罗意革[1]2000年在《应用TNF基因转导肿瘤浸润淋巴细胞进行肝癌基因治疗的实验研究》文中指出目的：用肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）基因转染人肝癌肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltratinglymphocyte，TIL），构建转基因TIL，进行体外抗肿瘤活性研究，并用于荷瘤裸鼠治疗，探讨转基因TIL对肝癌治疗的价值。 方法：用转基因技术将TNF-α基因导入人肝癌肿瘤浸润淋巴细胞，构建一种新型的抗肿瘤效应细胞一转基因TIL。对转基因TIL的生物学特性进行研究。用RT-PCR检测目的基因的表达，用TNF-α试剂盒检测TNF-α分泌量，用MTT法检测转基因TIL体外抗肿瘤活性，用肝癌细胞株BEL7404注射裸鼠建立裸鼠肝癌移植瘤模型，用转基因TIL进行治疗，并用TIL进行对照。 结果：转基因TIL的增殖活性与IL-2活化的TIL相似，二者具有类似的细胞增殖曲线。转基因TIL的细胞表型也未发生改变，和TIL一样具有较高的CD_8~+水平，达60％。转基因TIL仍维持较高的稳定性。TNF-α分泌量增高是基因转导后TIL最显著的改变，其表达量为370pg/5×10~5cells/24小时，而未转基因TIL的TNF-α分泌量检测结果明性。对肝癌细胞株BEL7404杀伤活性早期表现为明显的效靶比和作用时间依赖性，其杀伤活性在作用的早期无明显升高。利用转基因TIL对荷瘤裸鼠模型进行治疗，转基因TIL表现出较高的抑制肿瘤作用，对肿瘤的生成率、生长速度和转移的抑制作用等方面均具有比未转基因TIL更好的 D 效果。提示转基因TIL的抗肿瘤作用可随时间的推移和作用环境 的改变而逐渐显现。原位注射转基因TIL的抗肿瘤作用较强，尽 管异位注射治疗也具有一定的作用，但效果明显低于肿瘤原位注 射治疗。 结论：本研究结果表明转基因TIL对肝癌治疗具有较好作 用，在肝癌的临床治疗应用可能具有一定的价值。
杜标炎[2]2005年在《六味地黄丸对HSV-tk/GCV自杀基因系统治疗肿瘤的增效作用》文中认为恶性肿瘤是严重危害人类健康和生命的重大疾病。随着分子生物学的发展,基因治疗给恶性肿瘤患者带来了曙光。肿瘤的基因治疗,特别是肿瘤的自杀基因治疗,已经成为继传统的手术切除,放射治疗,化学治疗等治疗方法后一种崭新的肿瘤综合治疗措施。 自杀基因治疗由于存在旁杀伤效应的独特机制,已应用于多种肿瘤的临床治疗试验,并已观察到较好的效果。但仍有不少实验表明,单纯自杀基因治疗难以达到完全治愈肿瘤的目的。这是因为尽管应用自杀基因可消除大部分肿瘤负荷,但仍可有部分肿瘤细胞残余。因而提高自杀基因疗法的疗效以清除残余肿瘤细胞的研究成为了热点,联合治疗是其重要途径之一。由于免疫机制在自杀基因疗法旁杀伤效应中的重要作用,改善自杀基因抗肿瘤作用的炎症免疫微环境是提高自杀基因疗法疗效的重要策略。自杀基因联合免疫基因成为目前最主要的联合治疗方案之一。该方案主要是在导入自杀基因的同时导入免疫基因。但该方案存在使用病毒载体量增多、潜在毒副作用增大;操作过程复杂,成本较高;导入基因间的相互干扰,影响基因表达或长期表达等问题。 临床与实验均已证明许多中药方药具有肯定的免疫药理作用;同时中药方药有多途径、多靶点的特点,可能对旁杀伤效应的其他机制也能产生影响。中药方药还有给药方便,价格低廉,长期使用毒副作用小或无明显毒副作用等优点。将自杀基因疗法与中药方药联合应用可能是一种更可行和更有效的联合治疗方案。 本研究选择了建立最早、研究最多的单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因,并构建成逆转录病毒介导的HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统,将自杀基因疗法与最具肯定免疫药理作用的滋阴补肾代表复方六味地黄丸组成联合治疗方案,以小鼠移植性肝细胞癌和恶性黑色素瘤模型动物为治疗对象进行了初步的研究。通过研究以期探讨建立自杀基因联合中医药疗法的中西医结合肿瘤基因治疗方案的可行性。 1 材料与方法 1.1 HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建 含自杀基因的pICl9R/MCl-tk质粒由美国匹兹堡大学药理教研室Huang L.教授惠赠,广州军区总医院赵亚刚博士提供。