1.西藏藏医学院附属医院 西藏拉萨 850000；
2.西藏藏医学院2015级硕士研究生 西藏拉萨 850000；
3.西藏藏医学院2014级硕士研究生 西藏拉萨 850000；
4.西藏藏医学院2017级硕士研究生 西藏拉萨 850000
摘要：目的：采用高效液相色谱法测定余甘子中没食子酸的含量，比较不同提取方式、甲醇体积分数、液料比、温度和提取次数5个影响因子中没食子酸的含量差异。方法：采用Inertsustain C18-5µm（4.6 × 250 mm）色谱柱，甲醇-0.2%磷酸溶液（5：95）为流动相，流速1.0 mL/min，柱温30℃，在273 nm处测定余甘子中没食子酸的含量。结果：没食子酸在线性范围为0.0300 ~ 3.0000 μg，r2 = 1，平均加样回收率为100.55 %，RSD = 0.93 %。结论：该方法操作简便、重复性好、准确可靠，可用于余甘子中没食子酸含量测定。
关键词：余甘子；高效液相色谱法；没食子酸；含量测定
余甘子为大戟科植物余甘子Phyllanthus emblica L.的干燥成熟果实，系藏族习用药材，味甘、酸、涩、凉，具有清热凉血、消食健胃、生津止咳等功效[1]。余甘子中主要含有鞣质、酚酸、黄酮等化学成分，其中没食子酸为其主要的有效成分，也是中国药典2015版的质量控制指标性成分[1-3]。目前，对余甘子不同提取方式及不同甲醇浓度比例中没食子酸的含量测定报道极少。为了充分使用余甘子药用资源，本试验利用高效液相色谱法对余甘子不同提取方式、甲醇体积分数、液料比、温度和提取次数中没食子酸的含量进行测定。
1 仪器与材料
1.1 仪器：岛津LC-20AT高效液相色谱仪，SIL-20A自动进样器，SPA-20A检测器，CTO-20AC柱温箱（SHIMADAZU公司，日本）；mettler toledo分析天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），ohaus分析天平（奥豪斯，美国）；KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 试药：余甘子药材果实（PE，西藏藏医学院附属医院）；没食子酸对照品（GA，上海麦克林生化科技有限公司，批号c10076412，纯度>99%）；Milli-Q超纯水（密理博，美国）；甲醇为色谱纯，磷酸（色谱纯，阿拉丁）。
2 实验方法与结果
2.1 色谱条件与系统适用性试验：色谱柱：岛津C18（4.6 × 250 mm，5um）；流动相：甲醇-0.2%磷酸溶液（5：95，V/V）；流速：1.0 mL/min；检测波长：273 nm；柱温：30℃；进样量10 μL。在上述色谱条件下进行测定，标准品和待测溶液中GA的理论塔板数分别为14130和14740，均大于2015版《中国药典》规定的2000，能达到检测要求；分离度均大于2.3，各成分基线分离很好，没食子酸的保留时间为12.65 min，见图1。
图1 没食子酸对照品（A）和余甘子（B）的HPLC图
2.2对照品溶液的制备
精密称取3.00 mg 没食子酸对照品，置于10 mL量瓶中，加50 %甲醇-水至刻度，摇匀，作为对照品贮备液（每1 mL含没食子酸300.00 μg）。
2.3供试品溶液的制备
2.3.1提取方式和甲醇体积分数的考察
（1）加热回流提取：分别取PE粉末（过三号筛）约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入30 %、40 %、50 %、60 %和70 %甲醇-水50 mL，称定重量，加热回流90℃，1 h，放冷，再称定重量，分别用相应的甲醇浓度补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。试验平行3次。（2）超声提取：分别取PE粉末（过三号筛）约0.1 g精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入30 %、40 %、50 %、60 %和70 %甲醇-水50 mL，称定重量，超声提取60℃，200 w，1 h，放冷，再称定重量，分别用相应的甲醇体积分数（30 %、40 %、50 %、60 %和70 %甲醇-水）补足减失的重量，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。试验平行3次。
2.3.2料液比的考察
分别取PE粉末（过三号筛）约0.1 g精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50 %甲醇-水1、2、3、4、5 mL，称定重量，超声提取60℃，200 w，1 h，放冷，再称重，加50 %甲醇-水补足减失的重量，滤过，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液，平行3次。
2.3.3温度的考察
分别取PE粉末（过三号筛）约0.1 g精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50 %甲醇-水5 mL，称定重量，超声提取温度分别为20、30、40、50和60℃，200 w，1 h，放冷，再称重，加50 %甲醇-水补足减失的重量，滤过，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液，平行3次。
