敖强[1]2003年在《大鼠脊髓损伤后细胞凋亡及其相关治疗学研究》文中研究表明背景及目的:脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是临床上常见的严重病患之一,近年来发病率逐年增加。在美国,每年约10000例患者因SCI而残疾,我国每年约有50000人遭此损伤。虽然SCI的死亡率目前已降低到5%,但终身残疾率很高,给家庭及社会带来沉重的负担。脊髓损伤导致的截瘫一直是临床医学面临的挑战,如何采取措施促进损伤脊髓结构和功能的重建是全世界神经科学工作者研究的热点和难点。脊髓损伤最终结果由原发损伤和继发损伤共同作用所决定。继发性脊髓损伤是脊髓原发机械损伤后由许多生化因子启动的病理生理过程所导致的继发性细胞损伤、死亡,这种损害在原发伤之后继续发展几天至几个月,对其控制水平直接影响到最终损伤程度。近年研究认为除了急性机械性组织损伤及随后的炎性反应引起的脊髓损伤后神经细胞被动坏死外,细胞凋亡这一主动性细胞死亡方式在脊髓继发损伤中也占有重要地位,神经损伤后期的脱髓鞘改变即是少突胶质细胞凋亡所致。如何干预SCI后细胞凋亡成为SCI治疗的一个切入点。随着对一氧化氮(NO)研究的深入,其在继发脊髓损伤中的作用也开始受到重视。生理状态下,NO维持组织血液循环;当其异常增多时,就可引起氧化损伤以及细胞凋亡。体内NO由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化生成,NOS广泛存在于包括中枢神经系统在内的各系统中。NOS有叁种亚型,其中诱生型一氧化氮合酶(iNOS)产生的NO量大、持续时间长,通过直接引起过氧化损伤或作为信号介质介导细胞凋亡。iNOS特异性抑制剂氨基胍可明显改善大鼠脊髓损伤后后肢功能的恢复。探讨脊髓损伤后细胞凋亡特点与iNOS表达规律,尤其是二者之间的关系对揭示SCI机制及指导临床治疗具有重要意义;这也是本实验的目标之一。脊髓损伤后继发神经元变性、死亡对预后有着严重影响;如何保护脊髓损伤后神经元,减少其死亡,促进脊髓损伤后的功能恢复,是医学科学工作者努力探索的重要内容。甲基强的松龙(MP)具有多方面的神经保护作用,目前广泛应用于治疗急性颅脑和脊髓损伤,并取得一定的疗效,但其机制尚不完全清楚。有
王诗军, 李钰婷, 李淳德[2]2016年在《脊髓继发性损伤后细胞因子的表达及其对细胞凋亡的作用》文中研究说明脊髓损伤是骨科损伤中非常常见的中枢神经系统损伤,且发生率高、致残率高。脊髓损伤可分为原发性脊髓损伤与继发性脊髓损伤。脊髓继发性损伤是在原发性损伤的基础上,在细胞分子水平上主动调节的过程,是组织发生变性坏死的过程。脊髓继发性损伤包括了局部缺血缺氧、免疫炎性反应、自由基损伤及脂质过氧化等一系列病理过程,而免疫炎性反应是继发性损伤中最为重要的病理过程之一~[1]。继发损伤引起细胞死亡的方式主要为细胞凋
崔仙映[3]2015年在《不同频率夹脊电针对脊髄损伤大鼠神经保护作用的时效性研究》文中提出目的：探讨电针不同频率对脊髓损伤大鼠细胞凋亡及相关因子Caspase-3和Bcl-2、Bax基因和蛋白表达水平,以及损伤修复相关因子NGF、BDNF、VEGF的影响,揭示电针对脊髓损伤大鼠细胞凋亡的神经保护作用机制。为临床治疗脊髓损伤提供新的思路和基础理论支持。方法：健康雄性SD大鼠165只,随机分为正常组,模型组,甲强龙组,疏波组,疏密波组,每组33只；每组又分为8h、3d、7d叁个时相点,每个时相点11只。采用改良的Allen's法制备急性脊髓损伤模型。以HE染色、透射电镜技术、TUNEL原位末端标记法等方法观察脊髓损伤后,脊髓的形态学改变、超微结构变化以及细胞凋亡；以Western Blot、RT-PCR和图像分析等方法观察脊髓损伤后,脊髓神经细胞内Caspase-3和Bc1-2、Bax的表达变化规律；以免疫组化法检测脊髓损伤区内NGF、BDNF、VEGF的表达变化规律。计算机图像分析系统和SPSS 17.0统计分析软件对所得的图像和数据进行分析。结果：1、组织形态学变化：正常组变化较小。模型组损伤最重,叁个治疗组损伤程度较模型组轻。模型组及叁个治疗组典型变化为：神经元细胞水肿、神经元空泡化、炎性细胞增生。2、神经元超微结构变化：细胞形态改变主要为胞质皱缩、核膜皱折、异染色质边聚、核浓缩等改变；也可见不同程度的细胞肿胀,线粒体肿胀、内质网肿胀及内质网模溶解等变化。正常组未见明显变化,模型组及叁个治疗组均可见随时间延长逐渐加重的神经损伤,模型组最重,叁个治疗组次之。