郭长明[1]2008年在《猪链球菌2型部分毒力基因序列测定及血清学调查分析》文中研究指明猪链球菌2型不仅可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡,还可以感染相关人员并致死,是一种重要的人畜共患病病原。近些年来,猪链球菌2型在我国时有暴发流行,严重影响养猪业和社会公共卫生安全。有关猪链球菌2型的病原生态学、流行病学的一些问题尚未完全明了,各地猪群猪链球菌2型的易感水平和猪链球菌2型人际感染风险等研究缺乏必要、充足的依据。为此,我们开展了猪链球菌2型病原学、分子生物学和血清学诊断技术研究,对福建省各地区猪场血清样品的猪链球菌2型抗体水平进行了调查分析,以期为猪2型链球菌病的监控提供科学数据。本实验对疑似猪链球菌2型的福建分离株进行了菌落、菌体形态学,菌株生化特性、药敏试验和毒力等相关特性的观察、分析,并将其命名为PFJ07。试验结果显示,PFJ07的形态、培养及生化特性基本符合猪链球菌2型的特点,具有β溶血,能在48h内致死小白鼠。根据猪链球菌2型CPS2J基因序列设计、合成了一对特异性引物,以PFJ07基因组DNA模板,扩增出长度为675bp的特异性条带,所有供试阳性参考菌株扩增出相同的DNA片段,所有非2型猪链球菌和其它阴性参考菌株不产生任何条带。优化了PCR反应条件,分别测定了PCR反应的菌体模板和菌体基因组DNA模板的检测灵敏度,结果表明该检测方法对菌体模板的灵敏度为100cfu,对DNA模板的灵敏度为50pg,方法特异、灵敏,可以直接将菌体用作模板方法十分简便。分析了PFJ07的CPS2J基因675bpDNA片段的序列,证实PFJ07菌株的CPS2J基因核苷酸序列与猪链球菌2型标准菌株CPS2J基因核苷酸序列的同源性高达98-100%,因此确定PFJ07是猪链球菌2型菌株,并命名为SS_2PFJ07。这也是首次在福建省发现猪链球菌2型菌株。对SS_2PFJ07相关毒力基因MRP与EF进行了检测,并对其序列进行了分析与比较。确定SS_2PFJ07的表型为MRP+EF-,确定PFJ07菌株的MRP基因核苷酸序列与猪链球菌2型标准菌株MRP基因核苷酸序列的同源性达88%,这些为猪链球菌2型的毒力测定及免疫学研究奠定了基础。采用商品化的猪链球菌2型血清抗体检测试剂盒,对来自福建省9个地区,77个猪场,1347份血清样品进行了调查分析。结果表明各个猪场群体血清抗体阳性率差异很大,阳性率范围从0%至94%;各地区阳性猪场数范围从22-100%不等;检出阳性猪场时占检测猪场总数的53%。结果提示,福建养猪场存在猪链球菌2型菌株的疫源地,部分猪场存在猪链球菌2型感染的可能,全省各地存在发生猪链球菌2型感染的风险。以上研究结果为建立猪链球菌2型感染的快速检测方法奠定了技术基础,为我省猪链球菌2型疫情预测、预警提供了十分有价值的数据和材料,为兽医部门制订猪链球菌2型疫病措施提供了有参考价值的资料。
徐国华[2]2011年在《猪链球菌2型与猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程亚单位疫苗的研究》文中指出猪链球菌2型(Streptococcus suis serotype 2, SS2)和猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus Pleuropneumoniae, APP)是两种重要的猪传染病的病原,具高发性和高传染性,在世界范围内给养猪业带来巨大的损失。前者还可以引起人患病甚至死亡,具有很重要的公共卫生意义,是一种重要的人兽共患病病原；而后者血清型复杂,国内以1、2、3、7血清型流行为主,防控难度较大。研究表明SS2和APP存在众多的毒力相关因子,而有些毒力因子可以使实验动物对这两种致病菌产生一定的免疫保护作用,因此可作为亚单位疫苗的候选蛋白。以猪链球菌2型HA9801株和猪胸膜肺炎放线杆菌S259株基因组DNA为模板,分别扩增溶菌酶释放蛋白(Muramidase Released Protein, MRP)、猪溶素(Suilysin, SLY)和胸膜肺炎放线杆菌外毒素I蛋白A(actinbacillus pleuropneumoniae toxin IA,ApxIA)抗原性较好的基因片段,再定向克隆至表达载体pET-28a(+)中,构建重组表达质粒mrp-pET28a、sly-pET28a和ApxIA-pET28a,经过酶切和测序鉴定后,转入大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,表达出分子量分别为23kDa、26 kDa和40 kDa的融合蛋白。