雷晓华[1]2008年在《小鼠2，4细胞期胚胎冷冻及冻后发育的研究》文中研究说明哺乳动物胚胎的冷冻保存对胚胎生物学和胚胎毒性学的发展,尤其对生物资源保护以及人类辅助生殖等的研究具有重要的作用。本试验目的在于选用合适的冷冻保护剂对小鼠2-细胞和4-细胞期胚胎进行冷冻保存,并对解冻后胚胎的细胞形态特征,体外发育情况和损伤机理进行研究。另外,通过优化冷冻方法和胚胎培养条件建立一种适宜小鼠2-细胞及4-细胞胚胎冷冻保存程序及解冻后体外发育体系。为正在进行的空间小鼠胚胎生物学研究提供充足的实验材料,同时也为冷冻生物学基础研究提供一些理论依据和参考。为了筛选小鼠2–细胞胚胎适合的冷冻保护剂,比较了1,2-丙二醇(1, 2-propanediol,PROH)、甘油(glycerol,GLY)、乙二醇(ethylene glycol, ETG)和二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)4种冷冻保护剂对小鼠2-细胞胚胎的渗透性和毒性。结果显示1.5 mol/L的1,2-丙二醇、乙二醇和二甲基亚砜冷冻保护剂对2-细胞胚胎的渗透性显着高于甘油保护剂;1.5 mol/L的乙二醇、1,2-丙二醇和甘油保护剂对胚胎的毒性显着地低于二甲基亚砜,综合渗透性和毒性结果得出乙二醇和1,2-丙二醇适合于小鼠2-细胞胚胎冷冻保存。采用两步平衡快速冷冻法对胚胎进行冷冻保存,进一步比较PROH和ETG对2-细胞期小鼠胚胎冷冻的冷冻效果及体外发育情况。结果表明:采用PROH进行胚胎冷冻,解冻后胚胎4-细胞发育率和囊胚发育率极显着地高于ETG组(分别为82.7% vs. 64.6%; 61.2% vs. 29.1%, P<0.01);囊胚移植结果表明冷冻胚能够产生正常的后代,但PROH组和ETG组妊娠产仔率无统计学差异(32.4% vs. 32.2%和26.9% vs. 23.5%, P>0.05)。另外,通过对冷冻试验组胚胎进行细胞骨架微丝的检测,结果表明ETG组2-细胞胚胎细胞骨架损伤比例显着地高于PROH组是其体外发育存在差异的主要原因。结论为PROH对2-细胞期小鼠胚胎冷冻的冷冻效果要显着地优于ETG。胚胎冷冻和解冻不可避免的会对细胞造成一定的损伤。为了进一步分析2-细胞胚胎冷冻损伤的机理,探讨引起胚胎解冻后发育停滞的原因,本试验从细胞膜完整性,细胞骨架结构改变,细胞内线粒体分布和代谢以及细胞凋亡这几个方面的检测来探讨胚胎冻存后发育阻滞的机理。结果表明即使细胞膜和细胞骨架都完整的胚胎仍然会发生发育阻滞,而造成此类胚胎发育阻滞的主要原因是由于细胞内线粒体受到破坏,细胞的代谢功能和细胞呼吸功能受阻,从而诱导细胞发生凋亡。冷冻损伤还可能会影响胚胎自分泌一些激素和因子的能力,进而影响胚胎的体外发育,因此优化冷冻胚胎体外培养的条件,提高胚胎体外发育的研究变得非常重要。本研究利用快速冷冻法对小鼠4-细胞胚胎进行冷冻保存,解冻后在胚胎培养液中添加10 ng/mL的表皮生长因子(EGF),通过叁组平行对照比较来评价胚胎体外的发育情况。结果显示:解冻后的胚胎在添加EGF后囊胚发育率及孵化率(分别为:82.4%和61.3%)要极显着地高于(P<0.01)不添加EGF组冷冻胚胎(分别为:68.9%和40.3%),与新鲜对照组比较差异不显着;添加EGF组囊胚的细胞总数(64.2±6.5)显着地要高于不添加EGF组囊胚细胞总数(52.3±11.6)(P<0.05)。另外,研究发现EGF发挥的作用主要是通过与细胞膜上EGFR结合共同发挥的,EGFR表达在8-细胞时期才开始出现。本研究结果表明胚胎解冻后在培养基中添加10 ng/mL的EGF可以显着改善其体外发育的能力。综上所述,在小鼠2-细胞胚胎研究中,筛选出1,2-丙二醇是小鼠2-细胞胚胎最佳的冷冻保护剂,解冻后2-细胞胚胎冷冻损伤主要是由于胚胎的线粒体受损从而诱导细胞发生凋亡,造成胚胎发生阻滞。4-细胞胚胎冷冻保存研究中,在胚胎培养基中添加10 ng/mL的EGF能够显着地提高冷冻胚胎体外培养的囊胚发育率、孵化率,而这种作用是从8-细胞/早期桑椹胚时期才开始发挥的。