获得质粒后转入大肠杆菌DH5α,培养扩增,提取质粒,用EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ双酶切、凝胶电泳鉴定,与原始质粒图比对确定质粒内含有tk基因;将tk基因定向克隆入逆转录病毒表达载体pLXSN,将重组pLXSN-tk质粒转入DH5α,培养扩增,提取质粒,双酶切、凝胶电泳及测序鉴定,确定重组质粒内含有tk基因;将重组逆转录病毒表达载体质粒转染病毒包装细胞PT67,用400mg/L G418筛选2周,获得抗性细胞集落(PT67/tk),在含G418的选择性培养液中扩大培养;取包装细胞PT67/tk培养上清液(内含已包装的病毒)加入NIH3T3细胞培
朴秉国[3]2011年在《表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用》文中认为本研究对具有肿瘤特异性复制和肿瘤靶向性杀伤功能的重组腺病毒Ad-HP和Ad-HT的肝癌(BEL-7402)抑制作用进行了探讨。本研究首先利用MTT染色等方法,探讨了Ad-HT和Ad-HP对体外培养的人肝癌细胞BEL-7402的抑制作用。结果表明,Ad-HT和Ad-HP均可有效抑制BEL-7402细胞的增殖,且其作用在一定条件下呈现剂量和时间依赖关系。本研究利用台盼蓝染色、AO/EB染色、Annexin V染色和DAPI染色对Ad-HT和Ad-HP抑制BEL-7402细胞的方法进行了探讨。结果表明,Ad-HT和Ad-HP均可造成BEL-7402细胞的细胞膜通透性增加、细胞核凝聚、磷脂膜外翻。虽然不同检测方法所得到结果不尽相同,但仍可推断,Ad-HT和Ad-HP能够通过诱导细胞凋亡抑制BEL-7402肿瘤细胞的增殖。本研究利用流式细胞术、Western blot等方法探讨表达NDV HN基因重组腺病毒对细胞凋亡信号转导系统内线粒体膜电位、活性氧水平和Caspase酶活性等关键控制点信号分子的影响。实验结果表明,Ad-HP和Ad-HT均可不同程度的上调BEL-7402细胞Caspase酶活性和活性氧水平,并不同程度的降低BEL-7402细胞线粒体膜电位。可以推断,表达NDV HN基因重组腺病毒通过线粒体途径诱导BEL-7402细胞发生凋亡,从而体现其对BEL-7402细胞的抑制作用。本研究利用小鼠肝癌的肺转移和实体肿瘤模型探索了Ad-HP和Ad-HT在体内的抑瘤作用。结果表明,Ad-HP和Ad-HT具有减缓肿瘤组织生长速度、延长模型动物平均生存期和刺激免疫的作用。
刘勇[4]2003年在《白细胞介素-2和白细胞介素-12联合基因治疗小鼠肝癌的实验研究》文中研究表明目 的近年来，由于受单基因疗效不足和载体转导效率低下的影响，肝癌免疫基因治疗研究受到限制，联合基因治疗成为目前肝癌生物治疗的发展趋势。大量研究表明，细胞因子IL-2和IL-12具有较好的抗瘤效应，两者通过激活自然杀伤细胞（NK）和细胞毒T淋巴细胞（CTL）发挥细胞免疫功能。为了解这两种细胞因子联合运用抗肝细胞癌效果，本研究采用质粒型真核双表达载体，通过瘤内注射“裸”DNA方法，对小鼠肝细胞癌H22皮下移植瘤动物模型进行随机对照研究。旨在探讨IL-12和IL-2双表达质粒载体组与各单细胞因子质粒载体组在基因表达、抑癌作用及增强免疫功能方面的差异，为今后进一步通过高效基因导入技术进行肝癌免疫基因治疗研究提供理论及实验依据。方 法1. 用分子克隆方法构建pDC511mIL12-hIL2、pDC511mIL12、pDC511hIL2真核表达质粒载体。2. 将各质粒载体用脂质体转染COS-7细胞，ELISA方法检测各组质粒DNA在真核细胞中表达情况。3. 淋巴母细胞增殖法（MTT法）检测mIL-12生物学活性；胸腺细胞增殖法（MTT法）检测hIL-2生物学活性。4. 小鼠肝癌H22皮下移植瘤瘤内直接注射质粒DNA 20μg后，ELISA法检测pDC511hIL2-mIL12，pDC511hIL2，pDC511mIL12，pDC511组在注射后0.5d，1d，2d，3d，5d，7d，10d，15d血清中hIL-2、mIL-12表达情况。5. 再次注射质粒DNA 20μg后，观察各组小鼠存活率、存活时间及肿瘤大小变化。6. 第二次质粒DNA注射后两周，乳酸脱氢酶（LDH）法检测各组小鼠脾脏细胞毒T淋巴细胞（CTL）活性。7. 对各实验组在质粒DNA注射前及注射后一月、两月进行瘤体组织病理学观察。8. 统计方法：各式图表均用Excel软件处理。