迟磊[1]2003年在《不同特性抗原对大鼠个体发育早期TH_1/TH_2亚群功能的影响》文中认为背景:近几十年来，支气管哮喘等变态反应性疾病的发病率呈持续上升趋势。导致这一现象的根本原因至今仍不是很清楚，在稳定人群中的基因构成似乎不可能在一个世纪内发生显着变化，故环境因素仍可能为该病的决定因素。生命早期高度暴露于尘螨变应原（Derｐ）已被证实是导致过敏和哮喘发生及决定其持久性的主要危险因素之一。同时，临床和流行病学的研究证据显示，细菌和部分病毒的感染与变态反应性疾病之间存在负相关。最近的动物实验研究证明如果在变应原致敏之前感染卡介苗（BCG）可以诱导较强的TH1反应，从而抑制针对该变应原的TH2免疫反应。产前阶段和婴儿早期阶段被认为在个体正常的TH1/TH2平衡的建立和维持中起关键作用，如何在这一阶段采取免疫干预措施来预防变态反应的发生，可能代表了将来的一个研究方向。目的：研究妊娠期母体及生命早期婴儿分别暴露于不同特性抗原（尘螨和卡介苗）对发育后期个体TH1/TH2平衡及哮喘发生的影响。探讨预先存在的由接种BCG引起的TH1型免疫反应是否会抑制致敏作用的发生，为研制“哮喘疫苗”早期干预哮喘失衡的TH1/TH2功能提供理论依据。方法：1.哮喘动物模型的复制：去卵蛋白（OVA）喂养的30日龄Wistar大鼠20只，随机分为模型组和对照组。以OVA为变应原、<WP=7>以氢氧化铝（AI（OH）3）为免疫佐剂，双次腹腔+皮下注射系统致敏、连续6次呼吸道雾化吸入OVA诱导气道变应性炎症，诱发哮喘发生。取血浆检测OVA特异性IgE抗体、培养外周血单个核细胞(PBMC)检测TH1/TH2类细胞因子分泌情况、行支气管肺泡灌洗（BAL）记录灌洗液（BALF）中嗜酸性粒细胞（EOS）的百分比记数、留取肺组织标本观察变应性炎症病理改变，行原位杂交检测气道局部淋巴细胞中IL-4mRNA表达水平。2.大鼠分组及处理：根据母体妊娠期及新生鼠早期是否接种抗原及抗原种类的不同将实验鼠随机分为母-仔-、母BCG+仔BCG+、母Der p+仔Der p+、母BCG+仔BCG-、母Der p+仔Der p- 共5组，分别于皮下注射尘螨抗原（Der p）、卡介苗（BCG）和生理盐水（-）。30日龄时全部按上述方法复制成哮喘模型，取血浆检测OVA特异性IgE、培养PBMC检测上清液中TH1/TH2类细胞因子水平、行BAL记录BALF中EOS的百分比记数。结果：1. 激发后模型组与对照组相比，肺部出现多种炎性细胞浸润，血浆产生高滴度IgE，BALF中EOS增加，PBMC培养上清中白细胞介素-4 (IL-4)升高、(-干扰素（IFN-(）降低。2.妊娠中、晚期经Der p致敏母鼠的子代，生后继续暴露于Der p（母Der p+仔Der p+），在哮喘建模后与未致敏母鼠的子代（母-仔-）相比，其PBMC生成IFN-γ降低、IL-4增多，由此导致IL-4/IFN-γ比值的显著升高，代表了体内TH2免疫反应的亢进；新生儿期避免再次接触Der p的子代（母Der p+仔Der p-），与母-仔-组之间未见任<WP=8>何显着性差异，两组之间（母Der p+仔Der p+与母Der p+仔-）比较，前者的TH2优势显着高于后者。３. 孕期经皮下给予BCG的母鼠的子代，如果生后第一天接种BCG（母BCG+仔BCG+），在哮喘建模后PBMC的IFN-γ产量显著高于母仔均未接种BCG组（母-仔-），IL-4水平则显着降低，因而IL-4/IFN-γ比值降低；新生儿期不再接种BCG组（母BCG+仔BCG-），同样显示出了IL-4/IFN-γ比值降低的TH1优势，OVA特异性IgE与母-仔-组比较无明显差异；两组之间（母BCG+仔BCG+与母BCG+仔BCG-）比较，前者的TH1优势显着高于后者。结论：１.采用双次腹腔+皮下注射OVA致敏、连续6次呼吸道激发的方法诱导出了气道变应性炎症，从而成功建立了过敏性哮喘的动物模型，为进一步研究儿童哮喘的早期干预问题奠定了实验基础。 ２. 胎儿对于环境变应原跨胎盘的致敏作用可以通过母体妊娠期间的免疫来完成，这一过程会根本上导致TH2优势免疫的发生，增加了变态反应性疾病的危险性。３. 分枝杆菌感染在体内诱导出较强的TH1细胞免疫反应，胚胎期和新生儿期接种BCG可以诱导持久的TH1记忆反应，对于哮喘的局部嗜酸性粒细胞炎症及血浆内变应原特异性IgE抗体的产生都有一定的抑制效应。
刘晓曦[2]2013年在《热应激大鼠肠道抗原递呈及黏膜免疫功能的变化》文中认为肠道是机体重要的免疫器官,肠黏膜免疫功能对维持动物机体的健康非常重要。机体热应激后,肠黏膜机械屏障受到破坏,免疫功能降低。本文复制并评价大鼠热应激模型,采用基因芯片分析大鼠肠道免疫相关基因表达谱变化,用ELISA技术检测回肠黏膜分泌的IgA,用荧光定量PCR检测回肠黏膜免疫相关基因的表达,用流式细胞术检测回肠和肠系膜淋巴结中树突状细胞数目和细胞表面功能分子的表达量变化,以及肠系膜淋巴结中T淋巴细胞亚群分化的影响,探讨热应激对大鼠肠道黏膜免疫功能的影响。本实验采用12只体重为210±10g雄性SD大鼠,适应性饲养7d后随机分为常温对照组和热应激组(6只/组)。大鼠饲养于恒定温度25℃,相对湿度(RH)60%的小型人工气候仓内,自由饮水、采食；其中热应激组大鼠每天在40℃,相对湿度60%条件下热处理2h,连续处理3d,大鼠热应激模型。3d后,处死大鼠无菌采样。与对照组大鼠相比,热应激大鼠实验结果如下：热应激导致大鼠直肠温度极显着升高(p<0.01),血清皮质醇含量显着升高(p<0.05)。外周血白细胞和单核细胞数目极显着降低(p<0.01)。组织学观察发现热应激破坏了小肠绒毛结构,绒毛上皮细胞脱落,固有层裸露。十二指肠、空肠和回肠都有损伤,其中十二指肠和空肠的损伤更严重,肠系膜淋巴结组织结构也受到破坏,证明大鼠肠道热应激模型成立。通过分析大鼠热应激后小肠基因表达谱变化,筛选出23个与免疫相关的差异基因(p<0.01, Fold Change>2),其中12个上调基因,11个下调基因。上调免疫基因包括：Hsp70, Zbtb16, Csf2, Hpx, IL22ra2, Ptdsr, LOC301133, Bc16, Madcam1, Ppara, Cdk6, Vegfa;下调免疫基因包括：RT1-Bb, S100a9, Cc14, Tlr2, Irf4_predicted, Mmp9, Ccr5, Spn, Cc15, Ms4a2, Tnfrsf6等。