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摘 要
半日花烷型二萜内酯类化合物是穿心莲抗感染、抗病毒的药效成分。虽然该类成分临床上用于治疗呼吸道感染，但其对哪些呼吸道病毒具有抑制作用，其抗病毒构效关系如何并不明确。采用化学合成法对其结构骨架中的某些位置进行衍生化，由于产物修饰位点和立体构型的不确定性，存在一定困难。本课题组前期在对穿心莲主要二萜内酯进行微生物转化研究的过程中，得到了一些双环骨架结构发生羟基化（2， 7， 8， 9， 18位）及发酵产物环外双键迁移至环内（Δ7，8，Δ8，9 ）等的转化产物，其中，7-羟基化及环外双键迁移至环内（Δ7，8，Δ8，9 ）的转化产物显示出了较优的生物活性。因此，本论文主要任务是完成其半合成研究。并在此基础上进一步优化合成路线，提高反应总收率。并最终制备5-10克纯度在99.0%以上的成品，以供药理测试使用。
关键词：穿心莲内酯，发酵产物，半合成
第一章 绪论
1.1 呼吸道疾病的研究
呼吸道病毒是能够侵犯人类的呼吸道并引起呼吸道局部病变，或仅以呼吸道为侵入门户主要引起呼吸道外组织器官病变的病毒。呼吸道病毒包括正粘病毒科 （Orthomyxoviridae）中的流感病毒；副粘病毒科（Paramyxoviridae）中的副流感病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒，以及其它病毒科中的一些病毒，如腺病毒、风疹 病毒、鼻病毒、冠状病毒和呼肠病毒等。据统计，90%以上的急性呼吸道感染由病毒引起，尤以上呼吸道感染为临床上的常见病和多发病。病毒性呼吸道感染易通过人类的正常活动造成大面积的传播，具有流行面广、传染性强、发病率高等特点。例如，2003年在我国蔓延的SARS，中国内地及香港、台湾累计病例达7747例，死亡829人。呼吸道病毒感染严重威胁着公众的健康，如何有效预防和治疗病毒性呼吸道感染疾病是国际医药界共同面临和亟待解决的重大课题。
1.2呼吸道疾病药物的创新性研究方法
发现有生物活性的先导化合物是创新药物研究的前提，也是影响创新药物周期的决定性因素[1]。先导化合物的来源有多种途径，从天然产物中寻找有活性的化合物作为先导物创制新药是世界药学工作者公认的有效途径之一。天然产物在抗病毒方面尤其重要，在1981-2006年全世界应用的42种抗病毒小分子药物中，有34种是以天然产物为基础研制开发出来的[2]。
1.3穿心莲内酯的药理作用及研究进展
穿心莲为爵床科穿心莲属植物穿心莲Andrographis paniculata （Burm.f.） Nees.的干燥地上部分。《中华人民共和国药典》（2010版）记载穿心莲：苦，寒；归心，肺，大肠，膀胱经[9]。植物化学研究表明[10-11]，穿心莲内酯（Andrographolide）系爵床科植物穿心莲[Andrographis paniculata （Bum. f.） Nees]的主要二萜类内酯成分之一，具有清热解毒、凉血消肿等功效。
现代药理学研究表明，穿心莲内酯及其衍生物（如：脱水穿心莲内酯琥珀酸半酯穿琥宁注射液、莲必治注射液、病毒静滴眼液、复方穿琥宁涂膜剂等。）有消炎抗菌抗病毒感染抗肿瘤免疫刺激保肝利胆等作用。 通过初步的构效关系研究表明， 二萜双环及其五元内酯环是其重要的药效团，α，β-不饱和双键是其解热抗炎活性所必需的药效基团，双键的个数和位置则对活性强弱有明显的影响。因此， 通过对穿心莲内酯类化合物结构进行改造， 寻找活性更强的穿心莲内酯类似物的研究工作倍受关注。从20世纪70年代开始， 国内外穿心莲二萜内酯类成分的结构衍生化研究，主要集中于对穿心莲内酯（andrographolide）结构中已有的取代基团（如羟基、双键等）进行化学结构修饰，以改善其溶解性，提高生物利用度和药效[12-13]。主要集中在一下三种：