统计处理应用SAS软件：各处理组小鼠生存期用PL法进行生存分析，瘤体体积差异比较用重复测量多因素方差分析，各组小鼠存活率用Fisher精确检验。<WP=8>结 果1. 酶切鉴定各质粒载体，均示构建成功。2. 各质粒载体在真核细胞内能表达相应细胞因子（pDC511hIL2-mIL12组：hIL2为3087.18pg/（ml·24h·106）细胞；mIL12为674.56pg/（ml·24h·106）细胞。pDC511mIL12组mIL12为504.37pg/（ml·24h·106）细胞；pDC511hIL2组hIL2为4274.19pg/（ml·24h·106）细胞。空载体pDC511未检测到两种细胞因子表达。3. pDC511hIL2-mIL12质粒DNA转染COS-7细胞后收集的培养液上清与pDC511hIL2组和pDC511mIL12组相比，在相同稀释度下，更能刺激胸腺细胞或淋巴母细胞增殖。4. pDC511hIL2-mIL12组hIL2在瘤内注射后1-7天形成一表达峰，峰值为140.85±8.88pg/ml；mIL12表达峰持续时间为1-10天，峰值为75.52±17.19pg/ml 。pDC511hIL2组hIL2在2-7天形成一表达峰，峰值为98.34±6.94pg/ml 。pDC511mIL12组mIL12在2-10天形成一表达峰，峰值为49.38±3.63pg/ml 。pDC511hIL2-mIL12组在不同时间表达的hIL-2、mIL-12分别与pDC511hIL2 (p<0.01)、pDC511mIL12 (p=0.04)比较有显著性差异。pDC511hIL2-mIL12组mIL12、hIL2峰值分别与pDC511mIL12组、pDC511hIL2组比较有显著性差异（p<0.01）。5. 对四组质粒DNA注射后不同时间测得的瘤体体积进行比较，差别有显著性意义（p=0.03）。pDC511mIL12组和pDC511hIL2组无显著性差异（p>0.05），pDC511hIL2-mIL12组分别与pDC511mIL12 、pDC511hIL2组比较有显著性差异（p<0.05）。6. pDC511hIL2-mIL12，pDC511hIL-2，pDC511mIL-12，pDC511四组生存时间差别有非常显著性意义（p=0.001）。pDC511hIL2-mIL12组、pDC511hIL2组、pDC511mIL12组分别与空载体组比较有显著性差异，结果为：p=0.0002， p=0.03， p=0.03。pDC511mIL12组与pDC511hIL2组比较生存期无差异（p=0.69）；pDC511hIL2-mIL12组与单细胞因子质粒载体组生存期比较有显著性差异（p<0.05）。质粒DNA注射后三月，各组存活率比较无显著性差异（p=0.051）：pDC511hIL2-mIL12组71.43%(5/7)；pDC511mIL-12组42.86%(3/7)；pDC511hIL-2组28.57%(2/7)。7. 在相同效：靶比情况下，pDC511hIL2-mIL12组与单表达质粒载体组和空载体组相比，小鼠脾CTL对肝癌细胞H22有较高杀伤率。单表达载体组在质粒DNA注射后一月，血管及肿瘤病灶周围有零星炎性细胞浸润，病灶内肿瘤细胞坏死明显，肿瘤细胞局限化。在质粒DNA注射后二月，<WP=9>8. 病灶内充满肿瘤细胞，仅见散在坏死灶及少量炎性细胞浸润。双表达载体组pDC511hIL2-mIL12在质粒注射后一月，病灶内大量炎性细胞浸润，坏死更明显，仅见散在少量肿瘤细胞。质粒DNA注射后二月，病灶内广泛炎性细胞浸润，仅见坏死而无肿瘤细胞。结 论1. 所构建各质粒载体能在真核细胞内高效表达相应细胞因子，表达的细胞因子均有生物学活性。与相应的单表达载体组相比，双表达载体组表达的mIL12和hIL2体外刺激淋巴母细胞和胸腺细胞增殖作用更明显。2. 瘤内注射双表达质粒DNA后，血清中经诱导产生的IL-2、IL-12比相应单表达载体组持续时间更长，峰值更高。3. IL-12和IL-2基因联合运用可明显增强CTL细胞毒活性，促进炎性细胞浸润，提高机体抗肿瘤免疫应答。4. IL-2、IL-12基因治疗可抑制小鼠肝癌H22皮下移植瘤生长，两者联