对差异基因进行Gene Ontology和Pathway分析,发现变化最大Hsp70和RT1-Bb均参与抗原处理和递呈信号通路。于是本文围绕抗原处理和递呈这个信号通路展开研究。热应激后,大鼠回肠IgA的含量显着下降(p<0.05),肠道黏膜免疫功能减弱。回肠树突状细胞的数目,细胞表面的MHCⅡ、CD86的表达量未发生显着变化,。回肠IL-12mRNA(主要由树突状细胞分泌)表达量下降(p<0.05),IFN-γmRNA的表达量显着下降(p<0.05),IL-2mRNA表达量未发生明显变化,IL-4, IL-10mRNA表达量显着下降(p<0.05),Treg细胞的Foxp3mRNA表达量显着上升(p<0.05)。与对照组相比,热应激后肠系膜淋巴结CD3+T细胞极显着降低(p<0.01)；热应激组CD3+CD4+CD8Th淋巴细胞亚群占T细胞的比例显着降低(p<0.05)；T细胞和CD3+CD4+CD8Th淋巴细胞的数目极显着下降(p<0.01)。肠系膜淋巴结中树突状细胞的数目显着一下降(p<0.05),细胞表面的MHCⅡ、共刺激分子CD86的表达极显着下降(p<0.01)。结论1热应激造成小肠和肠系膜淋巴结结构损伤。2热应激改变了小肠的基因表达谱,生物信息学分析显示小肠黏膜免疫反应抗原处理和递呈功能受到影响。3热应激后,回肠合成IgA抗体的能力减弱,表明回肠免疫功能降低。回肠树突状细胞抗原递呈功能并未发生变化,Th1/Th2型细胞因子免疫功能降低,Treg细胞的免疫抑制功能增强。4热应激后,大鼠肠系膜淋巴结的结构破坏,树突状细胞的抗原递呈功能降低,T细胞辅助细胞受到影响,细胞免疫功能降低。
姜国均[3]2007年在《黄芩和石菖蒲及其成分的安胎作用及机理研究》文中提出流产的原因及机理非常复杂,目前国内外大多数学者认为早期胚胎丢失与母胎界面的免疫状态和激素水平有很大关系。1953年,Medawar提出“胎儿同种移植”的概念来解释妊娠中母体与胎儿间的免疫相互关系,后来Wegmann等进一步提出了Th2细胞应答模式。越来越多的证据表明,母胎界面存在复杂的免疫调控和内分泌激素作用网络,并且妊娠时母体出现独特的免疫调节规律,各种相关因素互相作用,构成复杂的免疫平衡网络,任一因素失衡都可能导致胚胎丢失、妊娠失败。中药安胎已应用了上千年,但安胎机理尚不完全清楚,已有的研究多侧重传统中药复方的机理,而对发挥安胎作用有效成分的确定及其机理的研究甚少,另外,中药复方成份复杂,没有统一的国家(国际)标准,是中药难以推向世界的重要原因之一。本研究依据中药传统理论,结合现代中药药理学,筛选出黄芩、石菖蒲等的有效成分黄芩苷、黄芩素、槲皮素和乙酸龙脑酯用于安胎试验。于妊娠的第4、5、6、7d,每只小鼠每天分别灌服中药黄芩、石菖蒲及其单体成分各0.4mL,受孕第7d用细菌脂多糖(LPS)或米非司酮(RU486)诱导小鼠流产,同时设P(progesterone,孕酮)、PXF(pentoxifylline,己酮可可碱)保胎对照组及PBS正常对照组,所有试验鼠均于受孕第9d眼球摘除放血,制成血清,颈椎脱臼处死。然后,剖开腹腔观察子宫和胚胎生长情况,记录胚胎着床数和死胚数;取左侧子宫用光镜、透射电镜观察组织学及超微结构变化,免疫组化检测子宫内膜CD4+和CD8+T淋巴细胞的分布和含量,探讨子宫组织局部变化与妊娠的关系;取右侧子宫制成子宫组织匀浆,用酶联免疫吸附技术(ELISA)检测子宫组织和血清中P水平,分析中药有效成分对子宫组织中生殖激素的影响,研究中药有效成分通过内分泌调节胚胎着床的作用及机理;取子宫组织匀浆和血清用ELISA检测IL-2、INF-γ、IL-4、IL-10的含量,探讨免疫与流产的关系,以及中药有效成分对Thl/Th2型细胞因子的影响;取脾脏,流式细胞仪检测CD80/CD86的含量,研究中药对CD80/CD86协同刺激分子表达量的影响,以及与母胎界面局部Thl/Th2型细胞因子的关系,期望通过中药成分干预CD80/CD86协同刺激信号,调整母胎界面局部Thl/Th2型细胞因子的平衡,形成维持正常妊娠所需的Th2型反应偏倚,诱导母胎免疫耐受,从而阐明中药调节胚胎着床的免疫学机制。结果表明:1.用RU486和LPS诱导小鼠流产,随着药物浓度的增强,流产率和胚胎丢失率逐渐增高,使小鼠大部分发生流产,胚胎吸收率上升。受孕第7d皮下注射RU486 80μg、第9d剖检,确定为RU486流产模型的试验用药剂量和剖检时间;受孕第7d皮下注射LPS 0.10μg、第9d剖检,确定为LPS流产模型的试验用药剂量和剖检时间。2.在受孕第4～7d使用黄芩苷、黄芩素和黄芩煎液预防,黄芩及成分对RU486的流产作用有良好的抑制效果,黄芩及其成分黄芩苷和黄芩素各组,流产率和胚胎吸收率显着低于RU486组(p<0.05或p<0.01),CD4+T淋巴细胞数量极显着低于RU486组(p<0.01),CD8+ T淋巴细胞数量与RU486组相近(p>0.05)。RU486诱导流产小鼠子宫组织的炎性症状明显,滞后于胚胎发育;超微结构病理变化显着,线粒体变性,溶酶体增多,无分泌颗粒。黄芩及成分各组与RU486组相比,子宫组织学和超微结构损伤轻微,脾脏中CD80表达量有下降趋势,显着低于RU486组(p<0.05);CD86表达量有上升趋势,显着高于RU486组(p<0.05或p<0.01)。RU486组子宫组织中游离孕酮含量升高,IL-2含量降低,IFN-γ浓度升高,IL-4、IL-10含量低于正常水平;黄芩苷、黄芩素和黄芩煎液组子宫组织中IL-4、IL-10含量显着高于RU486组(p<0.05)。3.在受孕第4～7d使用黄芩苷、黄芩素和黄芩煎液预防,黄芩及成分对LPS诱导的流产有良好的抑制作用,黄芩及成分各组小鼠子宫组织学和超微结构损伤较LPS组轻微,小鼠的流产率由100.0%分别降为33.3%、37.5%和40.0%,胚胎吸收率由100.0%分别降为29.4%、33.3%和31.6%。小鼠子宫IL-2的含量各组相近(p>0.05)。子宫组织中IFN-γ含量,细菌脂多糖组高于其它各组(p<0.01或p<0.05);细菌脂多糖组、PXF组子宫组织IL-4和IL-10含量与正常对照组相近。4.