水产研究. 2002
[9]. 凡纳滨对虾虾头内源性蛋白酶分离纯化与酶学特性研究[D]. 庄志凯. 广东海洋大学. 2011
[10]. 微生物低温碱性蛋白酶的研究进展[J]. 杨胜远, 陆兆新. 食品与发酵工业. 2004