鲁玉辉[5]2006年在《叶下珠复方抗HBV、人肝癌裸鼠移植瘤及其分子生物学机制探讨》文中研究说明一、研究目的 体外观察叶下珠复方抗HBV及抑制HBsAg、HBeAg分泌的作用,在动物体内观察叶下珠复方对免疫性肝损伤的保护作用,并初步揭示其护肝机制;研究叶下珠复方的体内和体外抗肿瘤活性,并探讨其抗肿瘤的分子生物学机制。 二、实验步骤 1.观察叶下珠复方体外抗HBV的作用 2.叶下珠复方抗ConA所致的免疫性肝损伤 3.叶下珠复方对人肝癌HePG_2细胞体外增殖的抑制作用 4.建立人肝癌HePG_2裸鼠移植瘤模型 5.叶下珠复方的体内抗肿瘤作用 6.用RT-PCR、分子克隆、基因序列测定和免疫组化等方法观察叶下珠复方对移植瘤裸鼠p53、c-myc基因表达的调节作用。 三、实验方法 1.以2.2.15细胞为模型,根据MTT法检测叶下珠复方的细胞毒性。用公式求算出药物的最大无毒浓度及半效致死量TC50。将2.2.15细胞按1×10~5/ml接种24孔细胞培养板,每孔1.2ml,次日弃培养液。以不同药物对2.2.15细胞的最大无毒剂量为起始浓度,加入培养液稀释(系列2倍稀释)的不同浓度的不同药物,每浓度6孔,每3天换含药物的培养液一次,同时设不加药物对照。收集每次换液的培养上清250ul,-20℃冻存,集中用ELISA法测定HBsAg、HBeAg,并计算药物对抗原的抑制率、半数有效浓度(IC50)和治疗指数(TI),判断药物效果,用荧光定量PCR测定HVB-DNA。 2.NIH小鼠48只随机分为6组,每组8只,分别为空白对照组,模型对照组,叶下珠复方大、中、小剂量组(40g/kg、20g/kg、10g/kg),联苯双酯(150mg/kg)治疗组,除空白对照组外,其余小鼠于实验首日上午尾静脉注射ConA 20mg/kg,4h后各组开始灌胃给药,空白对照组和模型对照组均灌等量生理盐水,次日晨开始第二次给药,第三天给药后4h第二次尾静脉注射ConA 20mg/kg,8h后取摘眼球取血,赖氏法检测ALT、AST,ELISA法检测TNF-α和IL-8含量。肝脏取出后取左叶中性甲醛固定,石蜡
李娟[6]2016年在《Galectin-1在肝癌中表达的临床意义及其调节肝癌细胞对TRAIL敏感性的研究》文中提出研究背景:肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma,HCC)作为现在全球发病率以及死亡率极其高的肝脏恶性肿瘤之一,它的发病率在全球恶性肿瘤中排第五位,因为它非常高的转移率和复发率,致使肝癌病人的总体预后非常不乐观。现在我国有近1亿慢性乙肝病毒携带者,而HBV慢性持续感染是引发HCC的独立危险因素,因此,存在着一个庞大的HCC高危人群,继而导致我们国家的肝癌的病死率居高不下,位于恶性肿瘤排名的第二位。由于HCC起病隐匿、转移早,多半患者在临床确诊时已经错过最佳的切除治疗机会,同时肝癌对化疗和放疗方案的不敏感,加之化放疗治疗方案副作用较大。虽然目前部分肝癌病人能够进行实施根治性切除手术治疗,但是70%左右的肝癌切除术后患者会在5年内发生复发,导致针对原发性肝癌的治疗上来说人们依然需要面对更加庞大的挑战,因此,更精准的对肝癌病人的预后进行预测,采取措施防止肝癌病人肝内及肝外转移的出现、能够在分子水平提前对肝癌患者的转印进行诊断、同时挑选新型的、有效的、副作用小的治疗方法对肝癌病人干预并使病人得到及时准确的治疗对临床和人类来说有不可小觑的意义,寻找新型的且有用的肝癌的辅助治疗手段对提高肝癌的总体生存率显得尤为重要。人类对分子生物学以及遗传学的技术认识逐渐地进步,使得我们对恶性肿瘤发生机制的研究也逐渐地深入。研究提示肿瘤细胞周围的免疫微环境,与肿瘤的进展和预后密切相关,癌症细胞就像一粒种子,如果离开合适的土壤就不能发芽,所以肿瘤的发生和发展不仅仅取决于肿瘤细胞本身的一些特性,同时也受肿瘤细胞适合生长发育的土壤的影响,也便是现在人们研究比较多的肿瘤微环境(tumormicroenvironment)。半乳糖凝集素(galectin)(β-半乳糖苷结合蛋白)是动物凝集素的一种,它分布在多种哺乳动物体内的多种器官组织中,实验表明,它与非常多的生理过程相关,譬如,细胞的粘附、增殖、分化、凋亡及炎症,另有肌肉分化、神经干细胞的成长及造血谱系等;近年来的研究证实galectin的表达与肿瘤的增殖、转移、浸润和复发关系密切,由此,galectin蛋白很有可能成为癌症治疗领域的新治疗靶点。galectin-1是在哺乳动物发现的第1个半乳糖凝集素,galectin-1约14kd(1d=1u),位于染色体22q12上,由lsgals1基因编码。研究发现,galectin-1与t淋巴细胞关系密切。