在受孕第4～7d使用槲皮素、乙酸龙脑酯、槲皮素+乙酸龙脑酯药液和石菖蒲煎剂预防,石菖蒲及成分对LPS的流产作用有良好的抑制效果,小鼠的流产率由100.0%分别降为50.0%、60.0%、30.0%和40.0%,胚胎吸收率由100.0%分别降为53.2%、60.4%、28.6%和36.7%。试验中Th1/Th2细胞因子含量与胚胎吸收率关系密切,槲皮素+乙酸龙脑酯、石菖蒲煎剂组中IFN-γ含量与正常对照组相近(p>0.05),且极显着低于细菌脂多糖组(p<0.01);槲皮素药液组中IFN-γ含量低于细菌脂多糖组,高于正常对照组,差异显着(p<0.05);细菌脂多糖组的子宫组织中IFN-γ含量最高,流产率、胚胎吸收率最高。通过对试验结果分析,可以得出以下结论:1.RU486是一种P4的受体拮抗剂,且能诱使机体Th1/Th2平衡偏向Th1型反应,导致免疫排斥而诱发小鼠胚胎吸收、流产,对生产中常见的内分泌失调、免疫失调等造成的妊娠失败而言,是良好的实验模型。LPS可以诱导子宫产生炎症变化,改变母体正常的Th1/Th2免疫的平衡,使子宫局部免疫平衡偏向不利于妊娠维持的Th1型优势,导致免疫排斥而诱发小鼠胚胎吸收、流产,对生产中常见的感染性疾病、免疫因素等造成的妊娠失败而言,是良好的实验模型。2.在受孕第4～7d使用黄芩苷、黄芩素和黄芩煎液预防,黄芩及成分黄芩苷和黄芩素对RU486、LPS的流产作用有良好的抑制效果,其安胎机理主要是:一方面黄芩及单体成分具有抗炎、抗病毒、抗氧化清除氧自由基,拮抗LPS诱导子宫内膜产生的炎症反应;另一方面黄芩及单体成分通过影响抗原呈递细胞表面共刺激分子CD80/CD86的表达,影响子宫内膜CD4+和CD8+ T淋巴细胞的分布和含量,影响子宫局部孕激素的含量变化,从而调整母-胎界面局部Thl/Th2型细胞因子的平衡,形成维持正常妊娠所需的Th2型反应偏倚,表明中药可能通过免疫调控和内分泌激素作用网络,使Th1/Th2型细胞因子保持动态平衡,恢复各生殖激素的动态平衡,恢复正常的妊娠微环境而起到安胎作用。3.在受孕第4～7d使用石菖蒲及成分槲皮素和乙酸龙脑酯煎液预防,石菖蒲及成分槲皮素和乙酸龙脑酯对LPS的流产作用有良好的抑制效果,其安胎机理主要与石菖蒲及单体成分具有镇静安神、具有抗炎、抗过敏、抗氧化等多种生物学效应有关。另外,石菖蒲及成分可能还通过调整母-胎界面局部Thl/Th2型细胞因子的平衡,形成维持正常妊娠所需的Th2型反应偏倚。表明中药可能通过调节机体神经功能和免疫功能的状态,恢复正常的妊娠微环境而起到安胎作用。
魏彦明[4]2003年在《中药成分对LPS诱导大鼠流产作用机理的研究》文中研究表明早期胚胎死亡或胚胎丢失，又称隐性流产，严重影响母畜繁殖力与生产力。在人医临床上，自然流产的发生率占全部妊娠的15％左右，多数为早期流产。妊娠时母体能够耐受同时带有父方遗传基因与母方遗传基因的半同种异体胎儿，是极其复杂而又受到精细调控的免疫学现象。许多证据表明Th1和Th2细胞因子在妊娠过程起着调节免疫和内分泌的关键作用。雌激素和孕激素在母畜怀孕过程以至整个生殖活动和其他生理活动过程中均具有重要作用，雌激素受体和孕激素受体则是实现这些功能所必需的基本元件。 为了研究中药或中药成分对实验性流产大鼠保胎的作用及其机理，本实验采用怀孕7天大鼠尾静脉注射细菌脂多糖，建立SD大鼠流产模型，再随机分为正常对照组、流产模型组、黄芪多糖组、淫羊藿组和白术黄芩组。分别于怀孕4～9天口服黄芪多糖、淫羊藿提取物和白术黄芩2ml／日，对照组与模型组分别于4～9天口服生理盐水2ml／日。于实验第10天麻醉处死大鼠，计数妊娠成功率和流产率，并以双抗体夹心ELISA法检测血浆和子宫组织匀浆中Th1型细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ，Th2型细胞因子IL-4、IL-10及子宫组织匀浆中ER、PR的含量变化，用RT-PCR法检测子宫组织匀浆中ER mRNA和PR mRNA的表达变化，同时，用光镜观察子宫组织结构的病理学变化，研究黄芪多糖、淫羊藿提取物和白术黄芩水煎液干预对妊娠结局和以上指标的影响。本研究表明： 1．LPS诱导大鼠流产模型流产率高达72.73％，对照组为8.33％，两者差异极显着(P＜0.01)。 2．流产模型组大鼠血浆和子宫组织匀浆Th1型细胞因子IL-2、TNF-α和IFN-γ含量显著增加，Th2型细胞因子IL-4、IL-10含量则显着降低，与对照组比较差异极显着(P＜0.01)。 3．流产模型组子宫组织中ER、PR含量极显着的低于对照组(P＜0.01)。 4．子宫组织中ER mRNA和PR mRNA表达水平流产模型组极显着的低于对照组(P＜0.01)。 5．流产模型组子宫组织病理变化明显，子宫黏膜出血、坏死、脱落，血管周围和子宫平滑肌、子宫壁、子宫内膜有大量的嗜酸性粒细胞浸润。局部有较多的中性 中药成分对LPS诱导大鼠流产作用机理的研究一摘要粒细胞，为一种局部出血坏死性炎症，勃膜深层，细胞破碎，细胞核崩解，结构破坏。 6.黄茂多糖、淫羊蕾提取物和白术黄答对以上指标均有较好的调节作用，表现在流产率降低，妊娠成功率升高;血浆和子宫组织匀浆中Thl型细胞因子含量降低，ThZ型细胞因子含量升高;子宫组织匀浆中ER、PR含量和子宫组织ER mRNA和PR mRNA表达水平升高;子宫组织病理变化明显改善;与模型组比较差异显着或极显着(尸<0.05或p<0.01)，以黄茂多糖和白术黄答作用较好，淫羊蕾提取物相对较差。 LPS诱导大鼠流产模型具备免疫内分泌网络失调的特征，表现为高流产率，血浆和子宫局部Thl/Th2型细胞因子平衡偏向Thl型免疫反应，子宫组织中ER、PR含量降低，子宫组织中ER mRNA和PR mRNA表达水平降低，子宫组织中有大量的嗜酸性粒细胞浸润。黄蔑多糖、白术黄答和淫羊蕾提取物可以通过调整TM/Th2细胞因子网络平衡，升高血浆和子宫组织中ER、PR含量和子宫组织中ER mRNA和PR mRNA表达水平，改善子宫组织病理学变化等，达到调控和维持妊娠，具有较好的保胎作用。
