王强[1]2003年在《小鼠骨髓不成熟DC的体外扩增、鉴定及抗成熟特性的研究》文中研究表明同种异体皮肤移植为早期、有效的覆盖大面积深度烧伤创面提供了一个良好的思路，但移植后排斥反应制约了该技术的应用。我们以移植领域的最新研究成果即联合移植来自同一供者的皮肤和不成熟树突状细胞能成功诱导耐受为基础，拟采用微染色体介导的基因转移技术，构建携带皮肤供者主要组织相容性抗原的第叁方不成熟树突状细胞，以增强其诱导移植耐受的效果并解决临床工作中遇到的皮源与不成熟树突状细胞源不一致的矛盾。本实验为该课题的第一步，即建立体外大量扩增不成熟树突状细胞的方法。树突状细胞是体内最重要的专职抗原提呈细胞，具有很强的诱导初次免疫应答的能力，在感染免疫、移植排斥、肿瘤免疫等过程中发挥重要的作用。而不成熟树突状细胞由于缺乏协同刺激分子，在免疫应答过程中非但不能激活效应细胞，反而诱导其无能，从而导致免疫耐受。由于不成熟树突状细胞在体内分布广泛，且数量少，难以从组织中直接分离和纯化，目前多采用体外诱导树突状细胞前体细胞分化、发育的方法获得不成熟树突状细胞，但方法复杂、所需细胞因子剂量较大、培养时间较长，且各家报道的方法不一，主要表现在所用细胞因子种类、剂量、培养时间、培养基类型等方面，这些差异直接与其诱导耐受的效果相关。在本研究中，我们分别运用大剂量和小剂量rm GM-CSF对小鼠骨髓源的祖细胞进行培养，并从形态学、组合性细胞表面标志、混合淋巴细胞反应中刺激未致敏T淋巴细胞增殖叁个方面进行鉴定，并根据严重烧伤病人体内存在大量如LPS等促使DC成熟的物质，在体外研究了它们对此类不成熟树突状细胞的影响。本研究分两部分进行：1、小鼠骨髓不成熟树突状细胞的体外扩增及鉴定；2、小鼠骨髓不成熟树突状细胞抗成熟特性的研究。主要结果和结论如下：1、小鼠骨髓源的祖细胞在单独应用小剂量rm GM-CSF培养6天后获得的细胞形态上具有树突状细胞的典型特征，在细胞表型、细胞功能实验上具有不成熟的特性，说明该实验建立的培养不成熟树突状细胞的方法是切实可行的。2、rm GM-CSF的剂量与细胞的成熟程度直接相关，一般说来，较大剂量的rm<WP=7>GM-CSF诱导生成的细胞以成熟树突状细胞为主，而小剂量rm GM-CSF诱导生成的细胞以不成熟树突状细胞为主。3、本实验中获得的不成熟树突状细胞在与LPS、TNF-α、IFN-γ共同培养3天后，其诱导未致敏T淋巴细胞增殖的能力并未增强，说明该细胞具有其它不成熟树突状细胞不具备的抗成熟特性。
姜艳[2]2005年在《人外周血未成熟树突状细胞体外扩增、鉴定及抗成熟特性的研究》文中认为创面处理是成功救治大面积深度烧伤病人的关键问题之一,及时、有效的覆盖创面,将对后续治疗产生积极的影响。同种异体皮肤移植为创面的覆盖提供了一条良好的思路,但因其具有抗原性,移植后的排斥反应严重影响了治疗效果。免疫抑制剂虽可延长其存活时间,但对于大面积烧伤病人而言,本身就处于一种免疫功能明显低下状态,大量抑制机体免疫力的抗排斥药物的应用反而增加了感染的危险性。因此诱导受体对供体皮肤产生特异性的免疫低下或免疫耐受状态而同时保持受体正常的免疫功能至关重要。树突状细胞(dendritic cell,DC)是体内功能最强的抗原呈递细胞(antigen-presenting cell,APC),是天然免疫和获得性免疫的重要调节剂。因其来源、发育阶段和细胞表型等的不同而存在功能异质性。而未成熟DC 由于其表面缺乏共刺激分子,不能够提供T 细胞活化所必需的共刺激信号,在免疫应答过程中非但不能激活T 细胞,反而可诱导其无能,从而成为诱导移植免疫耐受的重要靶细胞。虽然DC 在体内分布广泛,但数量少且分散,而未成熟DC 主要分布在外周非淋巴组织内,直接分离、提纯十分困难,不能满足体内或体外研究及临床应用的需要。同时在大面积烧伤病人体内存在着大量的内毒素(lipopolysaccharide,LPS)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等促进DC 成熟的物质,因而明显影响了其致耐效果。白介素-10(interleukin-10,IL-10)是一种抗炎性细胞因子,在同种异体混合淋巴细胞反应中能抑制T 细胞的活化、增殖,有研究表明移植术前给予IL-10 可延长移植物的存活时间。而DC 又是T 细胞活化的关键环节,推测其抑制作用可能是通过对APC 功能的影响来实现的。在本研究中,我们联合应用rhGM-CSF 和rhIL-4 体外诱导、扩增人外周血分离的单个核细胞,第7d 同时加入rhIL-10 联合培养,于第9d 收获细胞,从形态学、细胞表面标志物以及混合淋巴细胞反应(MLR)中对同种异体未致敏T 淋巴细胞刺激能力叁个方面进行鉴定。并将培养的细胞分别用LPS、TNF-α继续刺激2 天,再进行MLR,观察IL-10 对外周血单个核细胞来源的未成熟DC 的影响,以期为体外获得足够数量