免疫组织包括中枢的和外周的,而在这些组织的细胞中发现galectin-1的广泛存在,galectin-1能够通过诱导中枢免疫组织胸腺和外周免疫组织中的t细胞的凋亡增加,继而发挥稳定t淋巴细胞微环境的作用和功能。研究报道,galectin-1不仅在癌症的转化和逃避免疫反应等生物学行为中起作用,而且在肿瘤生殖周期、凋亡、细胞迁移和转移等肿瘤生物学行为中发挥重要作用。另外,实验表明,galectin-1在卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肾癌和非小细胞肺癌等相当多的恶性肿瘤组织中高表达,并且和肿瘤的增殖和侵袭表型能力相关。现有研究表明galectin-1参与肿瘤的疾病进展主要从以下几个方面进行:(1)galectin-1能促进恶性肿瘤细胞的生长。在多种癌症体内模型中,包括卵巢癌、宫颈癌、肺癌、头颈部肿瘤等,采取相应方法,比如,galectin-1的特异性抗体、稳定转染或瞬时转染等,使galectin-1的表达下调后,发现肿瘤增殖能力下降。(2)在胶质母细胞瘤细胞的体外实验中,研究者发现galectin-1能够增强胶质母细胞瘤细胞的侵袭和迁移能力;进一步的机制研究正事galectin-1蛋白能够调控趋化蛋白的合成及分泌从而加强肿瘤细胞的侵袭与迁移能力。(3)galectin-1蛋白能够依靠加速血管内皮细胞的活化及增殖或强化促血管生成路径增进肿瘤血管生成。galectin-1能够通过与vegf彼此作用同时联合nrp1继而增强血管内皮细胞的增殖及迁移能力。同时galectin-1能够减弱肿瘤微环境中的氧化应激反应对肿瘤细胞的损伤作用,发挥保护血管内皮细胞的作用。(4)galectin-1与肿瘤的免疫逃逸。侵袭性高的肿瘤细胞高表达galectin-1,同时侵袭性高的肿瘤发生部位免疫环境受抑制,提醒我们肿瘤细胞高表达的galectin-1是通过毁坏t细胞效应的目的来产生免疫抑制作用。这一机制已得到了大量的实验验证,譬如,封锁黑色素组织中galectin-1的生物活性后,发现肿瘤体积缩小,同时体内肿瘤特异性的t淋巴细胞反应被明显活化。综上所述,galectin-1蛋白能够在肿瘤的发生发展和转移复发的多个环节中发挥重要的调控作用,这也提醒我们将galectin-1蛋白作为恶性肿瘤早期诊断以及预后判断的重要标志的可能性,同时开辟为生物治疗的新靶点,假使通过此针对性治疗能阻断癌症的信号转导,继而抑制癌症的增殖、侵袭、转移及血管生成,或者能通过其改善肿瘤细胞对化疗药物的敏感性,那将是癌症治疗的创新性的未来。所以,探索galectin-1对肿瘤发生发展的功能作用和机制具有重要的临床转化意义。而目前,关于galectin-1蛋白在肝细胞肝癌中功能和原理的实验研究报道较少。1995年wiley等[1]从人类心肌cdna文库中克隆得到了tnf(tumornecrosisfactor)超家族中的一员,trail(tnf-relatedapoptosis-inducingligand)即apo2l(apoptosis-2ligand)。作为tnf超家族的一员,galectin-1有自己特殊的功能和作用,它能够对肿瘤细胞凋亡的具有选择性诱导,并且更重要的是这个过程中并不损害正常细胞,galectin-1蛋白这个特征使得其与其它tnf超家族成员tnf和fasl之高毒性有很大区别,另外,trail这一特征使得其在肿瘤治疗领域有着重要的临床应用优势,近年来galectin-1蛋白也逐渐成了的肿瘤治疗领域关注的焦点及基础研究的热点。正因为trail表现出的选择性抗肿瘤优势,故临床研究中在trail的基础上的各种类型和作用机制的抗肿瘤方案处于不断的探索阶段。大批临床试验证实:某些肿瘤细胞对trail治疗表现出抵抗性的原因是由于trail相关死亡受体的低表达或凋亡抑制蛋白的过高表达。i-Ⅱ期临床研究结果证实,如果可以在trail治疗基础之上联合应用激酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂可以很大程度上提高trail耐药的肿瘤细胞对trail的反应。此外由于可溶性trail半衰期短,如果我们在临床上长期使用也会产生耐药问题,使得基于trail的肿瘤靶向治疗在临床应用中很大程度上受限。某些肿瘤细胞对trail反应差,而部分研究表明,如果与某些药物配合应用能很好地提高trail的抗肿瘤能力。同时,随着科技发展,尤其是分子成像技术,辟如生物发光成像技术的发展,使得从化学文库中筛选增强trail凋亡诱导活性的分子从不可能变成可能。