(1成都中医药大学附属医院 四川 成都 610000)(2成都中医药大学 四川 成都 610000)
【摘要】 目的:建立并优化肾虚血瘀型卵巢早衰动物模型,为中医药辨证治疗肾虚血瘀型卵巢早衰提供实验研究基础。方法:将动情周期正常的48只大鼠随机分为空白组、疾病模型组、病症结合模型组A(雷公藤多苷片+冰浴法)、病症结合模型组B(雷公藤多苷片+猫吓鼠+高脂饮食),每组12只,按照实验方案实施,每组大鼠连续造模28天后24h取材,采用放射免疫分析法测定血中雌二醇(E2)含量,ELISA法测定抗缪勒管激素(AMH),及测定血液流变学相关指标。结果:与空白组相比,疾病模型组、病证结合模型组A和、B的 E2和AMH水平下降(P<0.05);病证结合模型组A和B组与空白组及疾病模型组相比,血液粘度、全血低切还原粘度及全血高切还原粘度均上升(P<0.05),提示血液处于高凝状态,其中病证结合模型组B组在血浆粘度改变上较A组升高明显(P<0.05)。结论:雷公藤多苷片悬浮液灌胃结合“冰浴法”,或“猫吓鼠”加高脂饮食造模28天可成功建立肾虚血瘀型卵巢早衰大鼠模型;“猫吓鼠”加高脂饮食法在血浆粘度改变上优于“冰浴法”。
【关键词】 肾虚血瘀;动物模型;卵巢早衰;大鼠
【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752(2018)24-0362-03
卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)是指妇女40岁前出现原发或继发性闭经,表现为高水平的促性腺激素(卵泡刺激素、黄体生成素)和低水平的雌激素,患者长期的低雌激素水平增加不孕、骨质疏松症、冠心病和抑郁症的风险,并可能导致神经系统疾病和认知功能受损[1]。卵巢早衰在临床上治疗难度大,并且其发病率呈逐年上升的趋势[2]。祖国医学中并无“卵巢早衰”的病名,而是根据其不同的临床表现可归纳为中医学中的“月经先期”“月经后期”“月经先后不定期”“月经过少”“崩漏”“全不产”“断续”“绝经前后诸证”等。目前文献报道中所构建的卵巢早衰模型仅仅是疾病模型,未能结合证型,对中医药研究上仍是有所缺陷。故本研究建立肾虚血瘀型POF动物模型,为中医药辨证治疗肾虚血瘀型卵巢早衰提供研究基础 [3]。
1.材料与方法
1.1 实验动物
SD雌性大鼠,SPF级,10-12周龄,健康,四川省中医药科学院提供,动物许可证SYXK(川)2013-100,隔日换垫料,自由饮食饮水,均喂养标准大鼠颗粒饲料,室温控制在22~25℃,湿度70%,通风良好。入组标准:动物购入后适应性喂养2~3天,连续5~10天做阴道涂片,动情周期正常的大鼠纳入。
1.2 仪器与试剂
放免计数分析仪GC1200(科大创新股份有限公司中佳分公司);酶标分析仪KC-100(深圳市凯特生物医疗电子科技有限公司);自动血流变测试仪SA-9000(北京赛科希德科技发展有限公司)。雌二醇(E2)放射免疫分析药盒(天津九鼎医学生物工程有限公司);大鼠抗缪勒管激素(AMH)ELISA试剂盒(BIOVALUE公司);雷公藤多甙片(10mg/片,湖南协力药业有限公司生产)。
1.3 模型的建立与分组
将有动情周期的48只大鼠随机分为空白组、疾病模型组和病症结合模型组A、病症结合模型组B,每组12只。
(1)空白组:灌服生理盐水2ml/100g,1次/d,标准大鼠颗粒饲料喂养,共28天。
(2)疾病模型组:生理盐水配制的雷公藤多甙片悬浮液灌胃,50mg?(kg?d)-1,标准大鼠颗粒饲料喂养,共28天。
(3)病证结合模型组A:给药方法同疾病模型组,同时对大鼠施加冰浴,连续28日。冰浴方法如下:每天将大鼠放置于0至1摄氏度冰水中浸泡(浸泡部位至腹部即可),浸泡时间为20分钟/天,连续进行28天。
