王亚辉1 徐洪艳3 韩风雨2 李洪泽1 孔新颖4 刘福青5（1.内蒙古天奇中蒙制药股份有限公司；2.内蒙古天奇药业投资（集团）有限公司；3.赤峰陆尔草中蒙药科技有限公司；4.内蒙古蒙吉药业科技有限责任公司；5.内蒙古博泰现代蒙药制剂研究开发有限公司；024000）
【摘要】目的：建立黄芪建中丸的微生物限度检查法并对其进行验证，保证微生物限度检查方法的科学性以及检验结果的准确和可靠性。方法：按《中国药典》2010年版一部附录微生物限度检查法项下方法对5 种规定试验菌株的回收率进行测定，对控制菌的检查法进行验证。结果：黄芪建中丸对大肠埃希菌、黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌无抑菌活性，回收率均不低于70%。控制菌的验证试验中，两种阳性控制菌大肠埃希菌、大肠菌群生长良好，阴性菌对照组未检出阳性对照菌。结论：确认了黄芪建中丸的微生物限度的检查方法，即用常规法检查黄芪建中丸的细菌霉菌酵母菌和控制菌结果可靠。
【关键词】方法验证；微生物限度检查；培养基稀释法【中图分类号】R2 【文献标号】A 【文章编号】1671-8725（2014）11-0144-02
建立黄芪建中丸的微生物限度检查法进行方法验证，以保证其微生物限度检查方法的科学性和准确性。黄芪建中丸主要由黄芪、肉桂、白芍、甘草、大枣五味组成，具有补气散寒，健胃和中的功效。用于脾胃虚寒所致的恶寒腹痛，身体虚弱。在建立黄芪建中丸的微生物限度检查法时采用<< 中国药典>>2010 年版一部附录微生物限度检查法对细菌霉菌和酵母菌计数方法验证，对规定的5种试验菌的回收率逐一进行验证及控制菌的检查方法验证，以证明所采用的方法适合于该药物微生物检查方法。
1 试验材料
1.1 试验环境在环境洁净度万级，局部洁净度百级的单向流空气的无菌室中进行。
1.2 培养基：营养琼脂培养基（批号090113）玫瑰红钠琼脂培养基（批号080522）胆盐乳糖培养基（批号090110）胆盐乳糖发酵培养基（批号090110）营养肉汤培养基（批号080612）改良马丁培养基（批号081105）MUG培养基（批号08080）曙红亚甲蓝琼脂培养基（批号08080）
1.3 试验菌株大肠埃希菌［CMCC(B)44102］金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］白色念珠菌［CMCC(F)98001］黑曲霉菌［CMCC(F)98003］上述培养基各菌株均有中国药品生物制品检定所提供。
2 实验部分（一） 细菌，霉菌及酵母菌计数方法的验证
2.1 菌液制备
2.1.1 取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，35℃～37℃培养18h～24h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至每ml含菌数为50cfu～100cfu的菌液备用。
2.1.2 取白色念珠菌的新鲜培养物接改良马丁培养基中，23℃～28℃培养的24h～48h，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至菌液浓度为每1ml含菌数50cfu～100cfu。
2.1.3 接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23℃～28℃培养5d～7d，加0.9%无菌氯化钠溶液3ml～5ml洗下霉菌孢___________子，吸出孢子液，取1ml 孢子液至0.9%无菌氯化钠溶液9ml 中，使菌液浓度为50cfu/ml～100cfu/ml。
2.2 供试液的制备取供试品10g，加pH7.0无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液至100ml，振摇至供试品分散均匀，制成1∶10的供试液。
2.3 试验方法
2.3.1 药典常规法，取1毫升供试液注皿，分别加入五株试验菌，测定回收率。
2.3.2 培养基稀释法，取0.2 毫升供试品，分别加入五株试验菌，测定回收率。
2.4 回收率测定
2.4.1 菌液组分别取已制备好的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌黑曲霉、白色念珠菌的菌液1ml(含50～100cfu)，采用平皿计数法，含金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的实验平皿倾注营养琼脂培养基，每株试验组平行制备2个平皿，置30℃～35℃培养48h，计数;白色念珠菌、黑曲霉的实验平皿倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验组平行制备2个平皿，置23℃～28℃培养72h，计数。测定菌液中每毫升的活菌数。
2.4.2 供试品对照组取1∶100 供试液1ml，倾注营养琼脂培养基，每株试验组平行制备2个平皿，置30℃～35℃培养48h，测定供试品本底的细菌数;取1∶10 供试液1ml，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验组平行制备2个平皿，置23℃～28℃培养72h，测定供试品本底的霉菌和酵母菌数。