1.3.1 α， β-不饱和内酯双键的Michael 加成
｛eg1：2002 年，Nanduri 等以穿心莲内酯为原料合成了一系列12位取代[此取代基团为NHR1/SR1（其中R1可以是杂环，也可以是脂肪直链或者环状脂链）]的穿心莲内酯衍生物并发现部分化合物有较好的抗炎、抗肿瘤以及抗病毒等生物活性。这种修饰与改造的目的有两个，一方面加大分子多样性，引入更多基团，探索这些基团对母核活性的影响； 另一方面就是希望同时将五元内酯环的环外双键改到环内达到分子相对稳定而药效延长的目的。eg2：2005 年徐浩和黄文龙等利用Michael加成反应合成了 16 个穿心莲内酯12-硝甲基衍生物， 并通过初步的活性评价结果表明这些新化合物表现出了不同的抗肿瘤活性。｝
1.3.2 3 个羟基的选择性酯化、氧化和取代反应，双键的氧化还原
（eg1：Nanduri 等通过对穿心莲内酯孤立双键氧化、羟基酯化、醚化或者孤立双键的邻位羟基化等反应合成了18～20个合物。eg2：2005年王新杨和徐浩等通过内环化、内酯环替换等反应合成了 21 个新的异穿心莲内酯衍生物。eg3：2004年， Thunuguntla等报道了以穿心莲内酯为原料，通过一系列反应，合成了 limonidilactone 的类似物，一定程度上丰富了穿心莲内酯衍生物的基本骨架，同年 Nanduri 等合成了含氧杂环的穿心莲内酯衍生物 。
1.3.3 相及组合化学
（eg1：2001 年 Misbah 研究小组采用固相反应方法， 对脱水穿心莲内酯进行氧化、酯化等，合成了一系列的穿心莲内酯衍生物， 开辟了一条穿心莲内酯衍生物合成新思路。eg2：2006 年 Christian Mang 等从穿心莲内酯出发， 通过臭氧氧化，酯化及溴代等反应合成了系列噻唑环化合物）。
本课题组前期在对穿心莲主要二萜内酯进行微生物转化研究的过程中，在优化后的转化条件下，对脱水穿心莲内酯、去氧穿心莲内酯及穿心莲内酯进行大规模的微生物转化发酵。对得到的发酵液采用液液萃取，硅胶、ODS、Sephadex LH-20等柱色谱，以及制备高效液相色谱等多种现代色谱学分离技术，制备分离得到一定量的双环骨架结构发生羟基化（2， 7， 8， 9， 18位）及发酵产物环外双键迁移至环内（Δ7，8，Δ8，9 ）等的转化产物，其中，7-羟基化及环外双键迁移至环内（Δ7，8，Δ8，9 ）的转化产物b5、b6、b8显示出了较优的生物活性，通过对转化产物的抗呼吸道病毒活性测试，发现其具有较好的抗病毒活性（结构如下图所示）。
目前通过发酵方法所得到b5、b8的量极少而且发酵菌株的发酵方向也较难控制，所以我们考虑通过化学合成方法大量制备这几种发酵产物，为结构修饰和改造奠定基础。
第二章 实验材料方法
2.1 仪器设备及工具
核磁共振氢谱用Bruker ARX-600型核磁共振分析仪测定（TMS为内标）
实验试剂：
薄层分析用薄层硅胶（TLC，GF254硅胶板，0.5mm，青岛）；柱层析所用硅胶为粗孔（zcx-II）200-300目（青岛）；醋酸酐为长沙市康美化工有限公司生产，AR；硼氢化钠、过氧化氢异丙苯为上海圣宇化工有限公司生产；甲基磺酰氯、二氧化硒为山东西亚化学工业有限公司生产，AR；所用二氯甲烷、吡啶等试剂均为天津市博迪化工有限公司所产，AR。
实验仪器：
日本东京理化生产的EYEL4系列冷井、旋转蒸发仪、SHZ-D型循环水式多用真空泵、DT200A型电子天平等。
2.2 实验方法
2.2.1实验设计路线
（1）b5的设计路线：
2.2.2实验操作
2.2.2.1 b5的合成
（1）中间体IM1的合成