免疫转印结果显示叁种融合蛋白都可以很好地被相应的康复血清所识别。用融合蛋白混合ISA-206佐剂制成疫苗免疫小鼠,ELISA测定抗体动态效价显示叁种蛋白均能够使小鼠产生很好的特异性抗体(效价最高达1：204800),并且维持高浓度效价(1：12800以上)时间达10周以上。用MRP和SLY蛋白混合起来制成疫苗免疫Balb/C系小鼠、用ApxIA蛋白免疫ICR系小鼠(50μg亚单位/只),经过叁免之后,分别用10xLD5o(1.4×108CFU)的SS2 HA9801株和5xLD5o(4×107CFU)的APP1 S259株攻毒。免疫保护试验结果显示：经过MRP和SLY蛋白混合免疫的Balb/C小鼠对SS2的相对保护率为72%；而经过ApxIA蛋白免疫的ICR小鼠对APP的相对保护率为66.7%。在上述研究基础上,设计串联引物,用一段疏水性柔性多肽(GlyGly GlyGlySer)×2碱基序列作连接接头将mrp和ApxIA基因拼接起来,构建ApxIA-linker-mrp串联基因,克隆至pMD18-T Simple载体中,经酶切和测序分析显示插入的片段长度为1521bp,插入的顺序和方向完全正确。再将融合基因定向克隆至pET-28a(+)中,构建重组表达质粒ApxIA-mrp-pET28a,并转化至BL21中诱导表达。得到融合蛋白ApxIA-MRP,免疫转印结果表明其能很好的与两种菌的康复血清反应。用串联的融合蛋白混合ISA-206制成疫苗,叁次免疫ICR系小鼠,期间测定抗体动态效价,其血清抗体效价可达1：102400,维持时间长达11周。用该疫苗免疫30日龄的断奶仔猪,共叁次免疫,首免lmg/头、二免800μg/头、叁免500μg/头；每次免疫结束后1周采集血清测定抗体效价,测定发现抗体效价分别为1：3200、1：51200、1：204800。叁免后分别用10倍LD50的APP1S259株及SS2 HA9801株攻击,结果显示对这两种致病菌的保护率分别达80%和100%。证明串联融合蛋白可以对其同源株产生一定的保护率,为SS2和APP的基因工程亚单位串联苗的研制提供了依据。
欧瑜, 陆承平[3]2001年在《猪链球菌2型毒力相关蛋白的检测及其基因片段的克隆与表达》文中进行了进一步梳理猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2)的毒力相关蛋白为溶菌酶释放蛋白(muraminidase-released protein,MRP)和110ku的胞外蛋白因子(extracellular protein factor,EF)。提取猪链球菌2型江苏分离株HA9801的胞壁蛋白和胞外蛋白,分别进行SDS-PAGE,切割相对分子量为
欧瑜[4]2001年在《猪链球菌2型毒力相关蛋白的检测及其基因片段的克隆与表达》文中研究说明136kD的溶菌酶释放蛋白（muraminidase-releasedprotein，MRP）和110kD的胞外蛋白因子（extracellular proteinfactor，EF）是猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）的毒力相关蛋白。提取猪链球菌2型江苏分离株HA9801的胞壁蛋白和胞外蛋白，分别进行SDS-PAGE，切割相对分子量为136kD的MRP和110kD的EF，按常规方法制备其抗体。用此抗体分别以免疫转印和ELISA法检测猪源链球菌18株国内分离株、1株德国分离株及1株猪链球菌2型人分离株的毒力相关蛋白。 提取20株待检菌株的胞壁和胞外蛋白，经测SDS-PAGE，与HA9801株的MRP和EF的抗体作免疫转印。结果显示，11株MRP阳性，10株EF及EF~*阳性，MRP及EF的分布存在4种表型：MRP~+EF~+（8/20），MRP~+EF~*（1/20），MRP~+EF~-（1/20），MRP~-EF~-（10/20）。 以培养上清作抗原，分别以马链球菌兽疫亚种参考株ATCC35246和江苏分离株HA9801为阴性与阳性对照，建立了Dot-ELISA和间接ELISA检测法。结果显示，两种ELISA的检测结果一致，MRP和EF的阳性率均为61％（11/18）。