李伟[2]2016年在《小鼠早期卵裂胚胎玻璃化冷冻与批量冻存技术研究》文中研究说明随着玻璃化冷冻技术的不断进步,玻璃化冷冻保存哺乳动物胚胎的效率越来越高。现有的玻璃化冷冻技术在保存哺乳动物早期胚胎时依旧存在很多问题,如冷冻效率不高,存在潜在的冷冻损伤等。本研究在已有的尼龙网玻璃化冷冻法的基础上,对小鼠早期卵裂阶段胚胎的玻璃化冷冻保存技术进行进一步优化,进行小鼠2-细胞胚胎的玻璃化冷冻保存研究,并进行大规模的批量化冻存小鼠2-细胞胚胎样本的探索,使每片尼龙网上冷冻保存的小鼠2-细胞胚胎达到100枚左右,以满足哺乳动物胚胎空间发育试验对早期卵裂阶段胚胎的批量需求。将玻璃化冷冻的小鼠2-细胞胚胎批量冻存／解冻后,再在实验室已经建立的密闭培养体系(地面模拟空间胚胎发育试验的培养条件)下培养,与新鲜胚胎密闭培养的结果进行综合比较,评估批量玻璃化冷冻的小鼠2-细胞胚胎的发育能力,探讨其是否可以满足哺乳动物空间胚胎发育试验的需要。为了更准确的评估批量玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎的质量,本研究还从胚胎细胞膜完整性、细胞骨架、线粒体分布、水通道蛋白的表达与分布等方面,探讨导致玻璃化冷冻小鼠2-细胞胚胎体外发育率降低的原因。研究内容和结果如下：1.采用尼龙网玻璃化冷冻法,以EFS40作为玻璃化冷冻保护液——包含乙二醇(ethylene glycol,EG) (V/V) 40%,蔗糖(sucrose) 0.5 M和聚蔗糖(Ficoll 70) (W/V)25%,小鼠2-细胞胚胎在玻璃化冷冻保护液液中处理后,迅速加载到尼龙网上,然后浸没于装有液氮的冻存管中,置于液氮罐中冻存,每片尼龙网上加载约100枚胚胎。解冻时依次在0.5 M,0.25 M,0.125 M,0M的蔗糖溶液中处理,每个浓度的蔗糖溶液中平衡5 min,快速地脱除冷冻保护剂。解冻后小鼠2-细胞存活率为96.22±2.74%(1791/1857),其中完整胚胎(intact embryos, IEs)约占89.88±4.32%(1669/1857),部分完整胚胎(partial embryos, PEs)约占6.95±3.44%(122/1857)。因此,本研究采用的玻璃化冷冻方法可以用于批量冻存并获得批量存活的小鼠2-细胞阶段冷冻胚胎。2.小鼠2-细胞胚胎解冻后,将存活胚胎在常规微滴条件和密闭培养条件下体外培养,结果显示：玻璃化冷冻胚胎在不同培养体系条件下培养72 h、96h囊胚发育率,96h囊胚孵化率均低于新鲜胚胎组。其中玻璃化冷冻胚胎-密闭培养组的2-细胞胚胎培养72 h的囊胚发育率(90.86±1.43%)低于新鲜胚胎-密闭培养组(94.10±0.89%),但差异不显着；玻璃化冷冻胚胎-密闭培养组的2-细胞胚胎培养96h的囊胚发育率和囊胚孵化率(91.38±0.29%,32.02±2.30%)显着低于新鲜胚胎-密闭培养组(93.72±0.95%,39.02±2.99%)(P<0.05)。囊胚细胞计数结果显示,新鲜2-细胞胚胎体外培养72 h和96h后,囊胚细胞数与玻璃化冷冻胚胎体外发育到囊胚的细胞数之间差异不显着(P>0.05)。密闭培养的囊胚细胞数与常规微滴培养囊胚细胞数之间也无显着差异(P>0.05)。结果表明,玻璃化冷冻的小鼠2-细胞胚胎能够在密闭培养条件下正常发育到囊胚阶段,冷冻胚胎能够满足空间胚胎发育试验要求。3.尼龙网玻璃化冷冻的早期卵裂阶段小鼠胚胎体外发育率降低,可能是由于玻璃化冷冻-解冻过程对胚胎细胞造成了潜在损伤。因此,本研究从细胞膜完整性,细胞骨架,线粒体分布叁个方面分析玻璃化冷冻-解冻过程对胚胎细胞造成的损伤。结果表明,相比于新鲜2-细胞胚胎,玻璃化冷冻-解冻的小鼠2-细胞胚胎细胞膜完整性未受到明显影响。