袁红雨[1]2003年在《水稻幼苗中褐飞虱应答基因的克隆及功能分析》文中提出褐飞虱(Nilaparvata lugens St(?)l)是水稻的主要害虫之一，它刺吸水稻韧皮部汁液，干扰光合产物由源向库的运输，影响水稻的生长和发育。大量褐飞虱取食会引起水稻的叶片干枯，分蘖萎蔫，形成飞虱火烧。 以褐飞虱取食32h的水稻幼苗及未受褐飞虱伤害的水稻幼苗为作为对比材料构建了正向和反向消减cDNA文库。以褐飞虱取食的水稻幼苗作为Tester，以未被取食的水稻幼苗作为Driver，构建正向消减cDNA文库，以富集受褐飞虱取食诱导的基因。以未被取食的水稻幼苗作为Tester，以褐飞虱取食的水稻幼苗作为Driver，构建反向消减cDNA文库，以富集受褐飞虱取食抑制的基因。随机从正向消减cDNA文库中挑选16个白色菌落提取质粒，用T7和M13 Reverse通用引物扩增插入片段，发现插入片段的长度位于100 bp至900 bp之间。以在受褐飞虱为害的水稻幼苗中特异表达的基因(BpHi008A)为探针，通过斑点印迹分析发现在抑制消减后的cDNA池中，目的基因得到有效富集。抑制消减cDNA文库的建立为进一步筛选、克隆受褐飞虱取食调节的基因，分析水稻幼苗对褐飞虱为害的反应奠定了基础。 利用反向总RNA斑点印迹分析和Northern杂交验证，从正向和反向消减cDNA文库中筛选到了27个差异表达的基因，其中25个基因受褐飞虱取食的诱导，两个基因受褐飞虱取食的抑制。在这27个基因中有19个克隆与编码已知功能蛋白的基因有显着的同源性，它们分别参与蛋白质的折迭与降解、蛋白质与蛋白质的相互作用及信号传递、脂类代谢、胁迫反应、物质运输和细胞生长等。有6个克隆与未知功能的基因有显着同源性。另有2个克隆在GenBank中没有发现其同源序列，为新的水稻cDNA。总体上，参与胁迫反应和衰老的基因在褐飞虱取食后表达增强;而光合作用基因以及细胞生长相关基因的表达受到抑制。根据褐飞虱为害方式和分离到的差异表达的基因，可以推测褐飞虱取食对水稻幼苗光合作用的抑制以及对水稻幼苗糖份的过分消耗，激活了植株的衰老过程，最终导致了水稻幼苗的死亡。 以褐飞虱取食32h的水稻幼苗为材料构建了cDNA文库，初始文库含3，2x 106个克隆，重组率为86%，取l.oxl护个克隆子扩增一次，收集到80 ml滴度为1.ZXI扩pfu/mL的扩增文库。随机挑取20个克隆以T7和M13reverse为引物进行PCR扩增，以鉴定插入片段的大小，结果发现多数片段的长度在1~4.0 Kb左右，少数片段在4Kb以上，个别片段在6Kb左右。综合上述分析结果可以认为该文库可以用于相关研究。文库插入片段的大小符合建库要求。 分别以叁个差异表达的EST，助角.口以琢汽匆刃和助历006，为探针筛选cDNA文库分离得到它们的全长CDNA，分别称为助左艺口口夕魂，助从刃似刁和助万艺OO6A。 你角日口以多】的长度为504 bp，编码一由82个氨基酸残基构成的蛋白质(BpHIOOSA)，BpHIOOSA与小麦中受病原菌诱导的Wirl蛋白质家族有37%的同源性。与wirl蛋白类似，BpHIOOSA有一个疏水的N一末端和一个亲水的富含甘氨酸及脯氨酸的C一末端。网上预测BpHIOOSA为一跨膜蛋白，其C一末端位于细胞外。基因组Southern分析证明，BpHIOOSA在基因组中以单拷贝的形式存在。助角.0夕夕理除受褐飞虱取食诱导外，还受机械伤害和乙烯俐的诱任己、士。 助从了口口24代表受褐飞虱取食抑制的水稻基因，编码一种由173个氨基酸残基组成的蛋白质，该蛋白具有两个CBS结构域，并且与哺乳动物的肌昔一5’一单磷酸脱氢酶具有同源性。 