和Dot-ELISA相比，间接ELISA包被抗原的时间较长，背景也较深，但血清用量少。和免疫转印相比，ELISA只需用细菌培养上清作抗原进行检测，不需进一步处理，而且灵敏度很高，可用于大规模流行病学调查。 根据猪链球菌2型MRP和EF的基因序列，用DNAstar软件预测了抗原决定簇。根据预测结果，选定相应基因片段在大肠杆菌中克隆和表达。用BLAST软件将MRP和EF的氨基酸序列分别与Genebank中的蛋白质序列数据库进行同源性比较，结果表明，MRP与10种蛋白有27～33％的同源性，但与A群链球菌的M蛋白无同源性。根据已有信息绘制了MRP结构模式图。EF与肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae）的IgAl蛋白酶有48％的同源性。 以HA9801的基因组DNA为模板，通过PCR技术，分别扩增mrp基因304～1168bp序列和epf基因1207～1675bp序列，并按正 肉京农业大学博士学位沦文确的阅读框架分别定向克隆到表达羹体pQEXJp！中谷恍甘肽转移酶（GST）基因的下游；将重组质粒转化人大肠杆菌 BL21株，经 IPTO诱导，可分别表达分子量约为57kD（含MRP片段）和41kD（含EF片段）的融合蛋白。用MRP抗血清进行的免疫转印分析表明，57kD的融合蛋白可被MRP抗血清识别，显示该融合蛋自具有MRP的抗原表位；用 EF抗血清进行的免疫印迹分析表明，4比D的融合蛋白不能被EF抗血清识别，说明BF的抗原决定碟不存在于epf基因。1207～1675hp序列编码的肽链中。以上结果为进一步研究MRP和EF的结构和功能提供了方便。
孙学强[5]2010年在《马疱疹病毒1型感染性克隆及表达猪链球菌2型亚单位重组病毒的构建》文中研究说明马疱疹病毒1型(Equine herpesvirus type1, EHV-1)是马科动物的重要病原之一,临床上多引起呼吸道、流产及神经系统疾病。疱疹病毒拥有庞大的双股DNA基因组,由于其基因组中存在大量非必需基因,有大约30kbp的序列可以被外源基因取代,并且不会严重影响病毒在体外细胞培养中增殖,EHV-1可作为表达外源蛋白活疫苗载体,不但可以用于马病的预防,而且最近的研究显示EHV-1有发展为通用载体或者基因治疗载体的潜力。本实验以ATCC标准株438/77株基础,分别克隆其ORF19和20,与含有绿色荧光蛋白和氯霉素抗性报告基因的pHA2相连构建转移载体后,与母本病毒共转染以传统的同源重组方法在ORF19和20之间插入mini-F序列,构建了含有GFP和氯霉素基因的重组病毒,提取重组病毒基因组环状中间体电转至大肠杆菌DH10B感受态细胞,经过PGR和RFLP筛选到多株阳性细菌人工染色体(BAC)克隆,以磷酸钙法转染RK13细胞,结果均拯救出病毒。拯救病毒与转移载体p1920XM通过同源重组进一步删除含有报告基因mini-F序列构建了无痕迹有标记的恢复病毒。野生株、拯救株和恢复株经过噬斑测定和一步生长曲线测定证明各毒株体外培养特性差异不显着,说明本实验所构建的BAC具有感染性,而且mini-F的插入和删除均没有改变病毒的体外培养特性。猪链球菌2型作为一种人畜共患病病原日益受到关注,而溶血素又是其分泌到细胞外的外毒素,是公认的重要毒力因子之一,具有良好的免疫原性。通过对其基因序列的分析发现5’约81bp编码的27个氨基酸残基为信号肽序列。本试验通过PCR及融合PCR方法构建载体在大肠杆菌中成功的表达了带有信号肽和无信号肽的SLY,以及将463和464位色氨酸突变为丙氨酸的带有信号肽和无信号肽的溶血素突变体-SLYm。经过蛋白杂交试验证明,表达的重组SLY和SLYm与提取的SS2分泌的SLY分子量完全一致,而且带有的信号肽的SLY和SLYm均能在细菌上清中检测到杂交条带,说明SS2sly基因的信号肽序列同样能够引导在大肠杆菌中成熟的SLY或者SLYm进行跨膜转运,而且转运至细胞外的SLY和SLYm的分子量与SS2的分子量一致,说明其信号肽序列已被切除,而无信号肽的SLY和SLYm的上清中均未检测到。同时通过血平板和96孔板溶血试验证明溶血素突变体失去溶血活性,而野生型SLY不仅能够溶解红细胞而且对PK15.RK13.SUVEC细胞具有毒性,突变体则不能引起任何细胞发生病变。小鼠毒力实验证明所表达的SLY通过腹腔注射和静脉注射均能致死小鼠,而SLYm在同样条件下对小鼠安全。