3、TUNEL染色：模型组及叁个治疗组典型变化为细胞染色质固缩,呈斑块状聚集于核膜周边,胞浆浓染。正常组未见显着变化。4、Western Blot及RT-PCR结果：(1)脊髓损伤后,各时相点模型组Caspase-3、Bax蛋白及mRNA表达增强,叁个治疗组均明显下调,与模型组比较有显着性差异；叁个治疗组中,各时间点疏波组数值最低,其次为疏密波组,再次为甲强龙组。(2)脊髓损伤后,各时相点模型组Bcl-2蛋白及mRNA表达显着增多,叁个治疗组上调更为明显,与模型组比较有显着性差异。叁个治疗组中,各时间点疏波组数值最高,其次为疏密波组,再次为甲强龙组。5、免疫组化结果：脊髓损伤后,各时相点模型组NGF、BDNF以及VEGF表达增加,叁个治疗组增加更为显着,与模型组比较有显着性差异。叁个治疗组中,各时间点疏波组数值最高,其次为疏密波组,再次为甲强龙组。结论：1、脊髓损伤后,电针和甲基强的松龙均能通过降低凋亡启动因子Caspase-3的表达水平,升高抑凋亡因子Bc1-2的表达水平以及降低促凋亡因子Bax的表达水平,来拮抗损伤后的细胞凋亡过程。2、脊髓损伤后,电针和甲基强的松龙均能通过增加神经生长因子NGF、BDNF以及血管生长因子VEGF的表达,来促进损伤后的脊髓修复过程。3、夹脊电针能够在一定程度上抑制脊髓损伤后的细胞凋亡,显示出其有效的神经保护作用,但也不能全面抑制细胞凋亡的发生。4、脊髓损伤后,夹脊电针一方面通过抑制细胞凋亡进程,另一方面通过启动神经和血管修复机制的多途径,多靶点的综合效应发挥神经保护作用,且电针疏波作用优于疏密波。
周红英, 侯群, 戚观树, 裘昌林[4]2010年在《马钱子抑制兔脊髓损伤的细胞凋亡作用》文中指出目的:探讨马钱子是否通过抑制细胞凋亡来治疗脊髓损伤。方法:采用改良的Allen's法建立兔脊髓损伤模型。设立假脊髓损伤组、对照组、炙马钱子40mg组(M40组)及炙马钱子80mg组(M80组),分别在给药后1d、7d及用蛋白免疫印迹法(Western blot)检测c-fos蛋白、Bax蛋白和Bcl-2蛋白的表达。结果:与对照组相比,M40组及M80组治疗第7天及14天,可不同程度地抑制损伤脊髓中NO、c-fos蛋白、Bax蛋白的表达,上调Bcl-2蛋白的表达。其中,M40组和M80组分别治疗第7天的NO含量与对照组有统计学差异(P<0.05);M80组治疗第7天时c-fos蛋白与对照组有统计学差异(P<0.05),治疗14d时有重要统计学差异(P<0.01);M80组治疗第7天时Bax蛋白、Bcl-2蛋白及两者的比值与对照组间有统计学差异(P<0.05),M80组治疗14d后Bax蛋白与对照组有统计学差异(P<0.05)。结论:马钱子通过减少损伤脊髓局部NO、c-fos蛋白的表达、下调Bax/Bcl-2比值从而抑制细胞凋亡,阻止脊髓继发性损伤,促进脊髓损伤后神经功能的恢复。
杨彦玲[5]2004年在《GluTs与PD的相关性及埃他卡林的神经保护作用机制研究》文中研究说明帕金森病(Parkinson's disease，PD)的主要病理特征是中脑多巴胺能神经元退变，其病因不明。谷氨酸的兴奋毒性学说在PD致病机制研究中占据重要地位。正常情况下，中枢神经系统的谷氨酸作为兴奋性神经递质发挥作用，当胞外谷氨酸浓度过高时，即成为强大的神经毒素。谷氨酸转运体(Glutamate transporters，GluTs)正常的摄取功能是维持胞外谷氨酸低于兴奋毒水平的关键环节。目前已克隆出五种亚型的高亲和力GluTs，分别是GLAST(或EAAT-1)(glutamate-aspartate transporter/excitatory amino acid transporter-1)、GLT-1(或EAAT-2)(glutamate transporter-1)、EAAC-1(或EAAT-3)(excitatory amino acid carrier-1)、EAAT-4(excitatory amino acid transporter-4)以及EAAT-5(excitatory amino acid transporter-5)。研究表明GluTs异常参与肌萎缩性侧索硬化症(Amyotrophic lateral sclerosis，ALS)和阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，AD)的发生，但是该转运体与PD的相关性尚缺乏系统研究。 