冷冻-解冻后的胚胎,微丝骨架发生了变化,并且这种变化未能在体外培养中短时间恢复,但随着胚胎发育的进行,微丝骨架逐步得到恢复,微丝分布与新鲜胚胎基本一致；冷冻-解冻后的胚胎中纺锤体未见明显异常,与新鲜胚胎中的纺锤体形态结构一致。使用罗丹明123(Rhodamine123)检测冷冻-解冻胚胎线粒体分布时发现,部分解冻后的胚胎线粒体分布发生变化,在胚胎细胞的胞质中散乱分布,呈现无规则聚集状态；而新鲜胚胎中,线粒体均匀分布于胚胎细胞的胞质中,在细胞核周围呈现环绕聚集。这些结果证明,线粒体分布变化可能是导致胚胎发育率降低的主要原因,并因此推测早期卵裂阶段胚胎玻璃化冷冻-解冻过程可能导致胚胎细胞线粒体功能异常。4.为了进一步探讨卵裂阶段小鼠胚胎的玻璃化冷冻是否造成胚胎的其他损伤,本研究检测了小鼠2-细胞胚胎玻璃化冷冻前后水通道蛋白3(aquaporin3, AQP3)和水通道蛋白7(aquaporin7, AQP7)在胚胎细胞的分布与表达。RT-PCR (reverse transcription-polymerase chain reaction)检测结果显示,小鼠2-细胞胚胎玻璃化冷冻前后均表达AQP3和AQP7基因。qRT-PCR (quantitative real time polymerase chain reaction)结果显示,玻璃化冷冻-解冻的小鼠2-细胞胚胎中AQP3 mRNA和AQP7 mRNA相对表达量相比于新鲜胚胎的表达量之间没有显着性差异(P<0.05)。免疫荧光检测结果显示,玻璃化冷冻前后小鼠胚胎AQP3蛋白主要分布于细胞质、细胞膜、核膜,这与新鲜2-细胞胚胎AQP3蛋白分布情况一致；AQP7蛋白主要分布在细胞质、细胞膜,玻璃化冷冻前后AQP7的分布未发生明显变化。蛋白质免疫印迹(Western Blot)结果也验证了上述结果,这两种水通道蛋白在蛋白质水平表达量未受到玻璃化冷冻-解冻的影响。
刘伟信[3]2006年在《胚胎冷冻保存技术应用研究》文中研究表明近几十年来，辅助生育技术得到了快速发展，已经成为治疗不孕不育症的重要手段之一。胚胎冷冻技术在人类辅助生育技术中具有重要作用。通过胚胎冷冻保存，可以增加进行体外受精-胚胎移植妇女的妊娠机会；有利于临床上控制移植的胚胎数，从而减少多胎妊娠；可以根据患者具体情况选择移植时间，减少严重卵巢过度刺激综合征；可以避免多余胚胎的浪费，减少治疗费用。长期以来，提高冷冻胚胎的存活率和发育潜力一直研究者们关注的热点。本课题采用细胞培养、胚胎冷冻技术、激光辅助孵化、显微操作技术、激光共聚焦显微技术进行以下几个方面研究：不同冷冻保护剂冷冻早期胚胎的效果；不同冷冻方式冷冻早期胚胎的效果；激光辅助孵化结合显微操作去除冷冻胚胎坏死细胞对其发育潜力的影响；胚胎冷冻对小鼠胚胎细胞骨架结构的影响。结果如下：采用慢速冷冻方式冷冻2～8-细胞小鼠胚胎，胚胎解冻后，以丙二醇作冷冻保护剂的胚胎存活率、囊胚形成率和囊胚孵出率显着高于以二甲基亚砜、甘油分别作冷冻保护剂的结果(P＜0.05)；但与以乙二醇作冷冻保护剂的结果相比没有显着差异(P＞0.05)。以二甲基亚砜、甘油和乙二醇3种冷冻保护剂分别冷冻2～8-细胞小鼠胚胎，解冻后胚胎存活率、囊胚形成率和囊胚孵出率没有显着差异(P＞0.05)。采用玻璃化冷冻仪冷冻小鼠2～8-细胞胚胎时，解冻后胚胎存活率、囊胚形成率和囊胚孵出率，以乙二醇作冷冻保护剂的结果显着高于以丙二醇、二甲基亚砜和甘油分别作冷冻保护剂的结果(P＜0.05)，以丙二醇、二甲基亚砜和甘油3种冷冻保护剂分别冷冻2～8-细胞小鼠胚胎，解冻后胚胎存活率、囊胚形成率和囊胚孵出率没有显着差异(P＞0.05)。以乙二醇作冷冻保护剂采用Vit-Master玻璃化冷冻方式冷冻小鼠2～8-细胞胚胎的胚胎存活率、囊胚形成率和囊胚孵出率，与以丙二醇作冷冻保护剂采用慢速冷冻-快速解冻方式冷冻小鼠2～8-细胞胚胎的结果没有显着性差异(P＞0.05)。小鼠冷冻胚胎解冻后，细胞完整的冷冻胚胎采用激光辅助孵化与未采用激光辅助孵化的囊胚形成率(分别为71.95％和70.11％)没有显着差异(P＞0.05)，但采用激光辅助孵化的囊胚孵出率(63.41％)却显着高于未采用激光辅助孵化的胚胎(48.28％)(P＜0.05)。