用SLY和SLYm免疫小鼠制备的抗血清均能抑制SS2SLY的溶血活性,提示了463和464为氨基酸的突变虽然灭活其溶血活性,但是仍具备免疫原性其抗血清能够封闭SLY的膜结合结构域阻止其细胞膜的结合。瞬时表达及免疫转印试验证明未经优化的SS2溶血素突变体全基因在PK15细胞中不能被Pcmv启动子启动表达,而优化合成的slyom则能够表达,所表达的溶血素蛋白在PK15细胞中不需要信号肽序列也能实现跨膜转运。MRP被认为是猪链球菌的重要的毒力因子,从病猪体内分离的菌株常常含这种分子。对链球菌致病菌株的MRP进行了克隆、测序,显示N端前47个氨基酸是典型的信号肽,游离于细菌表面,N端有7个带电荷的残基,后面是一个21个氨基酸的疏水孔和一个公认的信号肽酶切位点。剪切掉信号肽得到一个分子量为131094的成熟蛋白,它与136kD的MRP接近。C端有一类似于A群链球菌M蛋白基因的锚式序列,本试验通过构建含有mrp片段的真核表达质粒转染细胞后瞬时表达MRP并经免疫转印确定能够在Pcmv启动子启动下表达。应用疫苗预防目前仍旧是防控猪链球菌病有效措施,传统的灭活疫苗仍旧具有需多次注射的局限,新型高效的猪链球菌2型疫苗仍有待于进一步的研究。本试验在所构建的p438/77的基础上,以两步法无痕迹的将mrp基因片段和溶血素突变体分别插入EHV-1基因组内构建了重组病毒,经过免疫转印鉴定能够表达MRP和SLY。重组病毒通过传统的同源重组方法删除了含有氯霉素抗性基因以及gfp的mini-F序列获得4M和4S株。免疫小鼠后以间接ELISA方法检测到4M能够诱导小鼠产生抗MRP特异性抗体,4M株免疫小鼠后能够抵抗致死量的SLY静脉注射的攻击。
李明[6]2005年在《猪链球菌2型MRP与EPF部分片段串联表达与免疫原性及检测两种猪源链球菌抗体间接ELISA方法的建立与应用》文中研究表明马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi Subsp zooepidemicus,SEZ)和猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS_2)是我国猪链球菌病的两种主要病原。SEZ主要引起猪的化脓性关节炎和败血症,而SS_2不仅可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡,还可以感染相关人员并致死,是一种重要的人畜共患病病原。 SS_2在世界很多国家均受到重视,对它的研究主要集中在与毒力相关蛋白的研究上。溶菌酶释放蛋白(muraminidase-released protein,MRP)和胞外蛋白因子(extracellular protein factor,EPF)是SS_2两个主要的致病因子。根据MRP和EPF毒力相关蛋白的存在与否,SS_2可分为以下几种表现型:MRP~+EF~+、MRP~-EF~-、MRP~+EF~*、MRP~*EF~-、MRP~-EF~+、MRP~+EF~-、MRP~-EF~*等。对我国江苏及其周边地区的流行病学调查显示,来自疫区的SS_2均为对猪有强毒力的MRP~+EF~+表现型,由此可见,MRP与EPF在致病过程中的重要作用。目前,对两毒力因子的研究仍然是国内外的一个热点,而对两毒力因子间协同作用机理的研究,报道甚少。与此同时,对该病的防制亦缺乏有效的疫苗。 本实验目的是通过DNAStar软件分析,克隆表达mrp和epf一段基因,验证该片段具有免疫原性后,通过PCR串联两片段并克隆表达,通过动物保护性试验明确串联表达的蛋白是否具有更好的保护作用,为进一步研究其结构和协同作用机理、研制亚单位疫苗提供依据。 目前,对SEZ和SS_2抗体检测方法报道甚多,但结论不一。本实验对叁种抗原进行筛选,优化条件,建立检测两种猪源链球菌抗体的间接ELISA方法,并对猪免疫链球菌2价灭活苗后的抗体进行检测,找出抗体消长规律;每隔一定时间,分别以最小致死量强毒株CY与SS_2-1对猪进行攻毒,探讨CPS抗体水平与免疫保护之间的关系。并运用此方法对周边猪场的临床血清样品进行了检测。 1 猪链球菌2型MRP和EPF基因片段的克隆与串联表达 按照GenBank中的mrp、epf基因序列,利用DNAStar软件分析,选取一段基因序列,各设计一对引物,两端分别加限制性酶的酶切位点Nco Ⅰ、EcoR Ⅰ和EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ,分别构建原核表达载体pET32a-mrp、pET32a-epf,经克隆表达得
