顾少菊[1]2002年在《假单胞菌YS1基因组BAC文库的构建》文中进行了进一步梳理为了克隆Pseudomonas pseudoalkaligenus YS1的聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHAs)合成酶基因以及其相应的调节基因，构建Pseudomonas pseudoalkaligenus YS1的BAC (Bacterical Artificial Chromosome，BAC)文库。 选择pBeloBAC11载体和E. coli DH10B宿主来构建假单胞菌YS1文库。由脉冲电泳得到部分酶切的大片段DNA，与经过纯化、去磷酸化后的载体DNA连接，电转化进入感受态的宿主细胞中。转化后的细胞在含有IPTG、X-gal和氯霉素的平板上培养，筛选阳性克隆子。挑取白斑菌落，平板保存。 抽提转化子质粒，用NotI酶切检测外源片段的大小。电泳分离结果得到两个DNA片段，一个是7.5 kb的载体DNA片段，一个是大于23 kb的外源DNA片段。由于外源片段的大小与质粒总DNA电泳位置相似，为了进一步验证外源片段的正确性，采用菌落杂交来检测。杂交结果显示文库中95％以上有杂交信号，而且阴性对照无杂交信号。结果证明了克隆子中插入了正确的外源片段。文库为1000个克隆子，文库的覆盖倍数大于4.8倍。 利用RAPD方法从随机引物筛选用于目的基因克隆的探针，发现有两个引物编码的氨基酸排列与10个PHAs合成酶的保守序列相同或非常相似。拟采用其扩增的特异片段为探针，或以该引物为探针。
马超[2]2005年在《类产碱假单胞菌YS1 BAC文库的筛选及转基因烟草植株遗传稳定性分析》文中研究表明聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHAs),一种由微生物合成的聚酯,由于具有生物降解性、生物相容性等优良性能,而在众多领域,如农业、医药、高分子材料、组织工程、环保和包装材料等方面得到广泛应用。在PHA的合成途径中,PHA合成酶是最关键的酶,对PHA的组成和分子量等性质具有决定性的作用。到目前为止,已经在超过45种细菌中克隆得到了超过59个PHA合成酶基因。 类产碱假单胞菌YS1(Pseudomonas.Pseudoalkaligenese YS1)是一株能合成含短链与中链单体PHA的菌株。本研究通过设计PHB合成酶部分基因特异引物,以菌株Pseudomonas.Pseudoalkaligenese YS1基因组DNA为模板,PCR扩增出一段与Alcaligenes eutrophus PHB合成酶基因phbCj有99%的同源性片段。以PCR产物与Pseudomonas sp.61-3 phbC下游序列中的寡聚核苷酸片段作为共同筛选 P.pseudoalkaligenese YS1 BAC文库的探针,通过斑点杂交初筛,Southern杂交验证,利用亚克隆技术得到外源片段大小为5kb左右的阳性克隆子pH22-E5。 本课题另一部分工作是检测转PHA合酶基因烟草的遗传稳定性。以已获得的两株转PHA合成酶phaC1、phaC2双价基因的烟草及其后代为材料,通过对这株转基因烟草各后代进行PCR、PCR-Southern检测,初步确定P.pseudoalkaligenese YS1 PHA合成酶phaC1、phaC2双价基因能在转基因植株的后代中稳定地遗传,利用卡那霉素抗性大田直接筛选、Southern blot等方法对阳性植株作了进一步检测。用氯仿-次氯酸钠对74株PCR-Southern检测为阳性的转化植株中进行PHAs抽提,有61株中得到目的产物。所转化的烟草在产物合成水平上转化率为67.7%。
郑军荣[3]2003年在《假单胞菌YS1短链与中链PHA合成酶phaC1、phaC2双价基因转化烟草的研究》文中指出聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates,PHAs)是细菌细胞中的一种多聚物，可分为短链PHA、中链PHA及含短链与中链单体的PHA。由于它具有生物可降解性、生物相容性等特征，因而在医药、农业、环境及食品等领域有潜在的利用前景。 类产碱假单胞菌YS1(Pseudomonas psuedoalcaligeneseYS1)是一株能合成含短链与中链单体PHA的菌株。本研究利用聚合酶链式反应(PCR)技术，从P.psuedoalcaligenese YS1染色体DNA中扩增并克隆了调控短链与中链PHA生物合成的两个关键酶基因：phaC1、phaC2基因。同时利用套迭PCR技术对phaC1基因进行了改造，经过基因拼接构建了带有卡那霉素抗性基因的植物表达载体pC3C1(嵌合phaC1)、pC3C2(嵌合phaC2)和pC3C1C2(嵌合phaC1和phaC2双基因)。将含有phaC1和phaC2双基因的植物高效表达载体pC3C1C2，用冻融法，构建了pC3C1C2根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens EHA105)的工程菌。通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草(Nicotiana tobacum Honghuadajinyuan)，利用100mg／L卡那霉素选择培养基诱导筛选出芽。2个月后获得了一批卡那霉素抗性烟草植株，抗性植株大田生长表型正常，生长速度相对缓慢。100株抗性植株经过PCR、PCR-Southern检测，初步确定有32％的烟草中稳定整合了phaC1和phaC2。利用卡那霉素抗性再筛选及Kan抗性大田直接筛选、Southern blot等方法对阳性植株作了进一步检测。用氯仿-次氯酸钠对32株PCR-Southern检测为阳性的转化植株中进行PHAs抽提，有25株中得到目的产物。提取物及新鲜转化植株叶片用傅立叶变换红外光谱进行定性检测，在1724cm~(-1)附近有特征吸收峰确定其为PHA，从而证实有25.00％的转基因植株已含有了目的产物。用气相色谱法对转基因植株中的PHA进行定性定量检测，确定PHA的主要成分为羟基癸酸(Hydroxydecanoate,HD)，表达量最高为2.2％干重。
参考文献：
[1]. 假单胞菌YS1基因组BAC文库的构建[D]. 顾少菊. 华南热带农业大学. 2002
[2]. 类产碱假单胞菌YS1 BAC文库的筛选及转基因烟草植株遗传稳定性分析[D]. 马超. 华南热带农业大学. 2005
[3]. 假单胞菌YS1短链与中链PHA合成酶phaC1、phaC2双价基因转化烟草的研究[D]. 郑军荣. 华南热带农业大学. 2003