卵裂球细胞完整的胚胎的囊胚形成率(71.95％)和囊胚孵出率(63.41％)显着高于部分卵裂球细胞损伤的胚胎(分别为52.94％和41.18％)(P＜0.05)。在部分细胞损伤的冷冻胚胎中，采用激光辅助孵化结合显微操作去除坏死细胞与对照组相比，其囊胚形成率(分别为52.94％和32.00％)和囊胚孵出率(分别为41.18％和22.00％)均得到了显着的提高(P＜0.05)。在回顾性分析成都市计划生育技术指导所人类冷冻胚胎移植周期中，对冷冻胚胎进行激光辅助孵化的患者的临床妊娠率(24.00％)和胚胎植入率(10.29％)，与没有进行激光辅助孵化的患者的临床妊娠率(22.22％)和胚胎植入率(10.17％)相比没有显着差异(P＞0.05)。同时移植细胞完整和部分细胞损伤冷冻胚胎的临床妊娠率(22.22％)和胚胎植入率(10.17％)显着高于仅移植部分细胞损伤的冷冻胚胎临床妊娠率(5.88％)和胚胎植入率(2.82％)(P＜0.05)。采用激光辅助孵化结合显微操作去除冷冻胚胎的坏死细胞碎片后，冷冻胚胎移植的临床妊娠率(43.90％)和胚胎植入率(19.44％)显着高于没有去除冷冻胚胎坏死细胞碎片的临床妊娠率(24.00％)和胚胎植入率(10.29％)(P＜0.05)。用抗骨架蛋白actin的单克隆抗体分别对冷冻前、后小鼠2-细胞和4-细胞胚胎进行免疫染色，激光共聚焦显微镜观察。荧光强度定量分析表明小鼠2-细胞冷冻胚胎的荧光强度(169.67±8.50)与未冷冻胚胎的荧光强度(180.83±9.06)相比，没有显着性差异(P＞0.05)；小鼠4-细胞冷冻胚胎的荧光强度(175.43±11.50)与未冷冻4-细胞胚胎的荧光强度(162.67±10.41)相比，也没有显着性差异(P＞0.05)。提示冷冻对小鼠早期胚胎的细胞骨架结构没有明显影响。上述结果表明，采用慢速冷冻-快速解冻方式冷冻小鼠2～8-细胞胚胎，以丙二醇作冷冻保护剂较为理想；采用Vit-Master玻璃化冷冻小鼠2～8-细胞胚胎，乙二醇作冷冻保护剂最为理想，而且该方式有可能成为慢速冷冻-快速解冻的替代方法；激光辅助孵化可提高小鼠冷冻胚胎的孵化能力；激光辅助孵化结合显微操作去除冷冻胚胎的坏死细胞，可提高小鼠冷冻胚胎的发育潜力和人类冷冻胚胎移植的临床妊娠率和胚胎植入率；冷冻对小鼠2-细胞和4-细胞胚胎的细胞骨架结构没有明显影响。本研究将为胚胎冷冻保存技术的临床应用提供有价值的实验依据。
黄馨[4]2006年在《不同冷冻方法建立小鼠胚胎库的研究与应用》文中提出实验小鼠冷冻胚胎库的建立主要包括冷冻技术路线的建立、冷冻胚胎遗传质量的检测和数据的记录、统计叁个部分。 1．在建立冷冻技术路线部分，对胚胎收集的超排方案作了优化实验。在雌鼠的年龄与体重、激素注射时间等因素不变的条件下，我们选择了2.5IU、5.0IU、7.5IU叁个剂量组的激素PMSG、HCG进行超数排卵，对近交系小鼠C57、129／J分别实验。结果表明：C57BL／6小鼠5.0IU剂量组平均取卵数明显高于2.5IU剂量组和7.5IU剂量组(P＜0.05)；129／J小鼠7.5IU剂量组平均取卵数明显高于其他剂量组(P＜0.01)。 体外培养小鼠着床前胚胎实验，选取常用的M16、CZB、KSOM培养液，在37℃、5％CO2条件下对封闭群ICR小鼠的合子进行体外培养至囊胚阶段，结果表明：KSOM培养液的囊胚发育率最高，与CZB培养液的结果相比有极显着差异(P＜0.01)，与M16培养液的结果相比也有显着性差异(P＜0.05)，但是M16培养液与CZB培养液的结果相比差异不显着(P＞0.05)。 为探讨不同冷冻方法对胚胎冷冻结果的影响，选用慢速冷冻法、玻璃化冷冻法(EFS40，麦管)和OPS冷冻法对ICR小鼠和C57小鼠的桑椹胚和囊胚进行冷冻比较；选用玻璃化冷冻法(EFS40，麦管)和玻璃化冷冻法(DAP213，冷冻管)对C57小鼠的8-cell阶段胚胎进行冷冻比较；选用快速冷冻法(PROH，麦管)对C57小鼠的2-cell