王海丽[7]2006年在《SS2叁种毒力相关蛋白的克隆、表达及MRP与EF单克隆抗体的制备》文中研究指明猪链球菌2型(Streptococcus suis 2，SS2)可以导致猪脑膜炎、关节炎、败血症、浆膜炎、心内膜炎、多发性关节炎等，对从业人员带来严重的威胁，可以导致人的脑膜炎、心内膜炎及中毒性休克综合症等严重疾患。目前国内外对SS的研究主要集中在SS2毒力相关因子上，目前公认的毒力相关因子有溶菌酶释放蛋白(muramidasereleased protein, MRP)、胞外蛋白因子(extracellular factor protein, EF)、溶血素(suilysin,本文简称sly)、荚膜多糖(capsular polysaccharide, CPS)等。由于对SS2毒力因子的了解较少限制了SS疫苗的研究及猪链球菌病的治疗与控制。本试验对1998年江苏海安病人分离株Habb MRP进行研究；对2005年四川资阳病人分离株分别进行EF和sly的研究。制备了MRP及EF单克隆抗体，并摸索MRP ELISA检测方法。 克隆及表达SS2人源分离株Habb mrp基因片段，构建原核表达质粒pGEX4T-2-mrp。在大肠杆菌中诱导带有谷胱甘肽转移酶(GST)标签的融合蛋白MRP-GST表达；经亲和层析法纯化后，用凝血酶酶切去除重组蛋白中的GST，制备纯化的MRP抗原。序列分析表明，获得的mrp基因长957bp；原核表达的融合蛋白MRP-GST的分子量约61kD；凝血酶处理的MRP抗原的分子量约为35kD。Western blot分析显示，MRP-GST、MRP蛋白均可与MRP多克隆抗血清发生特异性反应。成功地克隆人源分离株Habb的mrp基因片段，并在原核系统实现高效表达，制备的纯化抗原MRP具有良好的抗原性，为开展相关免疫学研究奠定了基础。 SS2 MRP单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定。以纯化的MRP-GST蛋白为免疫原，常规免疫BALB／c小鼠，采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合，并以经凝血酶酶切去除GST标签的MRP筛选细胞，经反复筛选和多次克隆化培养，筛选出特异分泌鼠抗MRP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。采用Western blot对单抗进行生物学特性的鉴定。成功获得6株持续、稳定分泌鼠抗MRP单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为1G1、1B6、288、3G9、2C3及3E5。 用表达纯化的MRP抗原、HRP标记的MRP抗原和一株MRP单抗腹水、以及ZY05719全菌兔多抗血清及猪多抗血清，建立检测猪链球菌MRP抗原及SS MRP抗体的ELISA方法。SS MRP抗血清的检测采用纯化的MRP抗原或灭活ZY05719细菌
李小军[8]2007年在《上海地区致病性猪链球菌及其毒力基因的检测》文中研究指明猪链球菌(Streptococcus suis,SS)是一种重要的人畜共患病病原，根据菌体荚膜多糖抗原性的不同，分为35个血清型(1-34型，1/2型)。世界范围内以SS2(Streptococcus suis type 2)流行最广，致病性最强，其次是1型、7型和9型。尤其是猪链球菌2型流行范围最广，对猪的致病性最强，而且可引起人的感染并致死。除SS2外，SS9主要在德国、比利时、西班牙、荷兰等地流行；芬兰以SS7最为流行。国内1991年在广东省首次分离鉴定到SS2，随后于1998年和2005年分别在江苏和四川部分地区暴发人感染SS2并致人死亡，危害严重。不同血清型的地区分布不同。上海地区是全国大规模猪养殖场较多的地区，是生猪输出、输入较大的城市，因此及时掌握上海地区致病性猪链球菌及其毒力因子的流行病学，为以后预防和控制大规模暴发猪链球菌具有重要的意义。2005年-2007年期间，以上海市畜牧兽医站日常猪病门诊为基础，部分规模化养殖场鼻拭子采样为辅，对上海地区主要致病性猪链球菌及其毒力因子进行流行病学调查。首先对采的样品中进行链球菌分离，根据培养特性及形态、染色情况，分离鉴定了306株猪源链球菌，并对其进行药敏实验。