ATP敏感型钾离子通道(ATP-sensitive potassium channel，K_(ATP)通道)是由磺酰脲受体(SUR，sulphonylurea receptor)和内向整流钾离子通道(inwardly rectifying potassium channel，Kir)亚单位组成的异源八聚体(SUR／Kir6.x)，广泛分布于神经系统。ATP／ADP比值调节K_(ATP)通道的开放，因此该通道直接耦联细胞的代谢状态与电活动。文献报道K_(ATP)通道参与急性代谢应激及PD等慢性神经退行性疾病的发生。SUR1亚基表达水平及K_(ATP)通道活化程度直接影响DA能神经元的退变过程。此外，该通道开放对于脑缺血具有明显的预保护作用，但机制未阐明。众所周知，过量释放谷氨酸及其兴奋毒效应是脑缺血及PD等病变过程中神经元死亡的重要原因。那么，K_(ATP)开放剂(K_(ATP) opener，KCOs)的神经保护机制是否在于促进谷氨酸摄取，从而防止谷氨酸诱发的兴奋毒性?目前国内外尚无报道。}有京医科人学博}学位论文 近年来，K、。通道已成为研制，“血管及神经保护药物的重要靶标。埃他卡林(IPtakalim·IPt)是我国学者自行设计合成、具有自主知识产权的新型KCO。本文工作在阐明GluTs与PD相关性的基础上，研究IPT对PD病理状态GluTS功能和表达的影响，初步探讨IPT抗凋亡与杭谷氨酸损伤的神经保护作用机制，为PD临床治疗学的突破及研发新一代治疗新药提供有益的靶标。 第一部分埃他卡林对6-0旧口)A诱导细胞凋亡和谷氛酸毒性作用的影响 目的:探讨IPT对星形胶质细胞凋亡及PC12细胞损伤的影响。 方法:6一羚基多巴胺(6一hydroxydopamine，6一OHDA)处理原代培养的大鼠皮层星形胶质细胞24h制备PD的细胞凋亡模型;Hoechst 33342染色观察星形胶质细胞凋亡;MTT法测定PC12细胞活力。 结果:6一OHDA(100林M)诱导星形胶质细胞凋亡，使之呈现体积减小、核皱缩、荧光增强以及核染色质边集于核膜处呈半月状或环状等凋亡形态特征。IPT(10林M)和毗那地尔(pinacidil，pin)(10林M)具有对抗6一0印〕A诱导星形胶质细胞凋亡的作用。谷氛酸(5和10 mM)显着降低pCzZ细胞活力，IpT(一、10和100林M)能够部分恢复细胞活力，对抗谷氨酸的PC12细胞毒性作用，此作用可被选择性KATP通道阻断剂格列苯豚(Glibenelamide，Gli)(10拼M)所逆转。 结论:新结构化合物IPT对星形胶质细胞凋亡和谷氨酸的毒性损伤具有显着的保护作用，其机制在于开放KATP通道，是富有潜力的治疗PD的候选药物。 第二部分GluTs功能改变与PD的相关性及埃他卡林对谷氮酸摄取的影响 目的:摄取的影响， 方法:阐明GluTs功能改变与PD的相关性，研究IPT对谷氨酸 探讨IPT的神经保护作用机制。采用脑立体定位技术损毁单侧黑质致密部(Substantia{乞尔医科人学博{学位论文nigra pars eompaeta，SNpe)带，}备pD大鼠模型C应用离心法制备大鼠脑组织突触体。应用同位素标记法测定突触体和PC12细胞[’H]一D，五一G一utamate摄取量。 结果:PD模型大鼠皮层和纹状体区突触体谷氨酸摄取量显着减少:6一OHDA、N一甲基，4一苯基吮咤离子(l一methyl一4一phenyl一2，3-dihydropyridinium ion，Mpp+)和鱼藤酮( Rotenone，Rot)浓度依赖·胜地降低Pe 12细胞谷氨酸摄取能力。IPT(10、50和1 00林M)能够完全恢复PD模型大鼠纹状体和皮层突触体对谷氨酸的摄取;IPT(5和10林M)对抗6一OHDA(50林M)、Mpp+(400林M)和Rot(1 ollM)诱导的PC12细胞谷氨酸摄取减少;IPT促进谷氨酸摄取的作用可被选择性K、P阻断剂Gli(20林M)所逆转。 结论:GluTs功能下降参与DA能神经毒素诱导的PD病理改变。IPT通过激活KATP通道，完全恢复PD大鼠模型GluTs的摄取功能，有效防止PD细胞模型GluTs功能下降。 第叁部分GluTs蛋白表达改变与PD的相关性及埃他卡林对其表达的影响 目的:阐明GluTs表达改变与PD的相关性，研究IPT对其表达的影响，进一步探讨IPT的神经保护作用机制。 方法:采用脑立体定位技术损毁单侧sNPc制备PD大鼠模型;免疫组织化学法测定大鼠脑组织切片GLAST、GLI’-l和EAACI蛋白表达;免疫细胞化学法测?