肖宇[5]2008年在《玻璃化冷冻保存对体外成熟猪卵母细胞与胚胎DNA的影响》文中研究表明卵母细胞和胚胎冷冻保存是一种有效保护动物遗传资源的方法。利用简便快速的玻璃化冷冻保存技术,可以建立雌性动物基因库、保存珍稀生物资源,为其保护和保存提供了不受时间和地域限制的新途径。本研究以废弃猪卵巢内的卵母细胞为材料。通过玻璃化冷冻技术保存体外成熟培养、体外受精获得的成熟卵细胞和囊胚。使用单细胞凝胶电泳(SCGE)方法和连接介导PCR(LMPCR)技术检测冷冻前后卵母细胞和囊胚的DNA损伤情况。旨在建立一套完善的猪卵母细胞冷冻保存体系和DNA损伤评估方法。为卵母细胞玻璃化冷冻保存和冷冻损伤等研究提供理论依据和实验材料。通过阶段性试验研究,得出结论如下:1.玻璃化冷冻保护剂对体外成熟猪卵母细胞DNA的影响以EDFS40为冷冻保护剂平衡冷冻前体外成熟猪卵母细胞。采用细胞形态观察和单细胞凝胶电泳(彗星电泳)方法检测玻璃化冷冻保护剂对细胞DNA的损伤情况。结果显示:保护剂处理组,细胞形态正常率和DNA异常率分别为63.36%、42.06%;同无保护剂处理对照组84.51%、12.28%的差异显着(P<0.05)。表明冷冻保护剂对猪卵母细胞DNA有一定影响;以彗星电泳检测和CASP软件分析保护剂处理对体外成熟猪卵母细胞的毒性作用。保护剂处理组TailDNA%与HeadDNA%的比值相对较高,表明DNA损伤较高。而在OTM值比较中,保护剂处理组斜率比对照组更大。说明冷冻保护剂对猪卵母细胞DNA有明显细胞毒性作用。2.玻璃化冷冻保存对猪卵母细胞DNA的影响采用EDFS40为保护剂微管法玻璃化冷冻保存体外成熟猪卵母细胞。设EDFS40处理组为对照,检测玻璃化冷冻保存过程对卵母细胞的细胞毒性及DNA损伤作用。冷冻组进行细胞形态检测及DNA异常率为63.36%和42.06%,而对照组为59.02%和25.76%。说明冷冻保存对细胞形态和DNA均有一定的影响。对处理组细胞进行彗星电泳检测分析,通过CASP软件分析所得数据得出冷冻组比保护剂处理组的OTM值较大,表明总体DNA较保护剂处理有明显损伤。运用连接介导PCR技术,对细胞基因组中定位特定p53基因进行断裂检测。结果显示:冷冻组的基因扩增有明显的条带,与预计的片段大小相符。而对照组无处理卵母细胞扩增却很少片段产生,初步确认为冷冻造成p53基因损伤断裂。3.玻璃化冷冻和保护剂对猪囊胚细胞DNA的毒性试验以冷冻效果较好的EDFS40保护剂玻璃化冻存猪囊胚细胞。采用形态评估和彗星电泳方法检测囊胚的形态变化及DNA的损伤情况。目的在于探讨玻璃化冷冻保护剂对囊胚的化学毒性作用和冷冻过程对其DNA的影响。结果显示:经保护剂处理和冷冻的囊胚形态正常率为56.46%和35.84%,有较多出现皱缩和细胞塌陷现象。冷冻组囊胚存活率为25%与对照组44.44%有较大差异(P<0.05)。彗星电泳检测结果:保护剂处理组囊胚DNA异常率为53.45%,冷冻组DNA异常率为79.14%,差异显着(P<0.05)。CASP软件分析得出:冷冻组、处理组和未处理组的OTM值有明显区别,曲线斜率越大,DNA损伤程度越大。实验表明保护剂处理和冷冻过程对囊胚DNA均有较大的影响。
张蔚, 曹炀, 白照岱, 陈振文[6]2011年在《不同玻璃化冷冻保护剂对早卵裂期小鼠胚胎生存发育的影响》文中认为目的评价四种玻璃化冷冻保护剂冷冻早卵裂期胚胎效果,以及复苏后胚胎的存活率及体外继续发育能力。方法以小鼠为实验动物,采用玻璃化冷冻方法,比较观察EFS30,EFS40,EDFS30和EDFS40四种玻璃化冷冻溶液对小鼠4-细胞胚胎冷冻解冻后胚胎的存活率和囊胚形成率的影响。结果 EDFS30溶液冷冻小鼠4-细胞胚胎,解冻后胚胎存活率为82.9%,囊胚形成率为48.3%,而其它叁种玻璃化冷冻溶液的胚胎存活率和囊胚形成率分别是:EFS30为65.8%和34.3%;EFS40为64.7%和31.2%;EDFS40为68.3%和37.8%。EDFS30的冷冻效果显着高于其它叁种玻璃化冷冻溶液(P<0.05)。结论 EDFS30是一种冷冻早卵裂期小鼠胚胎有效的玻璃化冷冻保护剂。