2.3.4提取次数的考察
分别取PE粉末（过三号筛）约0.1 g精密称定，置具塞锥形瓶中，分别精密加入50 %甲醇-水5 mL，称定重量，超声提取温度为60℃，200 w，0.5 h/次，放冷，再称重，加50 %甲醇-水补足减失的重量，滤过，取续滤液，用0.45 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液，平行3次。
2.4线性关系考察
分别精密吸取“2.2”项下的对照品储备液0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.5 mL，依次置于5 mL容量瓶中，加50 %甲醇溶液稀释并定容到刻度，摇匀，连同储备液共得到7份浓度分别为3.00、6.00、15.00、30.00、60.00、150.00和300.00 μg·mL-1的系列标准曲线溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，以对照品浓度为横坐标（x），峰面积为纵坐标（y），绘制标准曲线，得到回归方程为y = 36152x-17666（r2 = 1）。结果表明，没食子酸在0.0300 ~ 3.0000 μg范围内呈现良好的线性关系。
2.5精密度试验
精密吸取“2.2.2”项下的对照品储备液，按“2.3”项下色谱条件连续进样测定6次，记录没食子酸的峰面积。结果表明，没食子酸峰面积的RSD为0.02 %（n = 6），表明仪器精密度良好。
2.6稳定性试验
精密吸取同一供试品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件下分别于放置0、2、4、6、12、24、48 h时进样测试，分别记录没食子酸的峰面积。结果表明，没食子酸峰面积的RSD为0.21 %（n = 7），表明供试品溶液在48 h内很稳定。
2.7重复性试验
精密吸取同一批余甘子粉末6份，按 “2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录没食子酸的峰面积。结果表明，加热回流提取和超声提取计算出没食子酸的平均含量分别为2.24 %（RSD = 0.73 %，n = 6）和2.16 %（RSD = 0.77 %，n = 6），表明该方法重复性良好。
2.8加样回收试验
精密吸取同一批余甘子粉末约50 mg，6份，置于具塞锥形瓶中，分别加入810 µL质量浓度为1.228 mg·mL-1的没食子酸，按“2.3”项下方法制成供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，记录没食子酸的峰面积。结果表明，该方法的平均加样回收率为100.55 %（RSD = 0.93 %，n = 6）。
2.9供试品溶液的测定
精密吸取“2.3”项下的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，测定没食子酸的峰面积，计算含量，结果见表1和图1。
表1 余甘子中没食子酸的含量（按干燥品计，n = 3）
图1 液料比（a）、温度（b）、提取次数（c）对没食子酸的影响
3 结果与讨论
没食子酸是余甘子的主要活性成分，也是中国药典含量测定的指标性成分，因此优化余甘子中没食子酸的提取工艺是非常重要的。本试验以甲醇作为提取溶剂，考察了不同提取方式（加热回流提取和超声提取）、甲醇体积分数（30%、40%、50%、60%和70%甲醇-水）、液料比（10：1、20：1、30：1、40：1和50：1）、温度（20、30、40、50和60℃）和提取次数（1、2、3和4次）对余甘子中没食子酸的浸出率，其中加热回流提取方式在不同甲醇体积分数下没食子酸的提取率均高于超声提取方式，且加热回流提取中40%甲醇-水为最佳提取体积分数。此外，液料比40：1（mL：g）、水浴温度50℃、提取次数为3次单因素提取余甘子中没食子酸的最佳工艺。
综上所述，本实验采用HPLC 法测定藏药余甘子中没食子酸，该方法操作简便、重复性好，可用于余甘子中没食子酸含量的测定。
参考文献：
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].2015年版.北京：中国医药科技出版社，2015：179.
[2]王辉.余甘子的化学成分和药理作用研究进展[J].中国现代中药，2011，13（11）：52-56.
[3]轩辕欢，魏敏，田红林，等.HPLC法测定余甘子不同提取部位中没食子酸的含量[J].中国药房，20151，26（33）：4743-4745.
Δ基金项目：2015年西藏自治区第一批重点科技计划项目–藏药“哲布松觉”基础研究（2015-71-2）
作者简介：多杰仁青（1971.8 –）青海循化人，西藏藏医学院附属医院工作，副教授，从事藏药基础研究。贡巴加，通讯作者。
论文作者:多杰仁青,边巴,贡巴加,扎西东智
论文发表刊物:《健康世界》2018年第13期
论文发表时间:2018/8/24
标签：甲醇论文; 精密论文; 溶液论文; 色谱论文; 含量论文; 超声论文; 重量论文; 《健康世界》2018年第13期论文;