2.4.3 试验组取1∶100的供试液1ml和上述细菌菌液1ml(含50cfu-100cfu 实验菌)，分别注入同一平皿中，倾注营养琼脂培养基，置30℃～35℃培养48h，每株试验组平行制备2 个平皿，进行细菌计数和回收率计算。
取1∶10 的供试液1ml 和上述真菌菌液1ml (含50cfu～100cfu 实验菌)分别注入同一平皿中，倾注玫瑰红钠琼脂培养基，置23℃～28℃培养72h,每株试验组平行制备2个平皿，进行霉菌和酵母菌计数和回收率计算。
2.4.4 回收率计算
2.4 结果判断从上表可以看出本品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌无抑菌活性, 回收率均不低于70%。
3 控制菌检查方法的验证
3.1 大肠埃希菌的验证
3.1.1 菌液的制备取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，35℃～3℃培养18h～24h，用0.9%无菌氯钠溶液稀释至每ml含菌数为10cfu～100cfu的菌液备用。
3.1.2 供试液的制备取本品10ml，加pH7.0 无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液100ml，振摇至供试液分散均匀，制成1∶10的供试液。
3.2 验证方法3.2.1 空白对照组取稀释液10ml，加至胆盐乳糖培养基100ml中，平行制备2 个平皿,置35℃～37℃培养18h～24h。
3.2.2 阴性菌对照组取1∶10 的供试液10ml 及金黄色葡萄菌10cfu～100cfu 加至胆盐乳糖培养基100ml 中，平行制备2 个平皿, 置35℃～37℃培养18h～24h。依大肠埃希菌检查法进行检查。
3.2.3 试验组取1∶10 的供试液10ml，加至胆盐乳糖培养基100ml 中加入大肠埃希菌10cfu～100cfu，平行制备2 个平皿, 置35℃～37℃培养18h～24h。取上述培养物0.2ml，分别加入含5ml 的4- 甲基伞形酮葡糖苷酸培养基(MUG)试管中，置35℃～37℃培养5h～24h 并观察结果。
3.3 大肠菌群的验证3.3.1 菌液的制备取金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，35℃～37℃培养18h～24h，用0.9%无菌氯钠溶液稀释至每ml含菌数为10cfu～100cfu 的菌液备用。
3.3.2 供试液的制备取本品10ml，加pH7.0 无菌氯化钠－蛋白胨缓冲液100ml，振摇至供试液分散均匀，制成1∶10 的供试液，取1ml 置pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液9ml 中制成1∶100的供试液，以此类推，至1∶1000的供试液。
3.3.3 验证方法空白对照组:取稀释液1ml，加入10ml 胆盐乳糖发酵培养基管3支中，平行制备2 个平皿,置35℃～37℃培养18h～24h。依大肠菌群检查法进行检查。
试验组：取1∶10 的供试液1ml，1∶100 的供试液1ml，1∶1000的供试液1ml，分别加入10ml胆盐乳糖发酵培养基管3支中，同时分别加入10cfu～100cfu 大肠埃希菌，平行制备2 个平皿,依大肠菌群检查法进行检查。
阴性菌对照组：取1∶10 的供试液1ml，1∶100 的供试液1ml，1∶1000 的供试液1ml，分别加入10ml胆盐乳糖发酵培养基管3支中，同时分别加入10cfu～100cfu 金黄色葡萄球菌，平行制备2 个平皿,依大肠菌群检查法进行检查。
3.4 试验结果3.4.1 大肠埃希菌的验证中MUG 培养基试管于366nm紫外光下观察,同时未接种的MUG培养基作为本底对照,试验组管内培养物呈现荧光为阳性,阴性对照组和空白对照组不呈现荧光,为阴性。
3.4.2 大肠菌群的验证中阴性对照组和空白对照未产酸产气,试验组产酸产气,将培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基的平板上培养,平板有菌生成。
3.5 结果判断从上表可以看出，试验组检出试验菌，阴性对照组未检出阳性对照菌，说明本品用药典常规法即可检出大肠埃希菌，大肠菌群。
4 结论
黄芪建中丸的微生物限度的检查方法，本品对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉菌无抑菌活性, 回收率均不低于70%。控制菌的检查中试验组检出试验菌，阴性对照组未检出阳性对照菌。即用常规法检查黄芪建中丸的细菌、霉菌、酵母菌和控制菌结果可靠。
参考文献[1] 庄惠清,陈华锋,柯鹏颉.《福建医药杂志》.2010,第2 期.[2] 邱燕.《福建中医药》,2010 第4 期.[3] 《黑龙江医药》2008 年,第4 期95-96 页.[4] 《中国药典》2010 年版一部附录XIIC.
论文作者:王亚辉1 徐洪艳3 韩风雨2 李洪泽1 孔新颖4 刘福青5
论文发表刊物:《医师在线》2014年第11期(下)供稿
论文发表时间:2015-6-12
标签：培养基论文; 建中论文; 大肠论文; 检查法论文; 琼脂论文; 回收率论文; 黄芪论文; 《医师在线》2014年第11期(下)供稿论文;