王永权[3]2006年在《不同转染方式对人脐带血来源未成熟树突状细胞成熟特性的影响》文中提出树突状细胞(dendritic cell, DC)是一类重要的专职抗原呈递细胞(antigen-presenting cell , APC),虽然在体内的数量较少,但是其强大的抗原递呈和处理功能在机体的免疫反应中起重要的作用。DC的发育分化过程伴随着DC由不成熟的前体细胞向成熟细胞转变,未成熟DC(immature dendritic cell, imDC)与成熟DC(mature dendritic cell, mDC)在表型特征以及生物学功能上都有区别,而imDC最大的特点就是在体外可以诱导T淋巴细胞特异性低应答。临床上同种异体皮肤移植是目前大面积深度烧伤患者早期创面覆盖最直接、有效的治疗方法,但是由于皮肤的强烈抗原特性,导致移植后平均3周左右外源皮肤就会发生不可逆的排斥反应,极大抑制了自体微粒皮混合大张异体皮移植效果。免疫抑制药物虽可减轻免疫排斥,但是由于大面积严重烧伤患者的免疫功能耗竭,可导致严重感染威胁患者生命。若能有效利用imDC的特殊作用,移植前后在受者体内输入基因工程制备的imDC,可特异性地减轻皮肤移植后受者对供者抗原的免疫排斥反应、延长异体皮的存活时间,从而提高大面积深度烧伤患者的手术治疗效果。随着基因治疗的不断深入和发展,利用各种基因工程改造DC诱导器官移植耐受的实验性研究已经逐渐深入,如将各种趋化因子受体(chemokine receptor, CCR)的基因导入imDC中,使其靶向归巢至引流淋巴结中,有效发挥诱导耐受的功能,或者将针对细胞毒性T淋巴细胞相关抗原免疫球蛋白(CTLA-4Ig)的基因导入imDC中,表达的产物抑制imDC和T细胞表面CTLA-4的结合从而抑制共刺激效应和免疫激活,等等。因此,有效地实现imDC的免疫耐受功能需要将目的基因通过特定的方式整合到树突状细胞中,但在转染过程中,存在的一个问题是不同的转染方式常能影响DC作为抗原递呈细胞的功能,转染未成熟树突状细胞后可能会诱导其成熟。在本研究中,我们联合应用rhGM-CSF和rhIL-4体外诱导、扩增人脐带血分离的单核细胞,第7d收获细胞,从形态学、细胞表面标志物以及混合淋巴细胞反应(MLR)中对同种异体未致敏T淋巴细胞刺激能力叁个方面进行鉴定。然后我们用两种常用的
裘影影[4]2008年在《间充质干细胞对系统性红斑狼疮的免疫调节作用》文中进行了进一步梳理目的：探讨体外人间充质干细胞(HMSCs)对系统性红斑狼疮(SLE)的免疫调节作用和小鼠间充质干细胞(mMSCs)联合来氟米特(LEF)对小鼠T淋巴细胞的免疫调节作用。方法：分别从BALB／c小鼠骨髓和健康人骨髓中分离培养MSCs。(1)用EZ-SepTM Mouse 1X分离异体BALB／c小鼠的脾淋巴细胞，在ConA诱导的同时，先经LEF处理，洗去LEF后，脾淋巴细胞再和mMSCs共同培养。分组：A组：脾淋巴细胞；B组：脾淋巴细胞+mMSCs；C组：LEF处理的脾淋巴细胞；D组：LEF处理的脾淋巴细胞+mMSCs。用MTT比色法检测各组T淋巴细胞的增殖情况，流式细胞术分析各组T淋巴细胞的活化及凋亡情况，定量RT-PCR检测各组T淋巴细胞的IL-2、IL-10 mRNA水平。(2)在PHA刺激下，SLE患者外周血淋巴细胞与不同数量的HMSCs共同培养。检测各组T淋巴细胞的增殖、凋亡情况，分析各组T淋巴细胞的IFN-γ、IL-10、TGF-β1 mRNA水平。(3)分离SLE患者外周血单核细胞，在含rhGM-CSF和rhIL-4的培养条件下制备树突状细胞(DC)。分组：HMSCs处理组、HMSCs未处理组。