闫明茹[5]2007年在《针灸关元、命门、足叁里穴对免疫失调模型大鼠IL-18、AVP及相关因子影响的实验研究》文中提出针灸作为传统的治疗方法行之有效,其整体调节的优势逐步被认同,虽然已经进行了大量的研究工作,但针灸机理的阐释仍不能令人满意。对针灸防治、预防疾病的作用机制进行进一步深入的研究,仍是必要的。微观研究,整体综合或许是一条思路。本实验在前期实验的基础上,通过继续观察针刺对束缚、佐剂性关节炎(AA)模型大鼠的影响,从电针刺激作为处理手段,选取关元、命门、足叁里叁穴,在深究上述叁个穴位在中医理论下共性和特性的基础上,通过检测分子生物学水平上的指标变化来研究这叁个穴位对不同应激源所致免疫失调的模型大鼠的调控机制,并结合神经内分泌免疫网络学说,来揭示针灸整体调控的部分机理。实验以AA、束缚模型作为研究对象,采用组织学、免疫组化及放射免疫等技术方法检测脑内及血液中细胞因子、神经肽类等物质,观察针灸对不同应激源所致的免疫失调模型的影响。选取雄性Wistar大鼠120只随机分为15组,每组各8只,分别为:正常组、AA模型组、束缚模型组、AA针关元组、AA针命门组、AA针足叁里组、AA灸关元组、AA灸命门组、AA灸足叁里组、束缚针关元组、束缚针命门组、束缚针足叁里组、束缚灸关元组、束缚灸命门组和束缚灸叁里组等。实验结论为,针刺的调整作用是多方面、多环节、多途径、多水平的,针刺对神经、内分泌、免疫叁大系统均具有调节作用,主要结果如下:1.针灸能使AA大鼠关节红、肿、热等症状减轻,关节肿胀率降低,镜下观察关节滑膜中炎性细胞浸润明显减轻,关节软骨结构完整。提示针灸具有减少炎症渗出,促进渗出物吸收,抑制炎症反应作用。2.针灸能使AA大鼠迟发性左足足爪肿胀率降低,且针灸关元穴效应最强,电针更为明显。提示针灸能减轻机体继发反应的程度,对机体亢进的免疫反应有一定的阻抑作用。3.针灸通过调节IL-1、TNF-α、IL-2、L-18的水平来降低机体的炎症反应程度。4.针灸对大鼠血清IL-2水平具有双重调节作用:对AA模型大鼠表现为明显上调,对束缚模型大鼠表现为上调不明显,关元则表现为下调趋势。5.针灸可通过调节大鼠ACTH的水平来减轻外界各种不良应激对机体所造成的伤害。6.针灸可整体调节大鼠大脑皮层AVP的分泌和释放,继而在中枢水平即可刺激CRF及ACTH释放,刺激肾上腺糖皮质激素分泌,发挥对整个HPA轴的功能的调控作用。7.关元穴对机体炎症反应的调节作用优于足叁里穴和命门穴,且命门穴作用最差;同时,关元穴、命门穴和足叁里穴在防治免疫功能失调疾病中具有各自规律与特点,并且对不同模型的调节作用不同,体现了腧穴特异性的特点。并且电针对机体的免疫调整作用强于艾灸。8.针灸可通过对中枢、外周等不同水平的作用,调节机体神经递质和相关免疫因子的合成和释放,继而作用于神经-内分泌-免疫网络,并通过此网络多水平、多层次、多靶点的共同作用,发挥多元化的功能,从而提高机体对外界不良应激的抵抗能力,并将外界对机体的伤害减小到最低。针灸的这种作用,由于各类内在因素的影响,体现了多元化、复杂性的一面,同时也证明了针灸在调控神经-内分泌-免疫网络中各种递质、细胞因子复杂的内在机制。
韩涛[6]2003年在《重肌灵抗重症肌无力的主要药理作用及作用机制的研究》文中指出重肌灵是河北以岭医药研究院临床长期用于治疗重症肌无力（Myasthenia gravis，MG）的有效中药复方，主要由黄芪、人参、鹿茸等组成，临床治疗上千例MG患者，取得比较好的疗效，具有温理奇阳，扶元振颓作用。重症肌无力（MG）是重点累及神经一肌肉接头处突触后膜上乙酰胆碱受体，主要由乙酰胆碱受体抗体介导的，T细胞依赖性、补体参与的自身免疫性疾病。实验性自身免疫性重症肌无力(Experimental Autoimmune myasthenia gravis，EAMG)被认为是研究MG的重要动物模型，目前公认的EAMG模型是用电鳐（Torpedo）或电鳗的电器官提取，纯化的N2-乙酰胆碱受体(Acetylcholine receptor,AchR)作为抗原免疫动物而成。本论文以Lewis大鼠建立EAMG模型，从与MG发病机理密切相关的N2AchR抗原特异性细胞免疫和体液免疫入手，将研究重点集中在MG发病机制中最重要的环节Th亚型细胞及Th亚型细胞分泌产生细胞因子IL-4、IFN-r；胸腺又是T细胞发育成熟的部位，而引起MG、EAMG的直接因素是体内产生抗N2AchR抗体。所以将胸腺—Th亚群—IL4、IFN-r—抗N2AchR抗体为轴心，运用3H-TdR掺入、ELISA、原位杂交检测及细胞凋亡检测技术，从整体、组织、细胞、分子水平深入研究重肌灵抗重症肌无力的作用机理。主要研究内容如下：1．大鼠EAMG模型建立 从电鳐电器官中提取N2AchR粗提物，N2AchR粗提物和完全福氏佐剂等量混合，模型组大鼠尾根部，足垫部，背部皮下多点注射上述含N2AchR抗原液0.5ml/只，分别于实验的第1日、第14日、第30日共免疫3次。于未次免疫的19-21日，从临床症状、体重、肌力、运动能力及肌电、肌肉中N2AchR损失率及血中抗N2AchR抗体滴度来评价模型是否成功。结果表明，模型组大鼠上述指标与正常组、佐剂组相比，均有显着差异P<0.01，说明模型建立成功。用本方法建立的模型经济、成功率高，方法易于普及，在临床症状，病理表现等方面与人类MG相似，可用来免疫大量动物，进行MG发病机理及药效学研究。2．重肌灵对EAMG大鼠主要药效学研究 用N2AchR粗提物加完全福氏佐剂方法免疫Lewis大鼠，制备EAMG大鼠模型。观察重肌灵预防给药对EAMG大鼠的影响。重肌灵大中剂量（6.56g/kg、3.28g/kg）可明显改善EAMG大鼠临床症状（P<0.01和P<0.05），对EAMG组大鼠体重有提高作用；对大鼠攀网研究显示重肌灵大中剂量组能显着提高EAMG大鼠肌力（P<0.05），表明重肌灵有提高EAMG大鼠肌力作用；采用旷场试验分析发现，重肌灵大中剂量组可显着提高EAMG大鼠跨格次数和理毛次数（P<0.01和P<0.05），表明重肌灵显着改善EAMG大鼠的运动能力；采用ELISA法发现重肌灵叁个剂量组均可降低EAMG大鼠血清中抗N2AchR抗体含量（P<0.01和P<0.05），叁组呈量效关系；重肌灵大中剂量还可缓解EAMG大鼠连续低频电刺激（5Hz，10Hz）后出现的大鼠腓肠肌收缩的衰减（P<0.01和P<0.05）；重肌灵叁个剂量组对EAMG大鼠后肢肌肉突触后膜上N2AchR数目有显着升高作用，（P<0.01和P<0.05），其受体数目分别为正常组的78%，60%，48.7%（模型组为31%）。以上结果证明重肌灵对EAMG模型大鼠有明显防治效果。现代医学治疗该病以糖皮质激素为主，但副作用多；中医中药治疗该病虽时有报道，但尚未开发为中药新药。本实验为将重肌灵开发为临床治疗重症肌无力的中药新药提供了有力的依据，必将带来一定的社会效益和经济效益。