(4)病证结合模型组B:生理盐水配制的雷公藤多甙片悬浮液灌胃,50mg?kg-1?d-1,同时对大鼠施加惊恐和高脂饮食,连续28日。施加惊恐和高脂饮食方法如下:(1)惊恐:采用猫吓鼠法(即恐伤肾)建立肾虚模型,将该组大鼠放入特制的小铁丝笼内,此小笼固定在装有一只大公猫的大笼中,猫可在内自由活动,该猫凶狠善捕鼠。猫与鼠仅一网之隔, 猫爪可以触及鼠。每天上、下午各恐吓2h,即9:00~11:00,15:00~17:00,期间每隔20min刺激猫一次,使其发出叫声。(2)高脂高糖饮食:高脂高糖饲料40克(配方为:猪油15%、白糖8%、胆酸钠1%、胆固醇5%、丙基硫氧嘧啶0.2%、基础饲料71.8%)喂养大鼠。
1.4 标本处理及血清性激素的测定
每组大鼠于造模结束后24h分别取材,麻醉后股动脉取血,处死,留取子宫和卵巢标本用滤纸吸干后,称其湿重,在AAF固定液中固定48h,做病理切片。
1.5 观察指标
1.5.1一般观察 在随机分组后,观察各组大鼠给药前被毛、皮肤、粪便、肌肉张力、步态、精神、呼吸和进食、舌体、唇周颜色等情况,给药结束后再次观察上述指标,进行对比分析。
1.5.2造模后大鼠血清E2、AMH水平的测定:每组大鼠于造模结束后24h分别取材,麻醉后股动脉取血,置于EP管内离心后检测(另留取3ml用于血流变指标测定),采用放射免疫分析法测定血中雌二醇(E2)含量,ELISA法测定抗缪勒管激素(AMH),操作规程按试剂盒说明书进行。
1.5.3血液流变学指标检测 取血后留取3ml至肝素钠抗凝管内,检测全血黏度、血浆黏度、红细胞压积、红细胞聚集指数、纤维蛋白原、红细胞变形指数等指标。
1.6 统计学方法
实验数据采用IBM SPSS21.0统计软件进行分析处理。计量资料采用均数±标准差(x-±s)进行描述。数据采用单因素方差分析进行比较,P<0.05有统计学意义。
2.结果
2.1 一般情况观察
空白组大鼠一般状态良好,毛色光滑,反应灵活,大便成形,纳食正常,大便正常,舌质红润。与空白组比较,疾病模型组大鼠出现被毛稍粗糙,毛色无华,蜷缩少动,反应较为迟钝,纳食减少,大便偏稀,舌质偏暗等,病症结合模型A、B组除出现疾病模型组表现外,还兼见尾部自尖至根出现不同程度瘀青,部分便溏,舌质瘀紫等。
2.2 造模后四组大鼠血清E2和AMH水平的变化(见表1)。
疾病模型组、病证结合模型组A和B组与空白组相比,均出现E2和AMH水平下降(P<0.05),有统计学意义。该三组间差异无统计学意义(P>0.05)。
3.讨论
本研究结果显示,两种方案制备的大鼠模型,激素测定显示E2、AMH下降,符合卵巢早衰变化,同时具备肾虚血瘀的中医体征,血液流变学中血液粘度、全血低切还原粘度及全血高切还原粘度均上升(P<0.05),提示血液处于高凝状态,其中B组在血液粘度改变上优于A组(P<0.05)。综上所述,雷公藤多苷片悬浮液灌胃,50mg?(kg?d)-1结合“冰浴法”,或“猫吓鼠”加高脂饮食造模28天,可成功建立肾虚血瘀型卵巢早衰大鼠模型;“猫吓鼠”加高脂饮食法在血浆粘度改变上优于“冰浴法”。
【参考文献】
[1] Janse F,With L M D,Duran K J.Limited contribution of NR5A1,(SF-1) mutations in women with primary ovarian insufficiency (POI)[J].Fertility & Sterility, 2012, 97(1):141-146.e2.
[2]王冰,王旭东.中医药对不同卵巢早衰模型治疗的研究进展[J].医学综述,2016,22(6).
[3]郜洁,谢蓝,巫海旺,等.中医妇科病证结合动物模型研究思路[J].中医杂志,2016,57(4):299-301.
课题来源:成都中医药大学科技发展基金《肾虚血瘀型卵巢早衰病证结合动物模型研究》项目编号:ZRQN1629,负责人:黄叶芳
论文作者:黄叶芳1,李宛静2,邓蒂斯2,张纯2
论文发表刊物:《医药前沿》2018年8月第24期
论文发表时间:2018/9/5
标签:模型论文; 大鼠论文; 卵巢论文; 粘度论文; 疾病论文; 饮食论文; 悬浮液论文; 《医药前沿》2018年8月第24期论文;