陈暑波[6]2007年在《电离辐射后少突胶质细胞基因表达谱改变的实验研究》文中进行了进一步梳理在大脑、头颈部肿瘤和一些颅内良性疾病的治疗中,大脑和脊髓等重要的剂量限制性器官往往会临近或位于射野范围之内,放射治疗后除了部分病人死于肿瘤局部未控之外,约有50%的长期生存患者会发生不同程度的放射性后遗症,其中以放射性脑或脊髓损伤的病情较为严重,患者的生活质量明显降低。基于以上原因,中枢神经系统(central nervous system, CNS)的电离辐射效应的研究已经全面展开。目前对于放射性脑损伤发病机理和早期诊断的研究还相对较少,至今仍无有效的早期诊断和治疗措施,所以这些研究工作对肿瘤放射治疗学的发展有着重要的理论意义和应用价值。病理学改变的研究表明,早期脑损伤以血管系统变化为主,没有特异性;晚期则出现较典型的脱髓鞘、胶质细胞增生与退行性改变、毛细血管阻塞和白质坏死等四大特征。由于血管损伤的广泛性和少突胶质细胞(oligodendrocyte, OL)是CNS中唯一能合成髓鞘的细胞,因此血管内皮细胞和OL被确立为放射性脑损伤的辐射靶细胞,OL成为发病机理研究的重点之一。随着研究的深入,目前认为主要有四种因素参与了放射性脑损伤的发生与发展,其分别是:血管损伤、少突胶质前体细胞及成熟OL耗竭、神经干细胞减少和细胞因子表达异常。近几年来,关于OL方面的研究大多集中于细胞和分子水平,主要内容包括电离辐射后OL的凋亡及其发生机制、少突胶质前体细胞和成熟OL的辐射反应性以及辐射剂量与分割方式影响等方面。然而,对于OL的研究没有与发生放射性脱髓鞘病变机制形成密切的相关性;早期和亚急性期细胞、分子反应的特性与晚期损伤病理学改变的关系仍不清楚。在神经病学和神经生物学领域的研究中,有许多关于“OL损伤”和“脱髓鞘病变”的文献报道,脱髓鞘是普遍的或特征性的病变,OL也被证实是多种致病因素(外伤、缺血、缺氧和异常免疫反应等)易受攻击的靶细胞。目前的研究表明少突胶质细胞系各阶段的特异性标志分子已基本明确,可以通过不同标记物的组合来区分它们;少突胶质-2型星形胶质前体细胞(oligodendrocyte-type 2 astrocyte progenitor cells, O2A)离体培养的成功也为研究其增殖、迁徙、分化特性及与脱髓鞘病变的关系提供了实验细胞模型;在正常成年大脑与脊髓内存在着约占胶质细胞5~8%的具有分化潜能的前体细胞,一定程度的损伤性刺激后可以使它们发生增殖、迁徙、分化和再生,这为神经损伤的治疗提供了新的思路。一、少突胶质细胞纯化培养的实验研究目的获得芯片检测所需要的纯化OL。方法采用改良的恒温振荡、差速贴壁法进行O2A的纯化培养,并通过体外诱导分化使之为成熟的OL;应用免疫荧光双重标记方法进行OL的细胞鉴定。结果OL免疫荧光标记为A2B5标记阴性、MBP或GalC标记阳性;OL纯度达98%,且细胞数量达到5×106个。二、电离辐射后少突胶质细胞基因表达谱变化的离体实验目的观察电离辐射前后OL基因表达的早期变化规律。方法对纯化的OL采用6MV-X线照射10Gy剂量,用表达谱芯片检测比较对照组(1组)与照射后1hr、4hr组(2、3组)各基因mRNA表达的变化。结果叁组细胞杂交后的基因检出率分别为42.81%、41.64%、45.31%;2比1上调基因数为27个,下调基因数为164个,3比1上调基因数为295个,下调基因数为302个,3比2上调基因数为510个,下调基因数为320个;基因功能分类结果共有79大类1079个基因被列出,具体功能分类包括:细胞生理过程、肿瘤凋亡、新陈代谢、细胞周期、细胞通讯、蛋白结合等。叁、与早期放射性脑损伤相关的功能基因定量分析目的验证芯片结果可靠性的同时进一步探讨候选基因在OL内差异表达的意义。方法依据芯片检测结果选出9个在早期放射性脑损伤中可能发挥重要调控作用的候选基因,应用实时荧光定量RT-PCR的方法对其mRNA进行定量分析。结果荧光定量RT-PCR基因定量与基因芯片分析结果比较,27个mRNA检测结果中有22个结果一致,符合率为81.5%;叁组样本中各基因ΔCt值分别为:①胶质原纤维酸性蛋白:1.3777、2.2266、5.3992;②髓鞘碱性蛋白:-3.4061、-2.6133、-2.0232;③载脂蛋白E:12.1203、14.7452、17.2264;④促甲状腺激素释放激素:5.8994、8.2740、2.4709;⑤甲状腺激素受体α:6.3269、5.8081、6.4793;⑥转化生长因子β2:4.6782、5.2108、5.1181;⑦早期生长反应2:10.0840、7.4766、8.5754;⑧神经细胞黏附分子1:3.7024、3.9211、5.6716;⑨S100蛋白β多肽:2.5607、5.5696、4.2581。