根据猪链球菌16SrRNA和gdh(谷氨酸脱氢酶)基因设计合成引物，建立的二重PCR,结合乳胶凝集试验对所分离的306猪源链球菌进行猪链球菌和链球菌A-G群鉴定，并对鉴定出的猪链球菌进行生化实验．鉴定结果表明：门诊分离的214株中，C群链球菌为主要致病菌(87株，占40．7％)，猪链球菌次之(28株，占13．1％)，A群链球菌有4株，占1．9％；B群链球菌有16株，占7．4％；D群链球菌有18株，占8．4％；E群链球菌有14株，占6．5％；另外未能定型有47株，占22％。猪场鼻拭子分离的92株中，猪链球菌4株，占4．4％；D群链球菌有52株，占56．5％；另外未能定型有36株，占39．1％。然后根据猪链球菌6种主要致病性血清型(1型、1/2型、2型、7型、9型和14型)菌株荚膜多糖的编码基因CPS1I，CPS2J，CPS7H，CPS9H的核酸序列的设计合清型分型。检测结果表明：8株SS2(8/32)、3株SS1(3/32)、2株SS7(2/32)、2株SS9(2/32)，17株SS其它血清型。对SS1、SS2、SS7、SS9共15株菌株进行泱序，测序结果与检测结果符合率达100％，与GenBank发表的序列的同源性均在990％以上。根据猪链球菌7种主要毒力基因谷氨酸脱氢酶(gdh)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gapdh)、溶菌酶释放蛋白(mrp)、胞外因子(epf)，溶血素(sly)、纤连蛋白/血纤蛋白原结合蛋白(fpbs)和毒力相关基因orf2，设计并合成7对引物，通过组合优化设计，建立猪链球菌7种主要毒力因子的两组多重PcR检测方法，并对分离到的32株猪链球菌和12株实验室猪链球菌保存菌株进行毒力基因检测。结果表明：SS2大部分均具有7种毒力因子，SS1、SS7、SS9和其他血清型的猪链球菌也均具有部分毒力因子。32株猪链球菌中，mrp检出率为25％(8/32)、epf检出率为21．9％(7/32)，sly检出率为25％(8/32)、gdh检出率为100％(32/32)，gapdh检出率为100％(32/32)，orf2检出率为78．3％(25/32)、fbps检出率为25％(8/32)。15株上海分离株毒力因子的测序结果与GenBank发表的序列的同源性均在95％以上，12株实验室保存菌株毒力因子的检测结果与已知的背景材料一致。为进一步研究所分离到的4种主要致病性血清型菌株致病力，探讨毒力基因和菌株致病力之间的关系，本实验建立了斑马鱼(Danio rerio)和新西兰白兔动物实验模型，实验结果表明：猪链球菌4种主要致病性血清型中，SS2对斑马鱼和新西兰白兔均具有致病力，而SS1、SS7，SS9叁种血清型对斑马鱼和新西兰白兔致病力弱。因此上海地区分离的SS2菌株，不仅对猪有强致病性，对斑马鱼和新西兰白兔也具有致病性，而SS1、SS7、SS9这3种血清型菌株对新西兰白兔和斑马鱼致病性较弱，这一定程度上表明，致病性菌株毒力的强弱和菌株具有的毒力基因具有相关性。
刘春生[9]2010年在《河南猪链球菌的分离、鉴定及毒力相关基因的原核表达》文中研究指明猪链球菌病是危害养猪业的一个重要传染病,可引起猪的脑膜炎、关节炎、败血症、心内膜炎等,给养殖业造成很大的经济损失。猪链球菌是其最主要的病原之一,根据其荚膜多糖抗原的差异,可将其分为35个血清型,其中1、1/2、2、7、9、14型是其主要致病性血清型,给养殖业造成很大的经济损失。同时,它也是一种重要的人兽共患病,可引起人的败血症、脑膜炎和永久性耳聋等,甚至引起死亡,在公共卫生方面引起极大关注。本研究旨在建立快速特异的免疫学和分子生物学检测方法,同时对河南省病猪群中猪链球菌的感染状况及血清分布进行调查,为该病的快速诊断和防制提供参考。1、猪链球菌主要致病血清型PCR检测方法的建立根据猪链球菌种特异的gdh基因序列及1(14)、2(1/2)、7、9型型特异的cps1I、cps2H、cps7H、cps9G基因序列,分别设计了5对引物,预计扩增目的片段分别为689bp、441bp、542bp、232bp和330bp。通过优化反应体系,分别建立了快速检测猪链球菌种及其1(14)、2(1/2)、7型的四重PCR方法和猪链球菌9型的单一PCR方法。利用保存的猪链球菌不同血清型菌株和其他相关标准菌株为参照进行特异性和敏感性试验。用所建立的PCR方法对河南省不同地市的39份猪扁桃体样品进行检测,并选取部分样品通过PCR产物序列测定进行了验证。