所有可以改变凋亡相关分子表达或活性情况的原因,均可以改变trail诱导的凋亡,有关trail的肿瘤治疗策略会通过人类对trail和它关联的死亡受体的表达情况、trail相关联的凋亡引导过程及此过程的调节的深入研究变得更加完善。trail制剂有可能作为人类治疗肿瘤的选择之一。trail的选择性引起癌细胞凋亡给人们治疗hcc的带来了新想法。trail诱导的有针对性的细胞广泛凋亡为目前hcc的处理开辟了新方向。一些学者针对trailr的表达情况和trail引起的凋亡情况在hcc中的体现进行了研究,竟然得到trailr1/r2/r4存在于6种hcc细胞株中,唯独trailr3单独存在于2种hcc细胞株中,并且多数hcc细胞株对单独的trail存在抗性,同时联合使用化疗方案能够增强trail的杀癌作用。基于以上研究背景,本研究拟检测肝癌细胞和组织中galectin-1的表达程度,并探讨galectin-1表达程度和hcc病人临床特征及预后的关联,探索galectin-1基因成为hcc的分子诊断、预后判断指标可能性。同时研究了下调galectin-1对肝癌细胞生物学行为的影响,以及调节肝癌细胞对trail敏感性的影响,论证了galectin-1蛋白作为肝癌分子靶向治疗的潜在靶点的可能性,为进一步体内的实验研究和临床应用提供理论依据。第一部分galectin-1在肝癌细胞系及肝癌组织中的表达及其与患者临床预后的相关分析目的:研究galectin-1在肝癌组织中的表达及其和临床特征及预后的关系方法:1.利用tcga公共数据库中的肝癌基因芯片数据分析galectin-1mrna在肝癌组织中和癌旁组织的表达强度。2.选用免疫组织化学方法及肝癌组织芯片技术检测galectin-1蛋白在肝癌组织中的表达程度。3.从mrna和蛋白水平综合分析galectin-1表达程度与病人临床特征及预后之间的关联。结果:1.galectin-1mrna和蛋白表达水平在肝癌中明显高于正常肝组织。2.galectin-1蛋白在出现转移和复发的患者中呈高表达水平。3.galectin-1的高表达提示肝癌患者更短的总生存期,提示galectin-1在肝癌发生生长过程中可能发挥重要作用。第二部分体外galectin-1基因敲减后对肝癌细胞生物学的影响目的:利用rna干扰技术沉默galectin-1基因,研究其对肝癌细胞的生长、凋亡、迁移和侵袭的生物学行为的影响。方法:1.将靶向galectin-1的sirna转染至肝癌细胞系sk-hep-1和huh-7;2.利用rt-pcr和westernblot技术检测galectin-1mrna和蛋白表达水平变化;3.mtt法检测体外沉默galectin-1基因后对肝癌细胞增殖能力的影响;4.流式细胞仪技术检测体外sirna沉默galectin-1基因后对肝癌细胞凋亡的影响;5.transwell法检测体外sirna沉默galectin-1基因后对肝癌细胞侵袭能力的影响;6.woundhealing法检测体外sirna沉默galectin-1基因后下调对肝癌细胞迁移能力的影响;7.克隆形成实验检测体外sirna沉默galectin-1基因后对肝癌细胞成瘤能力的影响。结果:1.转染sirna之后,galectin-1的mrna和蛋白表达水平降低,敲减实验成功。2.galectin-1基因敲减后肝癌细胞系的增殖能力变化不明显,迁移和侵袭能力以及成瘤能力明显下降。3.galectin-1基因敲减后肝癌细胞系的凋亡率明显升高。第三部分galectin-1通过bcl-2和survivin调节肝癌细胞对trail敏感性的研究目的:通过构建bcl-2和survivin的过表达质粒载体,研究galectin-1调节肝癌细胞对trail敏感性的初步机制。方法:1.构建过表达bcl-2和survivin的质粒并鉴定;2.将过表达bcl-2和survivin的质粒转染至肝癌细胞系,用g418进行筛选后,鉴定bcl-2和survivin在肝癌细胞中的mrna和蛋白表达水平;3.下调galectin-1对trail受体dr-4,dr-5的影响;4.mtt法检测galectin-1基因下调后对trail的敏感性;5.流式细胞仪技术检测galectin-1基因下调后,trail治疗引起的细胞凋亡率;6.流式细胞仪技术检测galectin-1基因下调及过表达bcl-2和survivin后对肝癌细胞的凋亡的影响。结果:1.经rt-pcr和western-blot鉴定,过表达bcl-2和survivin的质粒构建成功;2.