用流式细胞仪检测各组DC表面CD86、CD83、CD1a和HLA-DR的表达，MTT法检测各组DC刺激淋巴细胞增殖的能力。结果：(1)在体外，mMSCs联合LEF对小鼠T淋巴细胞的增殖、IL-10mRNA的表达有协同抑制作用。(2)HMSCs对由PHA诱导的SLE患者T淋巴细胞的增殖、凋亡均有抑制作用，且抑制作用与HMSCs呈剂量依赖性。HMSCs能促进SLE患者T淋巴细胞TGF-β1 mRNA的表达，抑制IL-10、IFN-γmRNA的表达。(3)HMSCs可以影响SLE患者单核细胞来源的DC分化、成熟、具有抑制DC刺激异体淋巴细胞增殖的能力。结论：(1)mMSCs联合LEF对小鼠T淋巴细胞有一定程度的协同免疫调节作用；(2)HMSCs可能通过抑制SLE患者T淋巴细胞增殖、减少T淋巴细胞凋亡、促进T淋巴细胞TGF-β1 mRNA表达、抑制IL-10、IFN-γmRNA表达及影响SLE患者单核细胞来源DC的发育、成熟和功能的途径，下调SLE患者的免疫反应。
张新华[5]2003年在《TGFβ1基因转染大鼠树突状细胞增强移植心脏耐受性及相关趋化因子表达的研究》文中认为目的： 1．建立从大鼠骨髓前体细胞分离、培养和扩增树突状细胞(dendritic cell, DC)的方法；研究影响骨髓DC(bone marrow derived DC, BM-DC)分化、成熟的相关因素以及不同分化时期DC的免疫免疫生物特性。 2．构建人TGFβ1基因的真核表达质粒TGFβ1-pcDNA3以及反义TGFβ1-pcDNA3(ASTGFβ1-pcDNA3)并转染大鼠DC，研究TGFβ1基因转染对DC的成熟分化以及免疫功能的影响。 3．观察TGFβ1-DC在受者大鼠体内迁移归巢途径及微嵌合水平，检测受者次级淋巴器官T细胞凋亡和端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)表达的变化。 4．探讨TGFβ1-DC对移植心脏的急性排斥反应发生时间、排斥反应级别以及存活时间的影响；并进一步研究TGFβ1-DC输注对移植受者体内多种相关趋化因子及其受体表达的影响。 方法： 分离F344大鼠骨髓前体细胞，在rmGM-CSF+TGFβ1或rmGM-CSF+rmIL-4的联合作用下，培养、扩增大鼠骨髓来源DC(bone marrow derived DC, BM-DC)。分别从形态学(光镜、电镜)、免疫细胞化学(FACS，ICC)以及免疫生物学(MLR)等方面研究大鼠BM-DC的免疫生物特性。构建重组人TGFβ1-pcDNA3表达质粒，并转染DC制备TGFβ1-DC，应用多种分子生物学技术(RT-PCR, Western blot等)及免疫学技术研究TGFβ1基因转染对于DC发育分化、分子表型以及免疫功能的影响，检测TGFβ1-DC刺激T细胞增殖的能力；TGFβ1-DC异体输注Lewis大鼠后，以免疫组织化学检测TGFβ1-DC的迁移路线和分布特征，TUNEL检测受者脾T细胞凋亡以及端粒酶逆转录酶hTERT的表达。按Ono's方法建立大鼠同种异体心脏移植模型，观察TGFβ1-DC输注对于移植心脏排斥反应出现时间、反应级别以及存活时间的影响，以免疫组织化学方法观察移植后相关趋化因子的表达和变化。 结果：中文摘要1、应用细胞因子rmGM一CSF+rrIL一4，骨髓前体细胞在培养第6天时，可观 察到有大小不等的集落生成，吞饮和吞噬能力较强，MLR实验中不能刺 激T细胞增殖。培养至第ro天，集落减小并减少，多数细胞从集落中 释放，散在悬浮细胞增多。细胞多具有较长的树枝状突起，细胞吞饮吞 噬能力减低，MHCll类分子和B7一2分子表达增高，刺激T细胞能力增 强。应用n庄L一4可提高细胞得率，每只大鼠二后肢骨髓前体细胞经过扩 增可得到8一20xl护个细胞。2、一定浓度的thTGF印对Dc的扩增和分化具有抑制作用，细胞集落较少， 细胞成熟缓慢，大多数细胞无突起或突起较短。MHCll类分子和B7一2 分子表达较低，刺激T细胞增殖能力低下，但加入LPS刺激后MLR刺 激指数与IL一4对照组细胞无明显差异，细胞得率略低。3、通过酶切后连接、质粒转化、扩增与抽提，构建得到TGFpl重组真核表 达质粒TGF印一peDNA3。经酶切电泳和DNA测序鉴定，证实重组质粒 构建正确。