结论1.通过改良的恒温振荡法和差速贴壁法进行O2A的纯化培养,并诱导分化为纯化的OL,免疫荧光标记为A2B5标记阴性、MBP或GalC标记阳性;OL纯度达98%,且细胞数量达到5×106个,符合基因芯片检测要求。2.照射后早期就发生了电离辐射导致的OL基因表达谱的改变;芯片检测结果提示发生变化的OL基因包括细胞损伤相关基因、细胞保护相关基因和损伤修复相关基因,这些基因之间的动态平衡变化决定了辐射对OL的最终生物学效应。3.应用实时荧光定量RT-PCR的方法对候选基因mRNA进行定量分析,结果与芯片检测基因mRNA的结果基本一致,两者比较在检测的特异性上更加近似,而检测的敏感性上前者优于后者;对候选基因mRNA进行定量分析,进一步了解了它们在放射性脑损伤早期的变化情况,GFAP、MBP、apoE、TGFβ2和NCAM-1 mRNA下调的变化可能与OL的损伤机制相关;而TRH、THRα和EGR2 mRNA上调以及S100βmRNA下调的变化可能与OL的修复与保护机制相关。
宋良玉[7]2016年在《不同电针对脊髓损伤14天后大鼠再生修复的机理研究》文中研究表明目的：脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)是一种严重的中枢神经系统(central nervous system,CNS)创伤,该病致残率和死亡率较高,相对于人类其他种类的疾病而言这种创伤是灾难性的。SCI发病的直接原因是位于椎管内的脊髓受到严重创伤或者其他病理损害,以至患者损伤脊髓部位以下的躯体运动、感觉和自主神经等功能发生障碍。脊髓一旦发生损害将对患者造成终身的疾患,常见的后果为肢体残疾与肢体功能障碍,对患者本身、家庭以及社会造成沉重负担。因此,研究和治疗SCI一直是医学界的热点问题,而且也将会受到越来越多的关注及重视。本研究基于以往脉冲电针治疗各种中枢神经系统损伤临床及实验研究成果的基础上,选择Raf/Ras/MEK/ERK信号通路为切入点,探讨两种不同电针对大鼠髓损伤后14天丝裂原激活／细胞外信号调节激酶2(Mitogen-activated/Extracellular signal-regulated Kinase 2,MEK2)、磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶1(phosphorylation-Extracellular signal-regulated Kinase 1, p-ERK1)表达的影响以及对SCI大鼠后肢运功功能和神经元的影响。研究不同电针对脊髓损伤的作用,探讨不同电针对脊髓损伤后神经再生和轴突传导功能的作用机理,为临床上应用针刺疗法治疗脊髓损伤提供实验依据,从而进一步发展传统针灸学理论。方法：选择雄性清洁级SD大鼠(100只),利用随机数字表分为空白组(20只)、假手术组(20只)、模型组(20只)、脉冲电针组(20只)、音乐电针组(20只)五组。采用改良式的Allen's打击法复制SCI模型。其中两组不同电针组均选取“大椎”、“命门”进行不同电针针刺干预,每日1次,每次20分钟,空白组、假手术组及模型组在治疗组治疗时进行抓取束缚,保证处理条件的相同。SCI后14d,采用神经功能评定法——BBB评分对大鼠脊髓损伤进行评估,综合评定大鼠SCI后的运动功能。采用HE染色、尼氏染色方法观察脊髓损伤大鼠损伤脊髓前角组织病理改变。运用免疫组化技术和Western blot技术观察损伤脊髓MEK2、p-ERK1含量的变化。结果：BBB评分结果显示,经脉冲电针与音乐电针治疗后,脊髓损伤大鼠后肢活动功能较模型组均有改善(P<0.01),且音乐电针平均值高于脉冲电针,但两组比较无统计学差异；HE染色与尼氏染色结果说明脉冲电针与音乐电针组均可修复脊髓前角神经元细胞,增加神经元细胞中尼氏体含量,且音乐电针优于脉冲电针；免疫组化及Western Blot结果说明脉冲电针与音乐电针均可提高脊髓前角神经元中MEK2、p-ERK1的含量,但两者无统计学差异。结论：改良式的Allen's打击法复制模型能较好地模拟损伤脊髓的病理特征及床表现,从督脉入手的治疗方法也使损伤大鼠下肢的运动功能得到了相应的改善,脉冲电针与音乐电针均能诱导SCI大鼠脊髓内MEK2、p-ERK1的表达,促进脊髓损伤后神经修复再生功能,音乐电针作用较脉冲电针略有优势。