在150ml反应瓶中加入穿心莲内酯（10g，28.55mmol）及40ml醋酐，在油浴中加热搅拌至反应体系温度升至45℃时加入新熔融的ZnCl2（4g，29.44mmol），此时反应体系的温度会迅速升至78℃，继续反应至反应液澄清为止。反应结束后，将反应体系冷却至室温，并将反应液倾入盛有200ml冰水的烧杯中，剧烈搅拌，抽滤，用水洗涤滤饼至中性，滤饼用乙醇重结晶，得到白色针状结晶12.5g，收率91.8%。
（2）中间体IM2的合成
在100ml反应瓶中加入三乙酰化穿心莲内酯IM1（1g，2.1mmol）及20ml甲醇，温热搅拌使其完全溶解，冷却至室温，在1h内分小批次加入0.4gNaBH4，加入完毕后继续反应1.5h。然后将反应液倾入盛有50ml冰水的烧杯中，剧烈搅拌，抽滤，滤饼真空干燥，乙醇重结晶，得目标化合物0.65g，收率67%。
（3）中间体IM3的合成
在100ml的反应瓶中加入SeO2（0.36g，3.2mmol）及20mlCH2Cl2后，滴入28滴CHP，30℃下搅拌15min后，再将二乙酰14-去氧穿心莲内酯IM2（1g，2.39mmol）于20mlCH2Cl2溶解后加入到反应当中，35℃反应3.5h。水洗两次（40ml×2），水层在用CH2Cl2萃取（15ml×2），合并二氯甲烷溶液，饱和的氯化钠溶液洗涤（50ml×2）。分层，二氯甲烷层用无水硫酸钠干燥，过滤，在40℃下的水浴中旋转蒸发浓缩，所得物质以正己烷/丙酮为洗脱剂通过开放硅胶柱色谱纯化。
（4）目标化合物b5的合成
在250ml的烧瓶中分别加入IM3（1g，2.3mmol），NaOH（q）（2M，100ml）及50ml EtOH后，在87℃下反应1h，停止反应，减压蒸除乙醇，溶液用5%HCl（q）中和至中性，放置析出大量白色固体物质后，进行减压过滤。
2.2.2.2 b8的合成
中间体产物IM1、IM2、IM3的合成见b5
（1）中间体IM4的合成
取IM3、甲基磺酰氯、吡啶，25摄氏度下反应1小时
（2）目标化合物b8的合成
取IM4，在2摩尔每升浓度的氢氧化钠溶液和乙醇溶液中反应。
2.3 合成中发现的问题及解决办法
（1） IM1的合成过程中发生的是酰化反应，酰化反应是药物合成中常见的反应。虽操作简单，机制明确，但操作的规范与否仍然是实验成功的关键。众所周知，酰化反应为放热反应，比如中间体IM1的合成，如果不能控制好反应温度，所得的产物为非常粘稠的液体，产物复杂，较难提纯。因此，我们通过改变投料顺序来有效的控制反应温度，来完成中间体IM1的合成。
（2） 在中间体IM2的合成中，原料三乙酰化穿心莲内酯和还原产物极性非常相似，很难通过薄层色谱判断反应终点。同时，相关文献关于此步骤的合成的报道并未阐明原料与还原剂NaBH4的确切比例。因此，选定几个反应时间点，通过HPLC检测若干组单元反应（即：不同比例的原料与还原剂的投料量），最终确定试验方法。
结论
1. 经过毕业专题实验期间，得到5-10克纯度在99.0%以上的成品，以供药理测试使用。
3. 中间体IM3的7-位存在手性，为了深入探讨此位点的羟基取向对于下一步反应的影响，可以对两个非对映异构体进行分离。通过对其分离条件进行了摸索，最终确定了正己烷：丙酮：氯仿=5：1：0.2作为洗脱体系，以此体系进行柱层析很好的分离得到了IM3的两个非对映异构体。
参考文献
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作者简介：
陈东 男 汉族 1968.11 辽宁省北镇县
杨溯，女，满族，1975.11，辽宁省黑山县人
论文作者:陈东1,杨溯2
论文发表刊物:《中西医结合护理》2019年第04期
论文发表时间:2019/5/22
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