4、以Westem blot、RT-PCR、免疫细胞化学以及免疫荧光染色显示脂质体 DOTAp可介导TGF困一peDNA3转染大鼠imDc，并得到有效mRNA和 蛋白表达，经测定转染效率可达到18~23%。5、应用FAcs和免疫细胞化学等方法检测发现，转染TGF印基因得到的 ToFpl一ne表面盯IB、B7一2、IcAM一l和ox62等分子表达均明显低于 对照组，MLR显示，TGF印一DC刺激T细胞增殖能力低下。TGF印基 因转染对DC生长无明显抑制作用。6、转染后各组DC输注Lewis大鼠发现，各组DC主要归巢到受者大鼠的 次级淋巴器官胸腺依赖区，其中尤其以TGF印一DC组在输注后第7一14 天时在脾的动脉周围淋巴鞘和边缘区数量最多。7、经TUN旧L、hTERT等方法显示，TGFpl一DC组受者大鼠脾动脉周围淋 巴鞘等处的T细胞凋亡水平明显高于对照组，并且发现该组的T细胞 h花RT表达水平明显低于对照组。8、各组DC异体输注一周后行F344叶Lewis大鼠的心脏移植，发现 TGF印一DC组排斥反应发生时间延迟，排斥反应级别明显降低，移植心中文摘要 脏存活时间显着延长，最长可达51天，平均存活时间达到33.14士7.88 天，与其它组相比具有显着差异(p<0 .01) 9、研究各组移植心脏、受者脾和淋巴结等器官趋化因子RANTES、MCP一1、 Mlp一la、FKN及其受体的表达，发现TGF印一DC输注不同程度地降低 了以上趋化因子的表达，改变其表达模式，提示TGF印下调相关趋化因 子表达可能是TGF印一DC增强移植心脏耐受性的机制之一。结论: 1、TGF印可降低培养BM一Dc的MHcll类分子和B7一2分子表达以及刺激 T细胞能力，该效应可被LPS所逆转。 2、脂质体介导TGF印基因转染Dc可以获得有效表达，TGF印一Dc的分 子表型、分化程度均显示TGF印一DC为imDC。 3、TGF印一Dc术前输注受者大鼠可延迟移植心脏排斥反应发生时间，降低 排斥反应级别，延长移植心脏存活时间。 4、TGF印一DC输注可改变移植心脏及受者次级淋巴器官相关趋化因子及 其受体的表达程度和表达模式。创新点及意义: 1、结合以往小鼠DC培养经验，经过改良，建?
李晓红[6]2010年在《细胞因子IL-2，15联合自体DCs对人外周血来源的NK细胞体外扩增及功能影响的研究》文中进行了进一步梳理目的意义：供者异源反应性NK细胞在异基因造血干细胞移植中可以发挥移植物抗白血病(graft-versus-leukemia,GVL)效应,并减少移植物抗宿主病(graft-versus-host disease, GVHD)的发生；在实体瘤(如肾细胞癌、黑色素瘤)也有裂解肿瘤细胞的抗实体瘤作用。故输注供者异源反应性NK细胞已经成为临床移植及抗肿瘤辅助治疗的新策略。但外周血中NK细胞含量少,目前尚缺乏有效的体外扩增体系。本研究目的在于探讨从人外周血中分选及扩增高纯度NK细胞的方法,尤其是自体DCs作为饲养细胞的可行性及效果,并对扩增后NK细胞功能进行评价,以期筛选出有效的NK细胞体外扩增方法,为进一步的临床应用奠定基础。材料和方法：先采用miniMACS免疫磁珠分选方法,从外周血单个核细胞(PBMNC)得到纯化的CD14+单核细胞及NK细胞,随后体外经GM-CSF及IL4诱导单核细胞5天,成为非成熟DCs。在干细胞培养基条件下,NK细胞经IL2和IL15培养5天后,培养体系中加入不同比例的DCs,根据与DC混合的比例及方式将培养体系分为5组：A组：NK／DC=10:1,B组：NK／DC=5:1;C组：NK／DC=2:1,D组：NK／DC=1:1 transwel1非接触共培养,E组(对照组)：不加DC。培养15天,每3天半量换液并补充细胞因子；检测分选及扩增前后(CD3~-CD56')NK细胞含量、扩增倍数及扩增前后各组NK细胞功能的变化(从以下叁方面进行)：在不同效靶比下对K562细胞的杀伤作用；realt ime-PCR方法定量检测IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B mRNA的表达水平；流式检测NK细胞表面KIR3DL1. NKG2D表达的变化,并探寻可能的miRNA调控机制。