李玉洁, 宋唯斯, Mayuree, Tantisira, 杨庆, 翁小刚[8]2015年在《“苦寒”方药的神经保护作用及其机制概述》文中提出中药药性理论是中医遣方用药的重要依据,对"苦寒"方药的药性本质研究、性效相关研究已成为中药药性研究的热点之一。从中枢神经元、神经胶质细胞及外周神经3方面论述"苦寒"方药的神经保护作用,从减轻脑缺血-再灌注损伤、抑制神经细胞凋亡、减轻β淀粉样蛋白和兴奋性氨基酸神经毒作用、改善神经退行性变、促进神经细胞增殖、改善胆碱能神经功能、抗氧化、抗炎等多方面系统总结其保护作用的机制,为"苦寒"方药药性实质研究和从"苦寒"中药中筛选具有神经保护作用的中药成分提供文献依据。
马超[9]2014年在《上转换纳米介导的光动力疗法体外杀伤脊髓星形胶质细胞的实验研究》文中研究说明目的：探讨以上转换荧光纳米颗粒为载体与光敏剂部花青540连接的纳米复合物(UCNPs-MC540)介导的光动力对大鼠脊髓星形胶质细胞的体外杀伤效应。方法：(1)于无菌条件下体外分离新生1-2天的SD大鼠脊髓组织,制成细胞悬液,通过差速贴壁和恒温摇床震荡去除杂细胞,进行传代、培养。利用胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色法鉴定脊髓星形胶质细胞。(2)成功分离提纯大鼠脊髓星形胶质细胞后,采用MTT法检测不同浓度UCNPs-MC540复合物,不同能量980纳米波长近红外激光照射对细胞活力的影响以及UCNPs-MC540联合980纳米近红外激光的光动力疗法的细胞杀伤效应；最后用透射电镜观察在200μg/ml UCNPs-MC540复合物浓度与近红外980纳米激光2000J/cm2能量照射下,星形胶质细胞细胞结构的改变。结果：(1)体外分离培养的细胞具有典型的星形胶质细胞的形态,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫荧光染色阳性,证实为星形胶质细胞。(2)在不同浓度UCNPs-MC540(0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml)与星形胶质细胞共培养后,细胞存活率的差异无统计学意义(P>0.05)；不同能量(0J/cm2,200J/cm2、500J/cm2、1000J/cm22000J/cm2)980纳米近红外激光照射体外培养的星形胶质细胞后,细胞存活率的差异无统计学意义(P>0.05)；不同浓度UCNPs-MC540与星形胶质细胞共培养12小时后给予2000J/cm2980纳米近红外激光照射,细胞存活率随着UCNPs-MC540浓度的增加而降低,差异有统计学意义(P<0.05)；在UCNPs-MC540浓度为100μg/ml与细胞共培养12小时后分别给予不同能量激光照射,随着激光剂量的增加,细胞存活率下降,各组间差异有统计学意义(P<0.05)。(3)与空白对照组相比,在浓度为200μg/ml UCNPs-MC540复合物介导的光动力作用下,细胞呈现典型的凋亡样改变,线粒体受累,染色质凝聚边移,胞膜皱缩等改变。结论：(1)新生SD大鼠的脊髓星形胶质细胞成功在体外分离,培养,传代及鉴定。(2)以上转换荧光纳米为载药体,联合光敏剂部花青540构建的纳米复合物UCNPs-MC540介导的光动力疗法对脊髓星形胶质细胞具有一定的体外杀伤效果,为今后脊髓损伤后抑制星形胶质细胞的增生,减少胶质瘢痕形成的治疗拓展了新的思路和方法。单纯给予纳米光敏复合物或单纯进行光照则无细胞杀伤效果,在一定程度上提示UCNPs-MC540的低毒性及单独接触980纳米激光是安全的。
张丽芳[10]2008年在《SMA细胞模型中Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS通路与细胞凋亡关系的研究》文中研究说明脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy,SMA)是一种常染色体隐性遗传性神经变性疾病,其特征是脊髓前角的α运动神经元变性,临床表现为肢体近端肌无力和肌萎缩。SMN基因是SMA的致病基因,该基因有两个结构基本相同的拷贝,分别称SMN1和SMN2,SMN1编码全长SMN(fl-SMN)蛋白,SMN2编码Δ7-SMN蛋白。研究表明,SMN1基因的功能缺陷是大多数SMA患者的发病原因,且SMA临床表型的严重程度与全长SMN蛋白的含量密切相关。患者的运动神经元表现出凋亡征象,机制不明。