下调galectin-1对trail受体dr-4,dr-5未见明显影响;3.过表达bcl-2和survivin能够逆转下调galectin-1引起的细胞凋亡;4.下调galectin-1能够影响肝癌细胞对trail的敏感性;5.galectin-1通过bcl-2和survivin调节肝癌细胞对trail的敏感性。全文结论:1.galectin-1在肝癌中表达明显升高,并和患者转移、复发率等临床恶性表型密切相关,同时galectin-1低表达患者的生存时间明显高于galectin-1的高表达患者。2.下调galectin-1后,肝癌细胞的增殖能力无明显改变,凋亡率明显升高,迁移和侵袭能力以及成瘤能力明显下降。3.下调galectin-1能够增加肝癌细胞对TRAIL的敏感性。4.galectin-1通过调控Bcl-2和Survivin的表达继而调节肝癌细胞对TRAIL的敏感性。
高明[7]2016年在《HSP90、SIRT3基因多态性与肝癌发病风险及其在肝癌中表达与侵袭间的相关性研究》文中进行了进一步梳理目的本课题通过研究HSP90和SIRT3在肝癌细胞中的表达与侵袭以及两者的多态性位点与肝癌发病风险之间的相关性,旨在探讨HSP90与SIRT3二者对肝癌发生发展的影响,并通过此项群体研究发现和鉴定新的肝细胞癌易感基因,试图为肝癌易感人群的疾病预防提供新的标志物,同时也为开发和研制新的肝细胞癌临床用药提供新的靶标,以期对提高肝细胞癌的临床防治效果提供帮助。方法(1)选取在2013年1月-2015年10月期间住院的198例肝癌患者,年龄在35-76岁范围;同时采集198例体检中心健康自愿者作为对照,年龄在33-69岁间。所有受试者均基于自愿并签署知情同意书。对HSP90与SIRT3基因多态性与肝癌患病风险进行相关性分析,此外还对具有饮酒史患者与肝癌易感性进行相关性分析。(2)将p GCSIL-GFP-HSP90重组慢病毒载体转染人肝癌AMMC-7721细胞,荧光定量PCR检测转染后细胞中HSP90 m RNA的表达;MTT法检测细胞生长情况;流式细胞术检测转染后对各组细胞凋亡的影响;Transwell小室法检测细胞的侵袭能力;平板克隆形成实验检测细胞的增殖能力;细胞划痕实验检测细胞的迁移能力;Caspase-3活性检测细胞的凋亡情况。(3)采用RNA干扰的方法沉默人肝癌细胞AMMC-7721中HSP90基因的表达获得HSP90基因沉默细胞株si HSP90-AMMC-7721,分别将野生型WT-HSP90和突变型Mut-HSP90转染si HSP90-AMMC-7721细胞;荧光定量PCR检测各组细胞SIRT3 m RNA表达;western blot法检测各组细胞SIRT3蛋白的表达。结果(1)HSP90 rs8005905与rs3742429基因多态性与肝癌的发生风险之间存在显著相关性;HSP90 rs3742429与具有饮酒史的人群的肝癌发生风险呈显著相关性。(2)上调AMMC-7721细胞中HSP90的表达后使细胞的增殖能力明显增高;流式细胞仪检测结果表明,上调细胞中HSP90的表达后对AMMC-7721细胞凋亡情况并未见显著影响;通过Transwell小室法检测结果表明上调HSP90的表达后视野平均侵袭细胞数量显著增多;平板克隆形成实验结果表明增高AMMC-7721细胞中HSP90的表达时,细胞克隆的形成能力明显上升;细胞划痕实验检测表明上调HSP90后AMMC-7721细胞的迁移性明显增强;caspase-3活性检测结果表明,上调HSP90表达后AMMC-7721细胞中caspase-3活性并未受到显著影响。(3)用荧光定量PCR以及western blot法分别对转染后各组细胞中SIRT3蛋白的表达情况进行检测,结果表明野生型HSP90转染后si HSP90-AMMC-772细胞中SIRT3m RNA和相应蛋白的表达明显降低;突变型HSP90转染后si HSP90-AMMC-7721细胞中SIRT3 m RNA和相应蛋白的表达无明显变化。结论HSP90基因多态性以及患者是否有饮酒史与肝癌的发生之间存在密切联系,且HSP90对肝癌细胞增殖、侵袭以及转移过程的促进作用可能是通过抑制SIRT3的表达实现的。
