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摘要：目的 研究糖尿病肾病大鼠肾脏Ⅰ型1，4，5-三磷酸肌醇受体（IP3R）表达的变化以及AngⅡ受体拮抗剂（ARB）干预后的变化。方法 采用链尿佐菌素腹腔注射制备糖尿病肾病大鼠模型。动物随机分为三组，即正常对照组、糖尿病肾病组和替米沙坦治疗组。8周后分批处死大鼠，应用免疫组织化学、RT-PCR技术检测糖尿病肾病大鼠发病过程中，大鼠肾脏IP3R蛋白质的定位、表达及mRNA表达的变化以及ARB（替米沙坦）干预后的变化。结果 Ⅰ型IP3R主要分布于肾小球系膜细胞和血管平滑肌细胞的胞浆内。在糖尿病肾病大鼠模型中Ⅰ型IP3R表达增强，ARB干预后Ⅰ型IP3R表达减轻，对照组和实验组对照有统计学意义。结论 在糖尿病肾病发病过程中，肾脏Ⅰ型1，4，5-三磷酸肌醇受体表达增强，其mRNA也呈上调趋势，采用ARB干预后可以减少Ⅰ型IP3R在肾脏表达，改变肾脏对缩血管物质的敏感性，达到优化RAS治疗，可预防糖尿病微量白蛋白尿的发生、进展及糖尿病肾病最终发展为终末肾脏疾病。
关键词：大鼠；糖尿病肾病；受体；1，4，5-三磷酸肌醇；替米沙坦
前言
糖尿病肾病（DKD）是糖尿病的主要并发症，细胞内游离钙浓度的变化是维持细胞生理功能的重要基础，是钙离子跨膜转运和细胞内钙库释放、摄取钙离子等动态平衡的结果。细胞内存在的钙释放通道有两种，1.4.5- 三磷酸肌醇受体和兰尼定受体，前者是配体门控钙离子释放通道蛋白，1，4，5-三磷酸肌醇配体与其结合后，自身内部钙离子通道开放，致钙库释放钙离子，诱导及调控信号，从而发挥多种重要物学效应。
大量循证医学证据表明RAS阻断剂如AngⅡ受体拮抗剂（ARB）可预防糖尿病微量白蛋白尿的发生、进展及DN最终发展为终末肾脏疾病。研究发现，AngⅡ等缩血管活性物质可刺激细胞内第二信使1，4，5-三磷酸肌醇（IP3）的产生，IP3与三磷酸肌醇受体（IP3R）结合发生构象改变，进而促进细胞内钙释放和细胞外钙内流。本文旨在探讨糖尿病肾病时肾脏Ⅰ型1，4，5-三磷酸肌醇受体表达的变化，探讨Ⅰ型IP3R在糖尿病肾病肾血管收缩机制中的作用以及ARB干预调节肾脏Ⅰ型IP3R的表达，改变肾脏对缩血管物质的敏感性，达到优化RAS治疗的目的。
1 材料与方法：
1.1材料 健康雄性清洁级SD大鼠30只，6—8周龄，重量200—250g（由郑州大学实验动物中心提供）。链脲佐菌素（STZ）（美国Sigma公司）；Ⅰ型IP3R抗体（组化用，美国Santa Cruz公司）；免疫组织化学试剂盒（北京中山生物技术有限公司）；RT-PCR试剂盒（日本TaKaRa公司）。
1.2 方法
1.2.1 动物模型：健康雄性清洁级SD大鼠30只，6—8周龄，重量200—250g，随机分为3组，即正常对照组（C，n =10）、糖尿病肾病组（D，n =10）和替米沙坦治疗组（T，n =10），在禁食12h后，D组和T组的大鼠采用链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）以新鲜配制的枸橼酸缓冲液（0.1 mol·L-1、pH为4.6）稀释成1%溶液，按60mg·kg-1体重单侧腹腔一次性注射；对照组的大鼠腹腔注射等容积的柠檬酸缓冲液。在注射STZ后第3d用快速血糖仪测定血糖，血糖≥16.65mmol·L-1，各组大鼠自由进食饮水，实验中不予任何降血糖药物。大鼠饮水量、尿量明显增加，体重下降，消瘦，精神差，实验各观测点上，糖尿病组血糖值已经全部超过16.65mmol/L，糖尿病模型复制成功。普通饮食继续喂养3周，用代谢笼收集24h尿液，用磺基水杨酸法，并行空白对照测定24h尿蛋白排泄量，尿蛋白＞30㎎/24h即糖尿病肾病模型成立［1.2］。糖尿病肾病（DKD）模型成立后，T组给予替米沙坦混悬液按40mg·kg-1·d-1一次性灌胃，C组和D组给予同等体积蒸馏水灌胃。
1.2.2 样品收集：各组分别于第8周末，检测大鼠血糖、体重，用代谢笼留取24 h尿标本，测尿量，测定24小时尿蛋白总量。并在上述时间点，采用3%水合氯醛麻醉，经内眦静脉取血，检测肌酐、血脂、血浆白蛋白。同时第8周末各组分别处死30只大鼠。
1.2.3 免疫组化检测：大鼠肾脏经10%福尔马林多聚甲醛中固定后，按梯度酒精脱水，石蜡包埋，切片。按照免疫组织化学试剂盒说明操作。免疫组化结果判断：细胞胞质内棕褐色颗粒为阳性细胞．在高倍镜下选择有代表性视野计数1000个肾皮质细胞中的阳性细胞数．