结果：(1)经miniMACS阴性免疫磁珠分选后(CD3~-CD56~+)NK细胞含量由分选前的11.19±5.25%提高到94.23±3.50%。培养15天后除C组NK细胞纯度略有下降外,其余四组与扩增前无显着性差异(P>0.05)；(2)在各培养体系中A、B、C、D组细胞的扩增倍数分别为168±64.4、170.5±82.6,244.8±148,和70.8±17.5,均显着高于对照组(未加DC)的50.46±4.3(P<0.01)；(3)培养后NK细胞对K562细胞的杀伤活性呈A组≈B组(P>0.05)>C组>D组>E组(P<0.05)。(4)各扩增体系NK细胞IFN-γ、Perforin及GranzymeB基因的表达量均较扩增前(NKO组)明显增加(P<0.01)。(5)细胞因子扩增后CD158e+的细胞下降约10%(P<0.05)。荧光素酶报告实验显示miR-146b可与KIR3DL13'UTR在靶位点特异结合,很有可能调控KIR3DL1的基因表达。结论：经miniMACS免疫磁珠阴性分选得少量高纯度NK细胞后,在含IL2(200U／mL)+IL15(20ng／mL)的SCGM(含5%人AB血清的)培养条件下,以人外周血单核细胞诱导的未成熟DC作为饲养细胞,当NK细胞与DC比例为10：1时,我们可以获得纯度高、细胞毒活性强、增值倍数高的NK细胞。荧光素酶报告实验显示miR-146b很可能参与调控KIR3DL1的表达.
周英武[7]2011年在《人参皂苷Rg1对树突状细胞效应与分子机制的研究》文中提出目的人参是传统的补药,具有延长寿命和增强人体抗病能力的作用,可有效地抗应激、抗疲劳、抗肿瘤以及抗氧化等作用。人参皂苷是其主要有效成分,其中以人参皂苷Rg1含量较高。对人参的药物基因组学和调节阴阳平衡研究表明,人参皂苷Rgl具有抗肿瘤作用和类固醇激素样作用。树突状细胞(DC)是功能最强的专职抗原提呈细胞,它可捕获肿瘤细胞分泌的可溶性抗原,以MHCⅠ类分子或Ⅱ类分子限制的方式提呈给CD8+T细胞或CD4+T细胞,使之活化并发挥抗瘤效应。其中CD4+T细胞还参与激活B细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞(NK)和细胞毒淋巴细胞(CTL),协同发挥抗肿瘤作用。人参皂苷Rg1作为人参的主要成分,可提高小鼠的非特异性免疫功能,但其机制尚不清楚,是否能通过影响DC功能而提高免疫应答有待进一步研究。基因芯片在研究药物对机体免疫系统的调节,寻找药物靶向方面具有优越性,本课题运用功能基因芯片技术,研究与DC功能相关的基因,以期找到人参皂苷Rg1作用于DC的相关分子,明确人参皂苷Rg1发挥免疫调节作用的信号通路,为中医药“扶正祛邪”治疗原则以及人参的双向免疫调节作用提供实验依据,也为人参皂苷Rg1作为临床抗肿瘤新中成药的组成成份提供明确的生物学基础和实验依据。方法1、实验一针对人参皂苷Rg1是否影响卵清蛋白(OVA)免疫小鼠特异性免疫应答能力进行研究。以OVA为抗原,混合人参皂苷Rgl或氢氧化铝(Al(OH)3)佐剂,颈部皮下免疫BALB/c小鼠,间隔2周,免疫叁次。分为生理盐水对照组(NS组)、人参皂苷Rgl对照组(Rg1组)、铝盐对照组(A1组)、OVA组、OVA+Al组和OVA+Rg1组共六组。免疫叁次后第10天,采用MTT比色法测小鼠脾淋巴细胞的增殖能力、用间接ELISA法分别测总血清IgG、IgG1、IgG2a、IgG2b变化以及血清白细胞介素-4(IL-4)、γ干扰素(IFN-γ)的分泌水平等指标的变化,探讨人参皂苷Rgl对BALB/c小鼠免疫调节作用的影响。2、实验二以体外培养小鼠骨髓来源树突状细胞模型为研究对象,以粒细胞及巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4刺激骨髓造血干细胞,从而使之朝树突状细胞方向分化。待培养至第7天收集细胞,加入不同药物刺激24小时,分为培养基对照组(Ⅰ组)、人参皂苷Rg1组(Ⅱ组)、脂多糖(LPS)组(Ⅲ组)和人参皂苷Rg1+LPS组(Ⅳ组)共四组。培养过程使用相差显微镜观察DC的形态变化,并在培养结束时采用流式细胞术检测各组DCs标志表面分子MHC-Ⅱ、CD40和CD86的表达情况,探讨人参皂苷Rgl能否能促进树突状细胞的成熟以及人参皂苷Rg1作用于DC的可能机制。