庄丽伟[7]2008年在《小鼠和贵州香猪胚胎玻璃化冷冻保存相关技术研究》文中认为为了解决我国动物遗传资源急速衰减及挽救濒危品种提供了新的思路和方法为胚胎冷冻提供研究方法。本实验对小鼠胚胎玻璃冷冻保存及相关技术进行了系统的研究,具体内容包括:荧光双色法检测冷冻前后小鼠胚胎活力;不同冷冻方法及冷冻保存时间对胚胎发育率的影响;冷冻后胚胎细胞损伤检测,并在其基础上对贵州地方猪种剑白香猪胚胎玻璃化冷冻技术进行初步了的探索。试验结果如下:荧光物质FDA和PI能对不同活力胚胎进行标记,且在一定浓度范围内FDA对胚胎无毒副作用,PI对透明带完整的胚胎也无毒副作用。胚胎冷冻效果好坏主要取决于玻璃化冷冻液,当玻璃化冷冻液对胚胎有很好的冷冻保护时,承载工具对胚胎冷冻效果影响不大,当玻璃化冷冻液对胚胎冷冻保护效果稍差时,承载工具的优越性才得以体现。但是,胚胎冷冻对小鼠桑葚胚的细胞膜的完整性、细胞内酯酶活性及线粒体分布功能均有影响,只是冷冻效果好的冷冻方法对细胞膜的完整性、细胞内酯酶活性及线粒体分布的影响小。同时以25%Gly+25%EG+50%mCZB为胚胎冷冻保护剂,采用细管法冷冻小鼠桑葚胚,在-196℃冷冻保存1天、10天、20天和30天解冻后对胚胎的发育率没有影响。基于上述研究本实验得出较为优化的小鼠桑葚胚冷冻方法是以玻璃化冷冻液(25%Gly+25%EG+50%mCZB)作为冷冻保护剂的细管法。以10%EG+10%DMSO+0.6M(蔗糖)(基础液为M199)为玻璃化冷冻液,采用离心+CB处理胚内脂肪后冷冻和直接冷冻两种方法冷冻贵州剑白香猪4—细胞胚胎,解冻后胚胎存活率都很高,与鲜胚对照组差异不显着。
朱晓芳[8]2010年在《鼠胚胎外发生试验及IVF实验室装修材料的影响》文中认为人类体外受精-胚胎移植( In-vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)的受精率、卵裂率、囊胚形成率及临床妊娠率低下一直困扰着该领域研究者。IVF实验室的化学污染问题被认为是主要原因之一。化学污染主要来源于挥发性有机化合物(Volatile Organic Compounds,VOCs)的排放。VOCs主要由IVF实验室器材、墙壁涂料、胶剂、地板及层流设备材料等排放。在IVF实验室装修时,尽量减少化工材料的使用,选择排放VOCs低的设备及材料,可以最大程度优化IVF实验室环境。配子或胚胎的冷冻/解冻方法及辅助孵出方法也会影响到受精率、卵裂率、囊胚形成率及临床妊娠率。玻璃化冷冻/解冻及激光辅助孵出技术与其它冻存方法和辅助孵出方法比较更有优越性。为验证IVF实验室装修后的环境质量及玻璃化冷冻、激光辅助孵出技术对受精率、卵裂率、囊胚形成率的影响,分别在IVF实验室建立3个月和建立1年后进行了一系列的鼠胚试验,包括小鼠超排、配子与胚胎体外发生试验、鼠胚玻璃化冷冻、解冻及辅助孵出等试验。试验所获得的受精率、卵裂率、优质胚胎率、囊胚率及囊胚孵出率与各文献报道结果一致,甚至优于文献报道结果。装修3个月和1年后鼠胚试验结果相比较,未发现明显差异,P>0.05。此结果提示VOCs排放的减少,玻璃化冻融及激光辅助孵出技术的应用,可以提高受精率、卵裂率、优质胚胎率、嚢胚率及胚胎孵出率，对IVF-ET临床结局意义重大。研究目的:验证通过改善IVF实验室的装修材料可以有效减少VOCs的释放,为配子及胚胎提供更加安全无毒的培养环境,有利于配子及胚胎的体外发育;观察玻璃化冷冻/解冻及激光辅助孵出技术对胚胎冻存和孵出效果。研究方法:本研究包括以下几部分:1.小鼠超排卵及配子与胚胎的体外发生:第一天下午5:00给雌鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG )10IU/只(0.1ml),第叁天下午5:00注射促性腺激素(HCG )10IU/只(0.1ml)。