3．重肌灵和地塞米松对EAMG大鼠及正常小鼠免疫功能的影响3.1对EAMG大鼠免疫功能的影响 重肌灵大中小剂量能显着增强ConA诱导的<WP=5>EAMG大鼠淋巴结T细胞增殖（P<0.01和P<0.05）；而地塞米松则明显抑制其增殖（P<0.01）；重肌灵大中小剂量能显着抑制纯化的N2AchR特异性抗原诱导EAMG大鼠淋巴结T细胞增殖（P<0.01）及DTH反应（P<0.01）；地塞米松则呈现明显的抑制作用。3.2重肌灵对正常小鼠免疫功能的影响 重肌灵大中剂量能显着增强ConA和LPS诱导的正常小鼠脾T和B淋巴细胞增殖（P<0.01或P<0.05）；重肌灵大中剂量对正常小鼠抗体形成细胞功能具有明显促进作用，对血凝抗体滴度也有明显的提高作用（P<0.01）。以上结果证明重肌灵能明显抑制N2AchR特异性抗原诱导的EAMG大鼠细胞免疫和体液免疫反应，但对ConA诱导的细胞免疫反而有增强作用；对正常小鼠ConA、LPS诱导的细胞免疫、体液免疫及对SRBC诱导的体液免疫有增强作用，证明重肌灵抗EAMG的作用是不同于西药免疫抑制剂地塞米松作用。4．重肌灵对EAMG大鼠免疫调节机制的研究 采用ELISA法检测与MG、EAMG发生发展密切相关的Th1型因子IFN-r，Th2型因子IL-4变化，发现重肌灵大中剂量可显着下调EAMG大鼠血中升高的IL-4，IFN-r水平；采用原位杂交法观察重肌灵对EAMG大鼠胸腺IL-4，IFN-rmRNA表达的影响发现，重肌灵大中剂量组能显着降低EAMG大鼠胸腺IL4，IFN-rmRNA表达，结合对血中IL-4，IFN-r水平影响，可推测重肌灵抗EAMG机制可能是通过降低机体IL-4，IFN-rmRNA表达，减少IL-4，IFN-r分泌，纠正Th1、Th2免疫功能紊乱，从而降低抗N2AchR抗体产生。5．重肌灵对EAMG大鼠胸腺细胞凋亡的影响 MG、EAMG存在N2AchR特异性T细胞凋亡的减少，采用TUNEL法，从基因水平观察重肌灵对EAMG大鼠胸腺细胞凋
谭浩翔[7]2007年在《受体骨髓间充质干细胞输注在大鼠原位肝移植中的作用》文中研究说明肝移植是治疗终末期肝病的最佳选择,但术后排斥反应仍是影响患者生存的主要障碍。其中急性排斥反应则较为常见,约70%的肝移植患者有不同程度的急性排斥,是肝移植术后早期肝功能障碍的主要原因。急性排斥反应又称细胞性排斥,是由受体T淋巴细胞被供肝树突状细胞的异源性抗原激活后,受体T淋巴细胞活化聚集于供肝树突状细胞周围,通过分泌细胞因子引起的胆管上皮及静脉内皮细胞损伤。其免疫学表现为Th1细胞产生白介素-2(IL-2)、干扰素-γ(IFN-γ)等细胞因子分泌增加,病理学表现为汇管区混合细胞浸润,小胆管及静脉内皮坏死、脱落等,以术后7-14天最为明显。CD4+Th细胞可分化为Th1和Th2细胞亚群,其中Th1细胞因子通过促进同种抗原特异的细胞毒T细胞和迟发型过敏反应启动排斥反应,Th2细胞因子通过刺激B细胞增殖并产生特异性抗体在慢性移植物排斥反应中发挥作用。Th1/Th2两类细胞所分泌的细胞因子变化是免疫反应的指标,Th1细胞因子高表达可以诱导急性排斥反应,而Th2细胞则可通过抑制Th1细胞因子表达,下调Th1细胞的效应从而有利于免疫耐受的建立。因此Th1/Th2细胞通过彼此产生的细胞因子维持体内免疫状态的平衡,平衡失调则导致急性排斥反应或免疫耐受的发生。目前针对肝移植急性免疫排斥反应大多采用免疫抑制剂,但均不能完全抑制排斥并有诸多副作用。诱导外周免疫耐受减轻或阻止免疫排斥是一种较为理想的方法。骨髓间充质干细胞是一种多向分化潜能性与自我更新的细胞,具有独特的免疫学与替代学特性。替代学方面的研究认为骨髓间充质干细胞在体外具有向肝细胞、内皮细胞、上皮细胞分化的能力,而免疫学方面的研究认为MSC表达低水平的MHCⅡ类分子及Fas配体,不表达T细胞共刺激分子B7-1、B7-2、CD40、CD40L,免疫原性较弱,不激活异基因活化的T淋巴细胞,因此骨髓间充质干细胞具有免疫抑制作用,可能诱导免疫耐受。受体骨髓问充质干细胞源于受体自身,容易获取、培养简单可反复采取,利用骨髓间充质干细胞的特性将受体骨髓问充质干细胞输注到移植肝内是否可以改善急性免疫排斥造成的损伤并可能抑制急性免疫排斥反应?因此本课题首先建立DA→Lewis的原位肝移植急性免疫排斥模型,将Lewis来源的骨髓间充质干细胞输注受体内,观测骨髓间充质干细胞在体内的分布、分化方向以及对肝内细胞因子的影响,以证实受体骨髓间充质干细胞输注在肝移植术后的作用。实验内容共分叁部分:第一章大鼠同种异体原位肝移植模型的建立与病理学检测目的采用DA→Lewis大鼠组合建立肝移植急性免疫排斥模型,观测肝组织急性免疫排斥病理表现。方法①取SD大鼠80只,雌雄不拘,采用改良二袖套法建立原位肝移植模型,术后不予任何免疫抑制剂,观测术后生存状态。②取DA与Lewis大鼠各9只,采用改良二袖套法建立原位肝移植急性免疫排斥模型,术后不予任何免疫抑制剂。观察术后大鼠1d、7d、14d肝组织病理变化以及生存期。结果①原位肝移植模型SD→SD组合手术成功率为96%,术后长期存活(2mon)达90%。②SD→SD组合术后肝组织病理未见免疫排斥现象。③DA→Lewis组合可以产生典型的术后急性免疫排斥反应。④术后大鼠生存期较短,约为12d-16d。结论①改良二袖套法可以建立稳定的大鼠肝移植模型。②SD→SD组合非急性免疫排斥模型,术后可长期存活。③DA→Lewis组合是观测急性免疫排斥的典型组合。④术后如未予免疫抑制剂,Lewis大鼠生存时间短暂。第二章受体骨髓间充质干细胞的获取标记与体内示踪目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞的分离培养与扩增方法,研究标记骨髓间充质干细胞的方法,观测标记后骨髓间充质干细胞输注在大鼠肝移植体内的短期与长期分布。方法①取4周龄约100克Lewis大鼠10只,分离两侧股骨与胫骨用L-DMEM/F12培养基冲洗髓腔。分别用密度梯度离心法与裂红法分离骨髓单个核细胞,贴壁培养法培养、扩增骨髓间充质干细胞。流式细胞仪鉴定第叁代骨髓间充质干细胞的表面标记及细胞周期。②采用CFSE标记骨髓间充质干细胞,建模后经门静脉注入,于术后1d、7d、14d取肝移植模型肝、脾、肺、肾组织,荧光显微镜下观测体内分布情况,以正常Lewis大鼠为阳性对照。