3、实验叁中,对于树突状细胞吞噬抗原能力的检测,收集培养6天的骨髓造血干细胞(即未成熟DCs),加入不同浓度的人参皂苷Rg1刺激24小时后,加入FITC-OVA避光孵育1小时,最终冰上终止反应5分钟,流式细胞仪检测树突状细胞吞噬FITC-OVA的荧光强度。对于DCs处理提呈抗原能力的检测,收集培养6天的骨髓造血干细胞(即未成熟DCs),加入不同浓度的人参皂苷Rg1刺激细胞24小时后,用SIINFEKL肽段刺激,再加入1μg/ml的LPS刺激16小时后和B3Z T细胞孵育,通过检测上清中IL-2的水平判断致敏后的树突状细胞对B3Z T细胞的活化能力。细胞因子的检测分组和实验二相同,加入药物刺激后为检测IL-12分泌水平的孵育时间为24小时,而为检测IL-4和IL-10分泌水平的孵育时间为48小时,利用间接ELISA法检测树突状细胞培养上清中细胞因子IL-12、IL-4、IL-10水平。进一步揭示人参皂苷Rgl免疫调节作用的机制。4、实验四分组和实验二相同,以GM-CSF和IL-4刺激骨髓造血干细胞,从而使之朝树突状细胞方向分化。待培养至第7天收集细胞,加入不同药物刺激24小时,分为培养基对照组、人参皂苷Rg1组、LPS组和人参皂苷Rgl+LPS组共四组。培养结束后,抽提树突状细胞总RNA,利用树突状和抗原呈递细胞基因芯片对细胞功能相关基因进行检测,以筛选人参皂苷Rgl作用于DC的差异表达基因,为进一步寻找药物作用靶点提供了线索。5、实验五通过分析总结实验四的结果找出感兴趣的目的基因,以GAPDH为管家基因,提取细胞RNA,以等量RNA为模板,以各基因特异引物,采用半定量RT-PCR检测EGFR和p44 mRNA表达水平；不同药物和DC孵育后,裂解细胞提取蛋白质,总蛋白跑SDS-PAGE后转膜,采用Western blot法分析EGFR和ERK1/2蛋白表达水平从而进一步证实人参皂苷Rg1是否影响EGFR-p44 MAPK途径对DC产生调控作用。结果1、用人参皂苷Rg1、铝盐佐剂以及卵清蛋白(OVA)免疫各组小鼠,体重并无明显差异。OVA特异性总IgG抗体水平的OD值,按照从小到大的顺序依次是：OVA<(OVA+Rg1)<(OVA+A1),其中(OVA+Rg1)组明显高于OVA组(p<0.01);(OVA+Rg1)组IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3抗体水平明显高于OVA组(p<0.05);(Al+OVA)组IgG1、IgG3.IgG2b抗体具有较高水平,IgG2a低水平(p>0.05).OVA组与NS组相比,IgG1和IgG3具有较高水平；此外,(OVA+Rg1)组免疫小鼠脾细胞对OVA抗原刺激的增殖反应在各组中最高；ELISA结果显示(OVA+Rg1)组脾细胞分泌的IFN-γ含量最高,且(OVA+Rg1)组和OVA组存在明显差别(p=0.03)；而(OVA+Al)组与OVA组相比分泌更高水平IL-4(p=0.01)。2、体外培养BM-DC 7d后,相差显微镜下可见典型形态的树突状细胞,收集总DC数超过85%。40lg/ml的人参皂苷Rgl处理不成熟BM-DC 24小时后,表面分子I-A/I-E、CD40和CD86变化不显着；加入LPS后,DC表面的I-A/I-E、CD40和CD86分子均显着升高(p<0.05,与对照组相比)；人参皂苷Rgl和LPS同时加入DC时,细胞表面的I-A/I-E分子表达显着性升高(p<0.05,与LPS组相比),而CD40和CD86升高不明显。3、人参皂苷Rg1可以在体外促进未成熟DC分泌IL-12,和LPS同时作用时,有协同增强作用；此外人参皂苷Rgl还能促进未成熟树突状细胞分泌IL-4和IL-10；人参皂苷Rg1可以显着增强未成熟树突状细胞吞噬FITC-OVA抗原,并且促使成熟树突状细胞处理抗原肽,并提呈给T细胞使之活化分泌IL-2。