雌鼠注射HCG 12~13h后人性化处死雄鼠,获得精子并使之获能。注射HCG 13~14h后,人性化处死雌鼠,获得卵子。将获能精子加入培养箱中放有卵子的培养皿中。加精4-6小时后观察受精情况,后每24h观察卵裂率、囊胚形成率。2.8细胞期鼠胚(d2.5)的获得:第一天12:00给雌鼠腹腔注射PMSG 10IU/只(0.1ml)。第叁天中午11:00给雌鼠腹腔注射HCG 10IU/只(0.1ml)。注射HCG当日下午5:00一对一与公鼠合笼。次晨检查阴道栓子情况,见栓记为受精d0.5。第六天上午人性化处死雌鼠,获得d2.5鼠胚。3.玻璃化冷冻:将d2.5鼠胚移入玻璃化冷冻液1液约5~7分钟,后移入玻璃化冷冻液2液,随后装载到冷冻载杆上,将载杆投入液氮。4.玻璃化解冻:3001皿中加入解冻液1,五孔板中加入解冻液2、3、4,将装有胚胎的载杆迅速放入解冻液1,停留1分钟,随之放入解冻液2、3、4液中,分别停留时间为3、5、5分钟,最后移入囊胚微滴中进行形态学观察。5.激光辅助孵出:解冻d2.5天胚胎,将胚胎放置在HEPES液中,在卵周间隙较大的透明带部位3点钟位置行激光光束打孔。打孔后培养到d5天,观察囊胚孵出情况。结果:1.IVF实验室装修完成3个月,平均受精率84.0%,平均卵裂率96.2%,平均优质胚胎率97.3%,平均囊胚形成率96.1%,平均囊胚孵出率93.1%;IVF实验室装修完成1年,平均受精率87.4%,平均卵裂率92.8%,平均优质胚胎率98.7%,平均囊胚形成率97.4%,平均囊胚孵出率93.3%。2.玻璃化冷冻/解冻及辅助孵出:IVF实验室装修完成3个月,优质胚胎率94.1%,囊胚发育率94.1%,孵出率为100%;IVF实验室装修完成1年,优质胚胎率为100%,囊胚发育率为100%,孵出率为100%。结论:1.VOCs是IVF实验室环境污染的主要成分,主要来源于IVF实验室装修材料。IVF实验室装修3月与1年鼠胚体外发生试验结果比较,在受精率、卵裂率、优质胚胎率、囊胚率及孵出率未发现明显差异,进一步说明使用环保标准高的装修材料,减少化工材料的使用,可有效降低IVF实验室VOCs的含量,为配子及胚胎的体外培养及发育提供一个安全、无毒的培养环境,对IVF结局意义重大。2.玻璃化冷冻/解冻及激光辅助孵出技术有利于提高胚胎冻存复苏后优质胚胎率和激光打孔后胚胎孵出率。
毕爱华[9]2006年在《囊胚冷冻及冻融过程对人类囊胚超微结构影响研究》文中进行了进一步梳理目的 (1)通过小鼠囊胚冷冻实验，探讨不同的冷冻方法对小鼠囊胚冷冻效果的影响；通过小鼠囊胚的玻璃化冷冻实验，探讨用半麦管为载体，冷冻液中添加高浓度的血清对提高玻璃化冷冻效果的价值；观察小鼠囊胚玻璃化冷冻前用激光行辅助皱缩对囊胚冻融效果的影响；观察小鼠囊胚玻璃化冻融后对囊胚发育能力及着床能力的影响；(2)通过人囊胚的冷冻实验，比较不同的冷冻方法对人囊胚冻存效果的影响；通过透射电镜对冻融后人囊胚超微结构的观察，了解冻融过程对人囊胚超微结构的影响，为以后人类辅助生殖技术中冷冻方法的改进提供实验依据。 方法 (1)用清洁级成年健康ICR小白鼠，雌鼠90只，雄鼠30只为实验对象，获取小鼠囊胚，慢速程序冷冻或用半麦管、平皿为载体行玻璃化冷冻，冻融后的鼠囊胚做体内移植，观察产仔情况；观察激光辅助皱缩对扩张期鼠囊胚玻璃化冷冻的影响；(2)获取体外受精-胚胎移植患者多精或质量差胚胎，继续培养使其发育成囊胚，随机分成玻璃化冷冻组和慢速程序冷冻组，观察不同冷冻方法对人囊胚冷冻效果的影响，另获取优质囊胚18枚，随机分为新鲜囊胚对照组、慢速冻融组和玻璃化冻融组，每组选取3枚胚胎固定切片，电镜观察冻融对人囊胚超微结构的影响。 结果 1．半麦管法与平皿-微滴法相比，两组胚胎解冻后囊胚回收率分别是半麦管组94.7％，平皿组95.5％；存活率半麦管组60.6％，平皿组57.8％；孵出率半麦管组37.2％，平皿组37.8％。两组比较差异无显着性(P＞0.05)；半麦管玻璃化冷冻方法与慢速程序冷冻方法相比，胚胎回收率分别为：半麦管组94.7％，程序组100％；胚胎存活率半麦管组60.6％，程序组54.3％；囊胚孵出率：半麦管组37.2％，程序组35.5％。两组相比，差异无显着性(P＞0.05)；冷冻保护液中添加高浓度