③采用Brdu标记骨髓间充质干细胞,建模后经门静脉注入,于术后14d、1mon、2mon取肝移植模型肝、脾、肺、。肾组织,行免疫组织学染色,观测体内分布情况,以正常Lewis大鼠为阳性对照。结果①原代培养24小时开始贴壁,10-14天时细胞贴满瓶底。②P3代培养细胞表型测定CD29阳性率95.3%,CD44阳性率94.7%,CD34阴性率1.8%,CD45阴性率为0.8%。③P3代培养细胞G0/G1期细胞约为82.9%,S+G2+M期的细胞为17.1%。④CFSE可快速高效的标记MSCs,标记率大于95%。⑤术后1d,7d,14d肝组织内有大部分CFSE标记的MSCs聚集,而脾肺肾组织中有CFSE标记的MSCs已经开始减少。⑥MSCs输注正常Lewis大鼠体内1d在肝脾肺肾组织中均有分布,5d后基本消失。⑦BrdU体外MSCs标记率约为95%。⑧肝脏为Brdu阳性细胞主要分布部位,脾肺肾组织仅有少量分布,术后14d、1mon、2mon肝内Brdu阳性细胞表达无明显减少,但术后1mon脾肺肾组织中Brdu阳性细胞消失。⑨正常Lewis大鼠体内1dBrdu标记MSCs偶见表达,在5d均为阴性表达。结论①采用红细胞裂解方法较采用密度梯度离心方法获取的MSCs更为简便。②通过密度梯度离心与红细胞裂解后联合贴壁培养法可获取较为纯化的MSCs。③CFSE是一种快速高效的细胞染色剂,受体MSCs输注移植肝短期内可特异性聚集于肝脏。④应用BrdU标记骨髓问充质干细胞是一种简单有效的标记方式,受体MSCs输注移植肝内长期分布仍以肝脏为主。第叁章受体骨髓间充质干细胞输注对大鼠肝移植术后的影响目的观测输注受体骨髓间充质干细胞对大鼠原位肝移植的影响方法①取DA与Lewis大鼠各30只随机分为3组,A组:仅行原位肝移植术,B组原位肝移植术+MSCs,C组:原位肝移植术+CsA,每组10对。观测各组术后肝功能、比较生存时间差异。②于术后14d、1mon、2mon分别取各组肝组织标本,免疫组化双染色检测Brdu抗体与ALB抗体、CK19抗体、vWF因子抗体的共表达。③于术后1d、7d、14d、1mon分别取各组肝组织标本,采用Luminex液相芯片平台检测IL-2,IL-4,IL-10,IFN_γ等相关细胞因子在肝组织中的含量。结果①A组术后3d进行性恶化,术后10-16d自然死亡。B、C组大鼠在术后14d后逐渐好转,1mon后活动增多体重逐渐增加。②各组肝组织病理学变化A组呈重度急性排斥反应,B组呈轻度急性排斥反应。C组呈中度急性排斥反应。生存期比较B组、C组较A组生存时间明显延长(P＜0.05),B组较C组生存时间明显延长(P＜0.05)。③术后1mon、2mon肝组织内有Brdu与ALB及Brdu与vWF因子的共表达,未见Brdu与CK19的共表达。④各细胞因子IL-2、IL-4、IL-10,IFN_γ在术后1d、7d均有升高,但B组、C组低于A组(P＜0.05),术后14d、1mon B组细胞因子IL-4、IL-10浓度高于C组,B组细胞因子IL-2、IFN_γ浓度低于C组。结论①输注受体骨髓间充质干细胞在肝移植术后不同时期均可缓解肝功能,同时有助于延长生存期,其效果优于CsA。②肝移植术后输注受体骨髓间充质干细胞具有多向分化能力,可以向肝细胞,血管内皮细胞分化,未向胆管上皮细胞分化。③MSCs可以改变T细胞亚群细胞因子的分泌量,在肝移植术后有利于免疫耐受的形成,MSCs的免疫抑制作用可能优于CsA。
李忻红[8]2008年在《消敏颗粒抗Ⅰ型超敏反应的实验研究》文中认为目的研究消敏颗粒抗皮肤、全身Ⅰ型超敏反应的作用并探讨其机制,为临床应用消敏颗粒治疗荨麻疹等Ⅰ型超敏反应性疾病提供理论依据。方法本实验分叁部分进行消敏颗粒抗Ⅰ型超敏反应的研究。首先,进行消敏颗粒抗皮肤Ⅰ型超敏反应的研究,包括利用组胺、5-羟色胺所致小鼠毛细血管通透性增高实验和小鼠耳异种被动皮肤超敏反应(PCA)模型,研究消敏颗粒对组胺及5-羟色胺所致小鼠毛细血管通透性增高、PCA以及足跖肿胀的影响。其次,进行消敏颗粒抗全身Ⅰ型超敏反应的研究,包括利用Compound48/80致小鼠休克及抗原所致豚鼠过敏性休克模型,研究消敏颗粒对动物过敏性休克的影响。最后,对消敏颗粒抗Ⅰ型超敏反应的机制进行探讨,包括消敏颗粒对大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒的影响;荧光测定改良法检测消敏颗粒对大鼠肥大细胞释放组胺的影响;免疫组化法检测消敏颗粒对大鼠肥大细胞释放5-羟色胺的影响;ELISA法检测消敏颗粒对致敏大鼠血清IgE含量的影响;ELISA法检测消敏颗粒对致敏大鼠血清中细胞因子IFN-γ、IL-4的含量的影响;RT-PCR方法检测消敏颗粒对致敏大鼠脾淋巴细胞的IFN-γmRNA、IL-4 mRNA表达的影响;透射电镜观察消敏颗粒对脾组织T细胞、培养脾T细胞凋亡的影响;流式细胞术检测消敏颗粒对血T细胞凋亡的影响。结果1.消敏颗粒对组胺致小鼠毛细血管通透性增高的影响:结果表明,消敏颗粒对组胺致小鼠毛细血管通透性增高有抑制作用,各剂量组与对照组比较均有显着性差异(低剂量组P<0.05,中、高剂量组P<0.01),消敏颗粒低、中、高剂量组呈现明显的量效关系。2.消敏颗粒对5-羟色胺致小鼠毛细血管通透性增高的影响:结果表明,消敏颗粒对5-羟色胺致小鼠毛细血管通透性增高有抑制作用,各剂量组与对照组比较均有显着性差异(P<0.01)。3.消敏颗粒对小鼠耳异种被动皮肤超敏反应(PCA)的影响:结果表明,消敏颗粒各组PCA均明显减轻,与对照组比较均有显着性差异(P<0.01)。4.消敏颗粒对组胺所致小鼠足跖肿胀的影响:结果表明,低剂量组在注射后30min时有一定抑制作用(P<0.05),以后随着时间的延长,作用逐渐减弱。中剂量组和高剂量组在本实验范围内的各时间段均可显着抑制足跖肿胀。5.消敏颗粒对Compound48/80致小鼠休克的影响:结果表明,可导致小鼠休克、死亡,消敏颗粒可以降低其死亡率,高剂量组效果较明显,与模型组比较,有显着性差异(P=0.05)。6.消敏颗粒对抗原所致豚鼠过敏性休克的影响:结果表明,消敏颗粒各组均可延缓其发敏时间,与模型组比较,均有显着性差异(P<0.01)。7.消敏颗粒对大鼠血清IgE生成的影响:结果表明,消敏颗粒可抑制IgE的分泌,各剂量组与模型组比较均有显着性差异(P<0.01)。