1.2.4 RT-PCR分析：用Trizol一步法提取肾组织总RNA；紫外分光光度法测定RNA纯度和量；
用RNA稀释液稀释成100ng/ul。按照试剂盒说明两步法扩增Ⅰ型IP3R基因，GAPDH作内参照；Rat IP3R引物序列为：Sense：ggt ttc atc tgc aag cta ata aaa，Antisense：aat gct ttc atg gaa tac tcg gtc. 扩增长度为525bp，内参β-actin的引物序列为sense：cac ccg cga gta caa cct tc.Antisense为：ccc ata ccc acc atc aca cc 扩增长度为：207bp；扩增条件如下：94℃预变性2min，1个循环；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸2min，共30个循环；72℃总延伸6min；琼脂糖凝胶电泳 取5ul扩增产物与缓冲液混合后加入琼脂糖凝胶的加样孔中，进行电泳。电泳条件为2%琼脂糖凝胶，电压4-10v/cm。EB染色，在紫外线投射仪下观察电泳条带，用D-140图像记录分析系统进行分析，目的基因IP3R mRNA的表达量以 IP3R的DNA条带和β-actin 的DNA条带灰度值比值计算。
1.2.5统计学处理：采用SPSS15.0软件分析，实验数据以X±s表示，计量资料组间比较采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2.结果
2.1 动物模型制备结果：糖尿病肾病组大鼠与正常对照组大鼠比较：胆固醇、甘油三酯、肌酐明显升高，血浆白蛋白降低（P＜0.05）；尿量增加，尿蛋白升高（P＜0.05）；替米沙坦治疗组与糖尿病肾病组大鼠比较：胆固醇、甘油三酯、肌酐明显降低，血浆白蛋白升高（P＜0.05）；尿量增加，尿蛋白降低（P＜0.05）。（见表1、表2）
2.2 I型IP3R免疫组织化学染色结果：I型IP3R表达呈很弱的棕褐色信号，主要分布在肾小球系膜细胞和血管平滑肌细胞的胞浆内，而肾小管未见阳性染色。（见表3、图1）
2.3 RT-PCR结果：对照组I型IP3RmRNA水平与正常组相比明显升高，实验组I型IP3RmRNA水平与对照组相比明显降低，差异有统计学意义。（见表4、图2）
三组大鼠IP3R mRNA的表达（琼脂糖电泳）
3.讨论
糖尿病肾病（DKD）是糖尿病的主要并发症，RAS阻断剂如AngⅡ受体拮抗剂（ARB）可预防糖尿病微量白蛋白尿的发生、进展及DKD最终发展为终末肾脏疾病。AngⅡ等缩血管活性物质是通过刺激细胞内第二信使1，4，5三磷酸肌醇（IP3）产生发挥作用的。IP3是胞内钙储存库，存在于内质网中。IP3R与IP3结合后发生构象改变，导致通道开放，内质网中的储备钙被释放到细胞质中，胞质游离钙浓度升高引起细胞收缩［3］。细胞膜上也有IP3R，可直接或间接介导钙内流。因此肾脏IP3R表达的多少与肾脏缩血管物质的敏感性有着密切联系。IP3R共有4种类型，肾脏的Ⅰ型IP3R主要存在于肾小球系膜细胞和血管平滑肌细胞。血管平滑肌细胞收缩引起肾血流量减少；肾小球系膜细胞收缩不仅使肾小球血管阻力增加，还可导致肾小球滤过面积减少；两者均收缩导致肾小球滤过率急剧减少［4］。糖尿病肾病时Ⅰ型IP3R在肾脏表达增加，使肾脏对缩血管物质的敏感性增加，加用ARB药物后可以减少Ⅰ型IP3R在肾脏表达，改变肾脏对缩血管物质的敏感性，达到优化RAS治疗的，可预防糖尿病微量白蛋白尿的发生、进展及DKD最终发展为终末肾脏疾病［5］。实验结果如下：在DKD时Ⅰ型IP3R表达明显增加，可能提高了肾脏对缩血管物质的敏感性，从而导致细胞内钙离子水平骤然升高，使肾脏平滑肌细胞与肾小球系膜细胞收缩，肾血流量减少及肾小球滤过面积减少，肾小球滤过率降低，进而发展为终末期肾病。
参考文献：
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论文作者:刘威
论文发表刊物:《健康世界》2015年10期供稿
论文发表时间:2016/1/20
标签：肾脏论文; 大鼠论文; 肾小球论文; 受体论文; 细胞论文; 糖尿病肾病论文; 血管论文; 《健康世界》2015年10期供稿论文;