雷俊英[10]2001年在《小鼠胚胎玻璃化冷冻保存的研究》文中指出本试验系统地研究了以低毒性的乙二醇为主体，添加葡聚糖和海藻糖配制成的EDT玻璃化溶液(EDT30，EDT40)，在室温(25℃)下对小鼠体内受精的单细胞胚(受精卵)、桑椹胚和囊胚进行的一步法和二步法的玻璃化冷冻保存。目的在于为乙肝病毒表面抗原(HBsAg)转基因鼠胚胎和珍奇动物、濒危动物胚胎冷冻保存提供研究方法。 在抗冻保护剂溶液的玻璃化与脱玻璃化试验中，证明了乙二醇、葡聚糖和海藻糖配制玻璃化溶液的可行性。抗冻保护剂溶液对桑椹胚的毒性试验证明，25℃下，胚胎在葡聚糖和海藻糖溶液中平衡5-20分钟，对其体外发育无不良影响。EDT玻璃化溶液的毒性来自于乙二醇，并随着乙二醇浓度的增加和平衡时间的延长而增加。 在受精卵的玻璃化冷冻试验中，在各实验组中发育率最好的是EDT30一步法2分钟平衡组(63％)、EDT30二步法1分钟平衡组(66％)、EDT40一步法1分钟平衡组(53％)、EDT40二步法1分钟平衡组(55％)，与对照组(100％)相比有极显着差异(p<0.01)。 在桑椹胚的玻璃化冷冻试验中，各实验组中发育率最好的是EDT30一步法1分钟平衡组(93％)、EDT30二步法1分钟平衡组(94％)、EDT40一步法1分钟平衡组(92％)、EDT40二步法0.5分钟平衡组(94％)，与对照组(98％)相比无显着差异(p>0.05)。 在囊胚的玻璃化冷冻试验中，各实验组中解冻后体外培养24小时发育率最好的是EDT30一步法1分钟平衡组(90％)、EDT30二步法1分钟平衡组(91％)、EDT40一步法1分钟平衡组(91％)、EDT40二步法0.5分钟平衡组(89％)，与对照组(100％)相比无显着差异(p>0.05)；培养48小时的孵化率分别为48％、50％、49％和51％，与对照组(88-90％)相比有极显着差异(p<0.01)。 在玻璃化冷冻效果最好组胚胎的子宫移植试验中，冷冻受精卵、桑椹胚和囊胚的妊娠受体率、妊娠受体产仔率和移植受体产仔率均与对照组无明显差异(p>0.05)，表明EDT玻璃化冷冻液是低毒性、高效的，对冻胚的体内发育无不良影响。 总之，我们的研究表明，DET玻璃液冷冻方法是简单、经济而又高效的，冷冻小鼠各阶段胚胎都能获得较高的存活率，其中受精卵的EDT30二步法1分钟平衡组(66％)、桑椹胚的EDT30二步法1分钟平衡组(94％)和EDT40二步法0.5分钟平衡组(94％)、囊胚的EDT30二步法1分钟平衡组(91％)和EDT40一步法1分钟平衡组(91％)冷冻效果最好。
参考文献：
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[3]. 胚胎冷冻保存技术应用研究[D]. 刘伟信. 四川大学. 2006
[4]. 不同冷冻方法建立小鼠胚胎库的研究与应用[D]. 黄馨. 中国协和医科大学. 2006
[5]. 玻璃化冷冻保存对体外成熟猪卵母细胞与胚胎DNA的影响[D]. 肖宇. 上海交通大学. 2008
[6]. 不同玻璃化冷冻保护剂对早卵裂期小鼠胚胎生存发育的影响[J]. 张蔚, 曹炀, 白照岱, 陈振文. 实验与检验医学. 2011
[7]. 小鼠和贵州香猪胚胎玻璃化冷冻保存相关技术研究[D]. 庄丽伟. 贵州大学. 2008
[8]. 鼠胚胎外发生试验及IVF实验室装修材料的影响[D]. 朱晓芳. 汕头大学. 2010
[9]. 囊胚冷冻及冻融过程对人类囊胚超微结构影响研究[D]. 毕爱华. 安徽医科大学. 2006
[10]. 小鼠胚胎玻璃化冷冻保存的研究[D]. 雷俊英. 广西师范大学. 2001