4、树突状细胞RNA提取A260/A280的比值在2.0左右,变性琼脂糖凝胶电泳RNA条带清晰,28s:18s rRNA条带亮度接近2：1；经终浓度为40μg/ml的人参皂苷Rg1和/或1μg/ml LPS处理24小时后,人参皂苷Rgl组与对照组相比较(Ⅱ/Ⅰ)上调≥2倍基因23个,下调≥2倍基因45个；LPS组与对照组相比较(Ⅲ/Ⅰ)上调≥2倍基因15个下调≥2倍基因47个；人参皂苷Rg1+LPS组与人参皂苷Rg1组相比(Ⅳ/Ⅱ)上调≥2倍基因35个,下调≥2倍基因15个；人参皂苷Rg1+LPS组与LPS组相比(Ⅳ/Ⅲ)上调≥2倍基因37个,下调≥2倍基因10个,在差异表达基因中,给予人参皂苷Rg1后,Erbb2和Ifi44基因在DCs呈现较高转录水平。5、从基因芯片结果中找出感兴趣的差异表达基因Erbb2和Ifi44,进一步利用半定量RT-PCR和Western blot法检测Rgl组、LPS组以及Rg1+LPS组分别处理DC后的EGFR.p44基因的转录水平及蛋白质表达水平。其中Rgl组与对照组相比,两条基因的结果条带清晰,EGFR.p44基因转录水平明显增加；Western blot法分析EGFR和p44蛋白分泌水平均上调。结论1、人参皂苷Rg1能增强卵清蛋白免疫小鼠的特异性免疫应答。2、人参皂苷Rg1不能促进未成熟树突状细胞的成熟,但能促进成熟DCs高表达I-A/I-E分子；人参皂苷Rg1能增强未成熟DCs的抗原吞噬能力；人参皂苷Rgl能促进成熟DCs的抗原提呈能力。3、人参皂苷Rg1对DCs功能基因的调控涉及到DC的迁移、抗原吞噬、处理和提呈、分泌细胞因子等各个环节,尤其是能通过EGFR-MAPK途径调控下游细胞因子IL-10的产生,从而影响T细胞的极化状态调节免疫应答。综上所述,尽管人参皂苷Rgl不能促进未成熟树突状细胞的成熟,但能增强小鼠树突状细胞的吞噬抗原、处理呈递抗原的能力并影响其产生细胞因子。上述作用可能涉及到多个靶点,通过本实验研究可以明确人参皂苷Rg1能够上调EGFR-MAPK途径调控DC功能而调节下游细胞因子IL-10的产生,从而调控免疫应答。这种作用是否是直接作用抑或是间接作用,需要进一步实验证明,下一步拟利用生物传感器或iRNA干扰技术进一步明确人参皂苷Rg1是否直接作用于EGFR分子。除此之外,我们的实验结果表明人参皂苷Rgl能辅助增强小鼠特异性免疫应答能力。本研究的实验结果证明了人参皂苷Rg1具有双向的免疫调节作用,探讨了人参皂苷Rgl作用于树突状细胞的分子机制及其发生作用的信号通路,为中医药“扶正祛邪’治疗原则以及人参的双向免疫调节作用提供实验依据,并为中医药调节免疫功能研究提供一个新的思路和方法,最终为将来人参皂苷Rg1作为临床抗肿瘤新中成药的组成成份提供明确的生物学基础和实验依据。
冯凯[8]2002年在《造血干/祖细胞的体外定向诱导分化的临床前研究》文中指出造血干细胞为人类最早发现的一种干细胞也是目前为止研究最多的一种干细胞。进入90 年代后,随着分子生物学、免疫学、细胞生物学、激光、纳米材料和电子计算机等学科和技术的高速发展,使纯化造血干/祖细胞成为现实,也为造血干/祖细胞的体外扩增、定向诱导分化、基因治疗、生物免疫治疗、建库和移植奠定了基础。造血干细胞具有自我更新和多向分化的性能特征,过去的相当长的一段时期内,造血干细胞的来源还仅限于骨髓,近几年的研究表明,人们可从脐带血及动员的外周血获得大量的造血干/祖细胞,从而为造血细胞的基础及应用研究提供充足的细胞资源。对于造血干细胞,以往研究的重点在其体外扩增以满足临床患者移植的需要。而随着对于细胞性能的更深的认识,使人们意识到可利用造血干细胞多向分化的能力,利用体外操作技术,使我们获得足够数量的需要的细胞。从而完成“体外造血”,为细胞治疗提供应用手段。脐带血中富含造血干/祖细胞,且具有来源丰富,对供者无任何影响等优点,是极具潜力的造血干细胞来源。本文利用脐带血分离出造血干/祖细胞,分别研究其在体外定向诱导分化为粒系细胞、红系细胞、巨核系细胞及树突状细胞的能力。细胞治疗的方案应考虑如下的因素:能否获得足够数量的细胞;所获得的细胞是否具有其相应的功能;体外操作所获得的细胞是否有癌变的可能。为探讨利用人造血干/祖细胞体外定向诱导分化的人粒系细胞、红系细胞、巨核系细胞及树突状细胞应用于临床的可行性,我们利用源自人胎盘脐带血的CD34~+细胞及(SCF、IL-3、IL-6 和G-CSF)、(SCF、