8.消敏颗粒对大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒的影响:结果表明,与正常组比较,各实验组肥大细胞脱颗粒均增多,差异显着。消敏颗粒各组与模型组比较,均可减少肥大细胞脱颗粒,差异有显着意义(P<0.01)。9.消敏颗粒对大鼠腹腔肥大细胞释放组胺的影响:结果表明,消敏颗粒各组与模型组相比,大鼠腹腔肥大细胞组胺的释放量均明显降低(P<0.01),消敏颗粒高剂量组与扑尔敏组肥大细胞组胺的释放量均低于低剂量组,差异有显着意义(P<0.01)。10.消敏颗粒对大鼠腹腔肥大细胞释放5-羟色胺的影响:结果表明,消敏颗粒各组部分腹腔肥大细胞颗粒脱失,5-羟色胺表达减弱。对细胞进行综合积分可见,消敏颗粒各组均明显高于模型组,差异有显着性意义(P<0.01)。11.消敏颗粒对大鼠血清IFN-γ、IL-4含量的影响:结果表明,消敏颗粒各组大鼠血清IFN-γ含量有增加的趋势,其中以消敏颗粒高剂量组增加更明显,与模型组比较,差异有显着意义(P<0.01)。消敏颗粒各组大鼠血清IL-4含量降低,其中以消敏颗粒高剂量组降低明显,与模型组比较,差异有显着意义(P<0.01)。消敏颗粒组IFN-γ/IL-4高于模型组,差异有显着意义(P<0.01)。12.消敏颗粒对大鼠脾IFN-γmRNA、IL-4mRNA表达的影响:琼脂糖电泳结果表明,消敏颗粒组和扑尔敏组IFN-γDNA经扩增后可见光亮的条带,消敏颗粒高剂量组和扑尔敏组强于其它组。模型组IL-4DNA扩增后其亮度强于正常组和各用药组,正常组条带最暗。相对表达量结果表明,消敏颗粒高剂量组大鼠脾组织IFN-γmRNA的表达增加明显,与模型组比较差异有显着意义(P<0.01)。大鼠脾组织IL-4 mRNA的表达模型组显着高于正常组(P<0.01),消敏颗粒高剂量组表达显着降低(P<0.01)。13.透射电镜观察消敏颗粒对脾组织T细胞凋亡的影响结果:结果表明,消敏颗粒组可见到脾T淋巴细胞早期凋亡表现和典型的凋亡小体。14.透射电镜观察消敏颗粒对脾T细胞凋亡的影响结果:结果表明,模型组的脾T淋巴细胞的结构多趋于正常,发生明显凋亡的细胞较少,偶见坏死脾T淋巴细胞。消敏颗粒组脾T淋巴细胞发生明显的凋亡。15.流式细胞仪检测消敏颗粒对外周血T细胞凋亡的影响结果:结果表明,消敏颗粒组T淋巴细胞凋亡量明显增加。消敏颗粒组与模型组比较,T淋巴细胞凋亡百分率差异有显着性(P<0.01)。结论1.消敏颗粒具有抑制皮肤Ⅰ型超敏反应的作用:能抑制组胺及5-羟色胺致小鼠毛细血管通透性增高;能抑制小鼠异种皮肤被动过敏反应;对组胺所致小鼠足跖肿胀具有抑制作用。2.消敏颗粒具有抑制全身Ⅰ型超敏反应的作用:能降低Compound48/80所致小鼠过敏性休克的死亡率;可以延缓抗原所致豚鼠发敏时间,高剂量组可降低死亡率。3.消敏颗粒具有减少肥大细胞脱颗粒;减少组胺和5-羟色胺的释放;降低血清总IgE含量;增加大鼠血清IFN-γ含量,降低IL-4含量,促进IFN-γmRNA表达,抑制IL-4mRNA表达,使Th1/Th2比例上调;诱导T淋巴细胞凋亡等作用。消敏颗粒不仅可以通过抑制IgE生成,减少肥大细胞等效应细胞释放生物活性介质拮抗Ⅰ型超敏反应,而且可能通过调节Th1/Th2亚群之间的免疫平衡、诱导T淋巴细胞凋亡等作用机制发挥抗Ⅰ型超敏反应作用。
孔庆波[9]2005年在《转移因子增强犬细胞免疫功能的作用机理研究》文中研究指明转移因子(transfer factor,TF)由T 淋巴细胞产生,分子质量小,化学本质为小肽与寡聚核苷酸复合物。TF 能够将供体的细胞免疫功能转移给受体,尤其是非特异性TF 能够提高受体天然免疫和特异性免疫功能的特性使其在人类和多种动物疾病防治中获得普遍应用。弄清TF 增强犬免疫功能的细胞和分子机制,无疑将为TF 临床用于犬病尤其是犬传染病的防治提供理论依据和指导。本研究首先提取制备了研究所需要的猪、犬TF,然后选择杂种牧羊犬作为实验犬,用淋巴细胞转化增殖试验MTT 法、流式细胞技术、ELISA、吞噬杀伤试验MTT 法,检测了实验犬注射猪TF、犬TF 前后不同时间的淋巴细胞增殖效果、T 细胞亚群的变化、在免疫应答调控中起重要作用的细胞因子(IL-2、IL-12、IL-4 和IFN-γ)分泌量的变化、外周血中性粒细胞吞噬杀伤活性的变化。在此基础上,用猪TF 等联合治疗人工感染和自然发病的犬细小病毒病,对猪TF 的效果进行评估。试验获得如下结果:1.制备的猪、犬TF 理化性质相似,所制备的TF 可供本研究使用。2.淋转试验中,PHA-P 在12.5μg/mL 时对犬淋巴细胞有促进增殖的作用,但t 检验分析表明,其促进淋巴细胞增殖的效果并不显着。ConA 在浓度为0.5～2.5μg/mL 范围内均可以显着刺激T 细胞的增殖(P<0.05),且在浓度为2.5μg/mL 时刺激效果最佳。LPS在浓度为40μg/mL 时,能够显着刺激B 细胞增殖;同种、异种TF 均可以单独刺激犬淋巴细胞增殖,但同种TF 的作用效果要优于异种TF。在协同PHA-P 刺激淋巴细胞增殖时,同种TF 的作用在较大的浓度范围内(0.097～12.5mg/mL)能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖,而异种TF 只在较小的浓度范围内(0.097～3.125mg/mL)能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖;但在协同ConA 刺激淋巴细胞增殖时,同种TF 的作用却在较小的浓度范围内(0.097～0.78mg/mL)能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖,而异种TF 只在浓度范围0.78～3.125mg/mL 内能够显着刺激犬淋巴细胞的增殖。注射异种TF 后,在6～10d 内,犬淋巴细胞单独增殖的能力越来越强。注射了异种TF 的犬,其淋巴细胞再次受到TF 单独或协同丝裂原刺激时,淋巴细胞的增殖能力呈现早期(4～6d)下降趋势,后期(6d 后)受到抑制的现象。3.同种、异种TF 均可提高犬外周血淋巴细胞数量,CD4/CD8 比值变化分析证实,外周血增加的淋巴细胞中主要为CD4+ T 细胞。犬注射同种、异种TF 后在20d 内CD4+ T 细胞呈现持续增加的规律。同种TF 促进犬外周血CD4+ T 细胞上升的作用优于异种TF。4.犬注射同种、异种TF,均可提高淋巴细胞分泌IFN-γ。注射犬TF 后第10 天,犬