所建立的PCR法特异、敏感,其中四重PCR对猪链球菌2型的最低检出水平为2.52CFU。该PCR法准确性很好,可用于猪链球菌主要致病血清型的快速检测。2、河南省发病猪群猪链球菌的分离、PCR鉴定及其血清型分布利用所建立的PCR方法,对河南省14个地市33个猪场采集的83份发病猪扁桃体样品进行PCR检测,同时分离疑似猪链球菌,进行形态学、染色特性鉴定、并用猪链球菌种及其主要致病血清型PCR方法进行鉴定,再抽取部分PCR产物进行序列测定进行验证。扁桃体样品中共检测出猪链球菌阳性77份,检出率为92.8%,其中2型15份,占18.1%;7型4份,占4.8%;9型26份,占31.3%;没有检测出血清1型;同时检出2型和7型的有8份,9.6%;同时检出9型和7型的有2份,占2.4%;共分离到猪链球菌菌株77株,其中2型7株,占9.2%;7型3株,占4.0%;9型4株,占5.3%;未定型的63株,占81.8%;没有分离到血清1型。分离到的猪链球菌均为针尖状大小、灰白色或灰色、呈α、β、γ溶血的小菌落,革兰染色均为阳性球菌,一般成对或短链状,偶有长链。结果说明河南省病猪群中猪链球菌的携带率很高,主要为血清9型,其次是2型,7型较少;未发现1型。猪链球菌致病血清型常与HCV,PCV2等混合感染;分离到的猪链球菌菌株较纯,可作为背景明确可靠的实验材料用于今后的生产和科研。3、猪链球菌谷氨酸脱氢酶(GDH)基因的克隆与序列分析PCR扩增出猪链球菌1、2、7、9及其它未定型菌株共5个菌株的gdh基因,克隆于pMD-18T载体,转化宿主菌JM109中进行序列测定。并从GenBank中下载猪链球菌2、7、9型gdh基因序列共16个,对其进行比较分析。成功克隆了5株猪链球菌的gdh基因,序列分析显示其gdh基因与GenBank中已登录的猪链球菌gdh基因有密切的亲缘关系,21株不同血清型菌株gdh基因的核酸同源性96.4%～100%;其推导的氨基酸序列同源性在98.4%～100%,最高只有5个氨基酸的差异。15株血清2型菌中,该基因的核苷酸同源性在99.9%～100%,氨基酸同源性在99.6%～100%,其中有13株为100%,另2株仅有一个氨基酸的差异。对21个菌株的氨基酸序列比较发现,6个血清2型之外菌株的氨基酸序列都有3处氨基酸存在差异,分别发生在299aa处,Ser→Ala,305aa和330aa处,Lys→Glu。除此之外,个别序列在其它位点与2型仅存在1或2处氨基酸的差异。该蛋白抗原性预测显示其共含21-22个抗原表位,BLAST分析显示有13-14个表位是特异性的抗原表位。表明所克隆的基因在猪链球菌之中非常保守,可以进行表达以用作免疫学方面的相关研究。4、猪链球菌血清2型PDSWG-1株gdh基因及9型荚膜多糖cps9G基因的原核表达设计2对引物,分别采用PCR法以猪链球菌2型河南分离株PDSWG-1及猪链球菌9型河南分离株PY-2的基因组DNA为模板扩增出gdh和cps9G全基因。用限制性核酸内切酶BamHⅠ、XhoI进行双酶切后,定向克隆至pET32a(+)中,构建重组表达质粒pET32a-gdh和pET32a-cps9G,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行鉴定。通过优化表达条件,pET32a-gdh/BL21经0.8 mmol/L IPTG诱导3h后SDS-PAGE分析表明,重组菌株表达出了约68.8KDa的融合蛋白条带,与预期结果一致。pET32a-cps9G/BL21经1.2 mmol/L IPTG诱导4h后SDS-PAGE分析表明,重组菌株表达出了约50.7KDa的融合蛋白条带,与预期结果一致。Western blotting分析表明,这两个融合蛋白均具有特异的生物学活性。为建立快速、简便、特异的免疫学检测方法及制备单克隆抗体提供了较好的抗原,同时为研制猪链球菌亚单位疫苗和诊断试剂盒奠定了基础。