近来发现了一条和运动神经元凋亡特异相关的Fas通路,即Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS凋亡通路。不同于经典的Fas/FADD/caspase8通路,在其他类型细胞凋亡中则未发现此特异性通路。SOD1突变的肌萎缩侧索硬化(ALS)转基因鼠的运动神经元细胞对此通路表现出很高的敏感性,而对营养因子剥夺或细胞毒性反应弱。因为肌萎缩侧索硬化也系运动神经元变性疾病,故我们设想如果SMN蛋白缺乏的运动神经元对此通路敏感,我们则可以通过阻断此凋亡通路治疗SMA。在和运动神经元凋亡特异相关的Fas通路(Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS)中,Daxx是一关键因子,通过其在胞浆或胞核的转位,在细胞凋亡和转录调控中起重要作用。本研究拟利用RNAi技术抑制非SMA患者的骨髓间质干细胞SMN1基因的表达,将其诱导分化为神经元样细胞建立SMA细胞模型,并通过一系列分子生物学方法研究Daxx蛋白对SMA细胞模型凋亡的调控、并观察组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丙戊酸促进SMN的转录及表达后Daxx蛋白的亚细胞定位和变化及SMA细胞模型对Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS凋亡通路的敏感性。第一章RNA干扰制作SMA细胞模型目的:构建能在哺乳动物细胞中表达SMN1 shRNA的慢病毒干扰质粒,并初步探讨其对人骨髓间充质干细胞(MSCs)SMN1 mRNA及蛋白的抑制作用;应用RNAi沉默MSCs的SMN1基因建立SMA细胞模型。方法:①取非SMA病人(且无血液疾病及骨肿瘤)骨髓,分离、纯化得到骨髓间充质干细胞(MSCs)。根据Genscript公司的设计软件,设计、合成3对针对SMN基因寡聚核苷酸序列,将此DNA序列克隆至慢病毒载体pRNAT-U6.2/Lenti中U6启动子的下游,形成能在细胞内表达SMN1特异性的短发夹状RNA的重组质粒pRNAT-SMN1,将重组质粒pRNAT-SMN1转染人骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR、Western-blot技术检测转染后MSCs的fl-SMN mRNA及SMN全长蛋白的表达;②在慢病毒载体介导下将重组质粒pRNAT-SMN1转染人骨髓间充质干细胞,经G418筛选得到能稳定表达目的shRNA的单克隆细胞系后并诱导其分化为神经元样细胞。后者通过细胞形态学观察及免疫细胞化学染色分析神经元样细胞NSE、MAP2、GFAP蛋白表达进行鉴定。再次用RT-PCR,Western-blot方法检测神经元样细胞SMN mRNA及其蛋白的表达,并与诱导前进行比较。结果:琼脂糖凝胶电泳及测序证实了重组质粒pRNAT-SMN1构建成功,转染后不同程度地抑制人骨髓间充质干细胞的fl-SMNmRNA及其蛋白的表达,mRNA水平上干扰效率为66.08%、65.15%,蛋白水平上干扰效率为58.20%、56.30%,与对照组相比,差异均有统计学意义(P＜0.05)。诱导后的细胞呈典型的神经元样细胞形态,免疫细胞化学染色显示细胞NSE、MAP2蛋白表达阳性,GFAP蛋白表达阴性;其fl-SMN mRNA、A7-SMN mRNA及fl-SMN蛋白表达均较诱导前增加(P＜0.05),但pRNAT-SMN1组的fl-SMN mRNA及蛋白表达仍明显低于对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);而诱导后Δ7-SMN mRNA的表达在各组间差异无统计学意义(P＞0.05)。结论:构建的pRNAT-SMN1重组质粒能有效地抑制人骨髓间充质干细胞fl-SMN mRNA及其蛋白的表达。SMN1 mRNA及其蛋白被抑制的MSCs诱导分化为神经元样细胞后可以作为SMA的细胞模型。第二章SMA细胞模型对Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS凋亡通路的敏感性及Daxx对其凋亡调控机制探讨1.SMA细胞模型自发性凋亡及丙戊酸干预前后Daxx蛋白的表达和亚细胞定位目的:初步研究SMA细胞模型的自发性凋亡、丙戊酸干预前后Daxx蛋白的表达及亚细胞定位,以探讨Daxx蛋白在SMA细胞模型凋亡中的作用。