童彤[10]2010年在《鸡Ⅱ型胶原诱导胶原性关节炎大鼠肠系膜淋巴结主要辅助性T细胞亚群的免疫平衡》文中认为类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性、炎症、系统性的自身免疫性疾病。T细胞在RA的病理机制及病程进展中起重要作用,T淋巴细胞的主要亚群,辅助性T细胞1(Helper T cell 1, Th1)、Th2、Th17和调节性T细胞(regulatory T cells, Treg)因其具有介导炎症、细胞生长和激活的生物学功能,在RA的病程中发挥着极其重要的作用。由于RA的发病原因和病理机制还远未被阐述清楚,目前还没有令人满意的疗法。有文献报道动物关节蛋白类,特别是II型胶原蛋白(type II collagen, CII),在T细胞介导的免疫反应中起关键作用,鸡II型胶原(chicken type II collagen, CCII)是一类由鸡胸部软骨提取出来的蛋白,这类蛋白可以诱导自身免疫性疾病的免疫耐受从而达到治疗作用。Trentham首先报道了CII治疗28例RA患者(均未服免疫抑制剂)的随机对照临床研究,发现口服CII后,患者的关节肿胀指数和压痛指数、15m行走时间的改善程度明显优于安慰剂组。本课题组的早期研究发现:CCII对大鼠佐剂性关节炎(adjuvant arthritis, AA)具有免疫调节作用,可以降低淋巴细胞的增殖反应、降低炎性细胞因子IL-2的水平并降低腹腔巨噬细胞分泌IL-1的功能,从而改善大鼠AA症状。进而本课题组分别在包含236名受试者和503名受试者的II期和III期的CCII临床试验中得出,与甲氨蝶呤(Methotrexate, MTX)组比较,CCII有治疗RA的效果,且不良反应要明显低于MTX组。本实验基于本课题组以往的研究,以肠系膜淋巴结淋巴细胞(mesentric lymph node lymphocytes,MLNLs)为研究对象,研究CCII如何诱导和调节T淋巴细胞亚群的免疫平衡和相关作用。目的:根据CCII对CIA大鼠的足爪肿胀、评分、关节滑膜和肠系膜淋巴结病理形态学的改善作用,观察CCII对CIA大鼠MLNLs的IL-2、IL-4、IL-17和TGF-β水平的影响;分析关节肿胀度与细胞因子IL-2、IL-4、IL-17和TGF-β水平的相关性;在整体、器官、细胞水平上,研究CCII对大鼠CIA的作用。以本课题组以往的研究为基础,以CIA发病的免疫细胞MLNLs为研究突破口,研究抗、促炎性细胞及细胞因子在CIA发病中的可能机制,进一步研究CCII对CIA大鼠MLNcs中主要T细胞亚群的免疫调节作用。方法:大鼠足跖、尾根部、背部皮内多点注射鸡II型胶原(chicken type II collagen, CCII)乳剂制备CIA模型,致炎后眼眶取血检测II型胶原抗体,将大鼠分为5组:正常组(II型胶原抗体阴性);模型组(II型胶原抗体阳性);CCII(10、20、40μg·kg-1·d-1)剂量组(II型胶原抗体阳性)。CCII(10、20、40μg·kg-1·d-1)灌胃给药(intragastric administration, ig)(d14-d21)。足容积法测量继发侧足肿胀、进行多发性关节评分;光学显微镜观察关节滑膜及肠系膜淋巴结的病理变化;活化小鼠脾细胞增殖法检测IL-2水平;酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)检测大鼠MLNcs的IL-4、IL-17和TGF-β的水平;用流式细胞技术分析MLNcs中CD4+CD25+Treg和Th17细胞的比例。结果:1. CCII缓解CIA大鼠关节肿胀、降低关节评分、改善肠系膜淋巴结和关节滑膜的组织的炎症CIA大鼠免疫注射后26天左右炎症反应达到高峰,光镜下可见滑膜组织中滑膜细胞增生明显、层次增多、排列紊乱,滑膜下层纤维组织增生,血管扩张、充血,炎性细胞浸润;肠系膜淋巴结中副皮质区明显扩大;髓质内炎性细胞浸润;淋巴结呈特异性滤泡增生。CCII(10、20、40μg·kg-1·d-1)治疗给药(ig, d18-d25)可明显抑制CIA大鼠的关节肿胀,降低多发性关节炎指数,改善CIA大鼠关节滑膜和肠系膜淋巴结炎症和病理变化。2. CCII抑制炎性细胞因子IL-2和IL-17的分泌,升高抗炎因子IL-4和TGF-β水平,诱导细胞的免疫平衡CCII(10、20、40μg·kg-1·d-1)治疗给药(ig, d18-d25)可降低CIA大鼠过高的IL-2和IL-17水平,上调CIA大鼠MLNLs分泌的过低的IL-4和TGF-β水平,并且流式分析结果表明了CIA大鼠的肠系膜淋巴结中Th17细胞的比例比正常大鼠高,而Treg细胞要比正常大鼠比例低,这说明了CIA大鼠肠系膜淋巴结中炎性细胞大量活化增殖,抗炎细胞被抑制,CCII治疗给药可以降低Th17细胞在CIA大鼠肠系膜淋巴结的活化增殖。CCII抑制了CIA大鼠MLNLs分泌IL-2和IL-17,促进了CIA大鼠MLNLs分泌IL-4和TGF-β,诱导了Th1/Th2和Th17/Treg的免疫平衡。结论:1. CCII治疗给药可明显抑制CIA大鼠的关节肿胀,改善CIA大鼠关节滑膜和肠系膜淋巴结炎症和病理变化,不同程度地下调MLNLs分泌的炎性细胞因子IL-2和IL-17水平,上调抗炎细胞因子IL-4和TGF-β水平。相关性分析显示,CCII缓解CIA大鼠关节肿胀与肠系膜淋巴结的炎症,与其降低MLNLs分泌的炎性细胞因子IL-2和IL-17水平、升高抗炎细胞因子IL-4和TGF-β水平密切相关。2. CCII治疗给药降低CIA大鼠过高的IL-2和IL-17水平,上调CIA大鼠MLNLs分泌IL-4和TGF-β的水平,使被抑制的抗炎细胞重新活化,抑制促炎细胞的增殖,诱导Th1/Th2和Th17/Treg的免疫平衡,是CCII发挥治疗作用的重要机制。
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[10]. 鸡Ⅱ型胶原诱导胶原性关节炎大鼠肠系膜淋巴结主要辅助性T细胞亚群的免疫平衡[D]. 童彤. 安徽医科大学. 2010