侯慧丽[10]2008年在《SS2毒力因子EF/MRP在乳酸菌中的表达及其作为口服疫苗的研究》文中研究说明猪链球菌2型(Streptococcus suis type 2,SS2)是我国猪链球菌病的重要病原,不仅可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡,还可感染相关人员并致死,是一种重要的人畜共患病病原。目前国内外对SS2的研究主要集中在其毒力相关因子上,公认的毒力相关因子有溶菌酶释放蛋白(muramidase released protein,MRP)、胞外蛋白因子(extracellular factor protein,EF)、溶血素(suilysin,SLY)、荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)等。乳酸菌是一种公认安全的(generally regards as safe,GRAS)食品级微生物,能作为活疫苗抗原传递载体为探讨SS2的重要毒力因子MRP和EF在乳酸菌中的表达及其用作口服疫苗的可行性,本研究克隆了epf、mrp抗原性较高的部分片段,将其分别与启动子P59和信号肽SP_(Usp45)连接,最终构建了EF的组成型分泌表达载体pHL301、MRP的组成型分泌表达载体pHL302;分别与诱导型启动子P_(nisz)和SP_(Usp45)连接,获得了EF的诱导型表达载体pHL401、MRP的诱导型表达载体pHL402。同时并将epf、mrp基因串联构建了EF-MRP组成型表达载体pHL500和诱导型表达载体pHL600。将构建的组成型表达载体pHL301、pHL302分别转化至Lactococcus lactis MG1363、Lactobacillus casei ATCC27092、Lactobacillus brevis ATCC 8287、Lactobacillus acidophillus HLA、Lactobacillusplantarum NCIMB8826中,诱导型表达载体pHL401、pilL402、pnL600转化至L.lactis NZ9000中,pilL500转化至Lb.plantarum NCIMB8826中,通过Westernblotting检测蛋白的表达情况。EF、MRP在各重组菌中均得到了不同程度的表达,特别是在重组Lb.casei ATCC27092中,EF和MRP蛋白在细菌生长的各阶段都能很好的表达:在重组Lb.plantarum NCIMB8826中,蛋白基本全部分泌至培养基中,且分泌表达时间长,甚至在OD_(600)=1.6时仍能很好的表达;在重组L.lactisNZ9000中,蛋白表达量相对更高。将含有表达EF、MRP的重组Lb.casei ATCC27092、Lb.plantarumNCIMB8826、L.lactis NZ9000菌体口服饲喂C57BL/6J小鼠,发现Lb.caseiATCC27092/pHL301能刺激小鼠发生免疫反应产生EF特异性抗体,Lb.caseiATCC27092/pHL302能刺激小鼠产生MRP特异性抗体,而其他重组菌抗体水平很低,或者根本检测不到抗体的产生。上述试验结果说明,表达EF或MRP的Lb.casei ATCC27092均能对小鼠产生保护作用,而重组Lb.plantarumNCIMB8826、L.lactis NZ9000菌却未能达到预期的效果。
参考文献：
[1]. 猪链球菌2型部分毒力基因序列测定及血清学调查分析[D]. 郭长明. 福建农林大学. 2008
[2]. 猪链球菌2型与猪胸膜肺炎放线杆菌基因工程亚单位疫苗的研究[D]. 徐国华. 南京农业大学. 2011
[3]. 猪链球菌2型毒力相关蛋白的检测及其基因片段的克隆与表达[C]. 欧瑜, 陆承平. 新世纪 新机遇 新挑战——知识创新和高新技术产业发展（上册）. 2001
[4]. 猪链球菌2型毒力相关蛋白的检测及其基因片段的克隆与表达[D]. 欧瑜. 南京农业大学. 2001
[5]. 马疱疹病毒1型感染性克隆及表达猪链球菌2型亚单位重组病毒的构建[D]. 孙学强. 南京农业大学. 2010
[6]. 猪链球菌2型MRP与EPF部分片段串联表达与免疫原性及检测两种猪源链球菌抗体间接ELISA方法的建立与应用[D]. 李明. 南京农业大学. 2005
[7]. SS2叁种毒力相关蛋白的克隆、表达及MRP与EF单克隆抗体的制备[D]. 王海丽. 南京农业大学. 2006
[8]. 上海地区致病性猪链球菌及其毒力基因的检测[D]. 李小军. 南京农业大学. 2007
[9]. 河南猪链球菌的分离、鉴定及毒力相关基因的原核表达[D]. 刘春生. 河南农业大学. 2010
[10]. SS2毒力因子EF/MRP在乳酸菌中的表达及其作为口服疫苗的研究[D]. 侯慧丽. 湖南农业大学. 2008
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