方法:实验以丙戊酸干预前后SMA细胞模型、正常神经元样细胞为研究对象,①绘制细胞生长曲线,观察各组细胞增殖趋势及速度;②采用噻唑兰比色实验(MTT)检测各实验组细胞的细胞活力变化;③流式细胞分析Annexin V法检测各实验组细胞凋亡情况;④免疫荧光检测Daxx蛋白的亚细胞定位;⑤共聚焦显微镜共定位fl-SMN蛋白和Daxx蛋白;⑥RT-PCR、Western-blot方法检测各组细胞Daxx mRNA及其蛋白的表达。结果:①细胞生长曲线结果显示,各组细胞数均出现2次负增殖趋势;在第2次细胞负增殖期内(在诱导结束后第4、5、6天时),不同时间点的细胞数目有统计学差异(P＜0.05);且SMA细胞模型负增殖较正常神经元样细胞明显,两者之间差异有统计学意义(P＜0.05);②MTT结果显示,各组MTT曲线均出现2次细胞活力下降趋势;在第二次细胞活力下降期,各组细胞在诱导结束后第3、4、5、6、7天时的MTT值比较差异均有统计学差异(P＜0.05),且SMA细胞模型的活力明显低于正常神经元样细胞(P＜0.05);③流式细胞分析Annexin V结果亦显示,SMA细胞模型组的细胞凋亡率较正常神经元样细胞组高(P＜0.05);VPA干预后SMA细胞模型组的细胞凋亡率明显降低(P＜0.05);④RT-PCR、Western-blot结果显示SMA细胞模型组Daxx mRNA及其蛋白的表达均高于正常神经元样细胞组(P＜0.05)。随着VPA干预的浓度增加,SMA细胞模型的fl-SMNmRNA及蛋白的表达增加;而Daxx mRNA及蛋白的表达在VPA的干预浓度由1μmol/ml加至7μmol/ml时,是逐渐降低;⑤免疫荧光检测显示,正常神经元样细胞组Daxx蛋白主要定位于细胞核,SMN蛋白定位于细胞浆和细胞核;SMA细胞模型组Daxx蛋白主要定位于细胞浆,SMN蛋白表达减少:VPA干预后Daxx蛋白主要定位于细胞核,SMN蛋白表达增加;共聚焦显微镜结果显示,fl-SMN蛋白和Daxx蛋白细胞核共定位。结论:①Daxx在SMA神经元样细胞中可能有促凋亡作用;②.fl-SMN蛋白与Daxx蛋白可能存在相互作用;③.丙戊酸促使fl-SMN转录和蛋白表达的机制可能与其抑制Daxx表达有关。2.SMA细胞模型对Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS凋亡通路的敏感性研究目的:研究SMN蛋白缺失神经元对Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS凋亡通路的敏感性。方法:以SMA细胞模型、正常神经元样细胞为研究对象研究①不同浓度抗Fas抗体(0.01,0.1,1,10,100ng/ml)处理SMA细胞模型、正常神经元样细胞24、48、72小时3个时间点,MTT比色法检测抗Fas抗体对两组细胞生长活力的影响,流式细胞仪分析细胞凋亡率;②以100ng/ml抗Fas抗体处理两组细胞后,Western-blot技术检测nNOS,Daxx,p-p38蛋白的表达;③抗Fas抗体处理SMA细胞模型与否,分别加p38抑制剂和nNOS抑制剂,流式细胞技术检测细胞凋亡率变化。结果:①随着抗Fas抗体药物浓度的增加,SMA模型组细胞活力明显下降(P＜0.05),正常神经元样细胞组细胞活力下降不明显(P＞0.05);随着时间的延长,SMA模型组细胞活力明显下降(P＜0.05),正常神经元样细胞组细胞活力下降不明显(P＞0.05)。流式细胞Annexin V分析结果显示随着抗Fas抗体药物浓度的增加,SMA模型组细胞凋亡率明显增加(P＜0.05);正常神经元样细胞组细胞凋亡率增加不明显(P＞0.05);②SMA模型组细胞在100ng/ml抗Fas抗体干预条件下,Daxx、p-p38及nNOS蛋白表达水平明显高于无干预组(P＜0.05);正常神经元样细胞100ng/ml抗Fas抗体干预与否Daxx、p-p38及nNOS蛋白表达水平无明显变化(P＞0.05);③p38抑制剂SB203580和nNOS抑制剂7-NI均不但可以减少抗Fas抗体诱导的SMA细胞模型凋亡(P＜0.05),而且可以减少SMA细胞模型自发性凋亡(P＜0.05)。结论:①SMN蛋白减少或缺失可能激活Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS凋亡通路:②Daxx可能通过从细胞核转位到细胞浆及Fas/Daxx/Ask1/p38/nNOS凋亡通路致SMA细胞凋亡。
参考文献：
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