陈立刚[8]2006年在《含新城疫病毒HN基因重组核酸疫苗抗肿瘤作用研究》文中研究表明本研究将新城疫病毒HN基因与人白细胞介素18基因融合表达并与凋亡素VP3基因共同克隆入真核表达载体pIRESneo,构建了能够同时表达上述3种外源基因的重组真核表达质粒,并对重组质粒进行了表达鉴定。将重组质粒pIRVP3IL-18HN转染胃癌细胞BGC-823,采用各种细胞生物学方法观察了重组质粒pIRVP3IL-18HN转染致BGC-823肿瘤细胞的死亡方式及通路。实验结果表明,重组质粒pIRVP3IL-18HN转染最终导致肿瘤细胞凋亡,主要是通过线粒体途径诱导肿瘤细胞凋亡。复制了C57BL/6小鼠荷H22肿瘤模型,瘤内注射所构建的重组质粒pIRVP3IL-18HN,电镜及病理组织学切片显示肿瘤细胞存在凋亡现象,对实验组小鼠脾淋巴细胞亚群分类检测结果显示,重组质粒可不同程度地提高CD4+、CD8+ T淋巴细胞数量,推测重组质粒pIRVP3IL-18HN主要通过恢复机体的细胞免疫水平来提高其抑制肿瘤的作用。本研究提示,重组质粒pIRVP3IL-18HN在动物体内发挥了抗肿瘤作用,并且HN基因、IL-18基因和VP3基因具有协同抑瘤效应。
杜珍武[9]2009年在《人IL-12联合HSV-tk基因体外靶向特异性杀伤肝癌细胞的研究》文中研究指明本研究从肝癌基因治疗存在的有效性与安全性问题出发,采用HSV-tk与IL-12双基因联合的方法以提高肝癌基因治疗的有效性,而利用肝癌的特异性启动子启动联合基因在肝癌细胞内特异性表达,增强肝癌基因治疗的安全性。为此本研究利用基因重组技术构建联合基因靶向特异性治疗肝癌的载体,并在体外细胞水平验证该载体杀伤肝癌细胞的有效性与特异性。本论文取得了如下学术进展:1应用PCR技术成功从人外周血基因组中调取人甲胎蛋白基因启动子(pAFP)、增强子(eAFP)。并将克隆的pAFP与增强子eAFP先后连接入真核表达载体,构建成由pAFP与eAFP启动基因表达的载体。利用报告基因β-半乳糖甘酶基因(β-gal)验证了该启动子具有启动基因在肝癌细胞中表达的特异性。2成功应用连接肽将人IL-12基因的两个亚单位基因拼接为单链基因。应用核糖体进位位点(IRES)将IL-12基因与单纯疱疹病毒胸苷激酶基因(HSV-tk)拼接在一起,构建成HSV-tk与IL-12融合的真核基因表达载体。通过体外实验研究结果表明,两个基因可以在肝癌细胞内同时表达,并具有相应的抗肿瘤与激活免疫细胞的功能。说明这两个基因在统一启动子控制下可实现共同表达,使免疫增强基因IL-12与肿瘤自杀基因HSV-tk同步共表达,增强两条途径杀伤肿瘤的协同作用。3成功构建了由人甲胎蛋白基因启动子(pAFP)、增强子(eAFP)控制下的IL-12与HSV-tk联合基因表达载体,将该载体体外转染肝癌细胞以及非肝癌细胞,实验结果表明IL-12与HSV-tk基因在肝癌细胞内有特异性的表达,表达HSV-tk基因的肝癌细胞对GCV有敏感性,并可产生杀伤肿瘤的旁观者效应。IL-12可以促进体外淋巴细胞的增殖,以及IFN-γ的分泌。这些研究结果说明克隆的人甲胎蛋白基因启动子(pAFP)、增强子(eAFP)可特异性启动IL-12与HSV-tk在分泌AFP肝癌细胞内特异性表达,并具有杀伤肝癌细胞功能。本研究在一个载体上实现了联合基因的共同表达以及基因表达的肝癌靶向性,为进一步利用该载体进行肝癌的基因治疗奠定了理论与实验基础。
参考文献：
[1]. 应用TNF基因转导肿瘤浸润淋巴细胞进行肝癌基因治疗的实验研究[D]. 罗意革. 广西医科大学. 2000
[2]. 六味地黄丸对HSV-tk/GCV自杀基因系统治疗肿瘤的增效作用[D]. 杜标炎. 广州中医药大学. 2005
[3]. 表达NDV HN基因重组腺病毒对BEL-7402细胞及转移模型的抑制作用[D]. 朴秉国. 吉林大学. 2011
[4]. 白细胞介素-2和白细胞介素-12联合基因治疗小鼠肝癌的实验研究[D]. 刘勇. 第三军医大学. 2003
[5]. 叶下珠复方抗HBV、人肝癌裸鼠移植瘤及其分子生物学机制探讨[D]. 鲁玉辉. 广州中医药大学. 2006
[6]. Galectin-1在肝癌中表达的临床意义及其调节肝癌细胞对TRAIL敏感性的研究[D]. 李娟. 郑州大学. 2016
[7]. HSP90、SIRT3基因多态性与肝癌发病风险及其在肝癌中表达与侵袭间的相关性研究[D]. 高明. 安徽医科大学. 2016
[8]. 含新城疫病毒HN基因重组核酸疫苗抗肿瘤作用研究[D]. 陈立刚. 吉林大学. 2006
[9]. 人IL-12联合HSV-tk基因体外靶向特异性杀伤肝癌细胞的研究[D]. 杜珍武. 吉林大学. 2009
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