吴军[9]2005年在《钙离子载体在树突状细胞诱导分化中的作用及其信号机制》文中认为树突状细胞(dendritic cells,DC)是目前所知的功能最强的、唯一能激活初始(naive)T细胞的专职抗原呈递细胞(antigen presenting cell,APC),在抗原的加工提呈、抗原识别及T细胞的激活中发挥着重要的作用。因此,DC在免疫应答及其机制的研究和肿瘤及病毒感染等的免疫治疗中处于极重要地位。在体外,单核细胞(monocytes,Mo)、CD34~+造血干细胞(haemopoietic progenitor cells,HPC)及某些髓系白血病细胞可以被多种细胞因子诱导而获得DC的某些免疫表型和功能,并建立了组合性细胞因子(如GM-CSF、IL-4、TNF-α和SCF等)体外扩增培养DC的方法。本课题先对常规的组合性细胞因子诱导DC的表面标志与功能进行了研究,在此基础上,探索了钙离子载体在诱导Mo、HPC及急性白血病细胞向DC分化中的作用及其信号机制。 成熟DC除了具有典型树突状细胞的形态外,还必须特征性高表达与抗原提呈有关的MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ类分子,高水平表达多种共刺激分子B7—1/CD80、B7-2/CD86及DC的特征性表面标志CD83分子,以及明显刺激T细胞增殖等功能。在实验中我们发现,Mo在GM-CSF和IL-4存在条件下4天内开始发生DC的形态改变,但继续培养10天并给予TNF-α刺激后,这些具有典型DC形态的细胞其表面共刺激分子的上调及CD14分子的下调表达水平不均一,DC的成熟标志CD83分子表达缺乏。在CD34~+HPC的诱导分化中,第一周给予GM-CSF、TNF-α和SCF培养,可将细胞总数扩增113±29(n=5)倍,第二周给予GM-CSF、IL-4和TNF-α继续培养,许多有核细胞获得DC的形态及特征性表面标志,包括高水平表达HLA-DR、CD40、CD86和细胞间黏附分子CD54分子等,但细胞表面共刺激分子B7-1/CD80及DC的特征性成熟标志CD83分子的表达仍很弱。另外,上述组合性细胞因子培养获得的DC除了表面共刺激分子、黏附分子及某
陈东晓[10]2005年在《负载HPV16E6/18E7基因树突状细胞疫苗的构建及其抗食管癌细胞的体外实验》文中研究说明目的:1、用脐血CD34+细胞在rhGM-CSF、rhTNF-α诱导下体外分化扩增树突状细胞(Dendritic Cell,DC),检测其表面分子CD83的表达以及对T淋巴细胞增殖的影响。2、提取HPV16E6/18E7质粒,并将之转染树突细胞,构建负载HPV16E6/18E7基因的树突状细胞疫苗,检测其目的基因的表达及活化T淋巴细胞的作用。3、测定食管癌细胞EC-109的HPV类型,将负载HPV18E7基因的树突状细胞在体外行抗食管癌实验:观察E7-DC疫苗与T淋巴细胞作用,检测活化后CTL抗肿瘤的细胞毒活力。
参考文献：
[1]. 小鼠骨髓不成熟DC的体外扩增、鉴定及抗成熟特性的研究[D]. 王强. 第叁军医大学. 2003
[2]. 人外周血未成熟树突状细胞体外扩增、鉴定及抗成熟特性的研究[D]. 姜艳. 第叁军医大学. 2005
[3]. 不同转染方式对人脐带血来源未成熟树突状细胞成熟特性的影响[D]. 王永权. 第叁军医大学. 2006
[4]. 间充质干细胞对系统性红斑狼疮的免疫调节作用[D]. 裘影影. 江苏大学. 2008
[5]. TGFβ1基因转染大鼠树突状细胞增强移植心脏耐受性及相关趋化因子表达的研究[D]. 张新华. 复旦大学. 2003
[6]. 细胞因子IL-2，15联合自体DCs对人外周血来源的NK细胞体外扩增及功能影响的研究[D]. 李晓红. 中国人民解放军军医进修学院. 2010
[7]. 人参皂苷Rg1对树突状细胞效应与分子机制的研究[D]. 周英武. 北京中医药大学. 2011
[8]. 造血干/祖细胞的体外定向诱导分化的临床前研究[D]. 冯凯. 中国人民解放军军事医学科学院. 2002
[9]. 钙离子载体在树突状细胞诱导分化中的作用及其信号机制[D]. 吴军. 第一军医大学. 2005
[10]. 负载HPV16E6/18E7基因树突状细胞疫苗的构建及其抗食管癌细胞的体外实验[D]. 陈东晓. 汕头大学. 2005
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