助从)00西刀长度为1 943 bp，含有一由795 bp组成的完整的阅读框。5’非翻译区915 bp，有一个与ORF同框的终止密码子(TGA)，BpHIOO6A蛋白与拟南芥的四氯氢醒还原性脱卤素酶相关蛋白有61%同源性。该蛋白含有谷肤昔肤S一转移酶的N一末端结构域和C一末端结构域，因此，为谷肤营肤S一转移酶超家族的成员。助角尸00浏基因的表达受褐飞虱取食的诱导。 将助角，0以多空基因的编码区正向插入到超量表达载体p以上，并转化粳稻品种H1493，共获得56株T0代独立转化植株，利用助价O口民粗的CDNA序列设计一对引物扩增14株转化植株的DNA，12株呈阳性扩增，阳性率约为86%。采用转录后基因沉默技术构建助班0口旦咬的双链RNA载体，并转化H1493，共获得独立转化植株52株，利用新霉素磷酸转移酶基因H的一对引物扩增16株转基因植株，12株呈阳性扩增，阳性率为75%。
魏哲[2]2010年在《水稻对褐飞虱取食应答的蛋白质组学研究》文中指出褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal)是一种典型的植物韧皮部取食昆虫,是水稻(Oryza sativa L.)最严重的害虫之一。在感性水稻上,褐飞虱会造成植株的叶面积、光合速率、氮含量、叶绿素含量乃至干重的减少,同时,褐飞虱产卵量、卵和若虫存活率较高。田间褐飞虱的大量爆发通常导致“火虱烧”现象,即水稻叶和分蘖的枯萎变黄,造成水稻产量的急剧降低。褐飞虱还传播草状丛矮病和齿叶矮缩病等水稻病毒病。而在抗性水稻上,褐飞虱若虫的发育被扰乱,存活率明显比感性水稻上的低,成虫的产卵也被严重抑制。抗性水稻能够抑制褐飞虱种群的增长,降低植株受到的伤害并最终减少褐飞虱取食造成的产量损失。在水稻生产中,推广种植抗性品种是最有效和最环保的控制褐飞虱的方法。蛋白质组学已成为在蛋白质水平上分析生物体生理变化强有力的工具,但目前应用此技术对水稻褐飞虱取食应答的研究还很少。与高灵敏度质谱技术联用的相对定量蛋白质组学分析,由于其高通量、重复性和灵敏度特点,越来越多地应用于关键生物问题的研究。为了探讨防御相关蛋白在抗感性水稻株系应答褐飞虱过程中的作用,我们利用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tag for relative and absolute quantitation, iTRAQ)蛋白质组分析,筛选水稻抗褐飞虱相关的蛋白质。我们提取了褐飞虱取食96小时后的水稻叶鞘蛋白质,结果显示多种蛋白质表达量在褐飞虱取食后发生了显着性变化。经iTRAQ鉴定,这些蛋白包括3个JA合成蛋白质(alpah-DOX, AOS和AOC),7个氧胁迫应答蛋白(CATA, APX2和5个POXs),3个β-葡聚糖酶(Gns1, Gns4和Gns5),3个蛋白激酶(CRK5,CRK6和atypical RLK),1个蛋白网格蛋白,1个甘氨酸分解系统H蛋白,5个光合作用相关蛋白和4个水通道蛋白。其中AOC, CATA,3个POX, Gns1,Gns5,3个蛋白激酶和网格蛋白更多地在感性水稻株系中被诱导。随后,我们用荧光定量PCR分析了8个重要蛋白质基因在抗、感性水稻中受褐飞虱取食后的表达情况。这8个基因的表达趋势与蛋白质相似。蛋白质组和基因表达的结果显示,抗性水稻株系(含抗性基因BPH15)和感性水稻株系中褐飞虱诱导的与伤害胁迫,氧胁迫和病原物胁迫相关的应答反应非常相似。而与胼胝质分解相关的蛋白质和基因在抗性水稻株系中表达水平不受褐飞虱影响,但甘氨酸分解系统H蛋白在抗性水稻株系受褐飞虱取食后表达水平上升了2倍,暗示抗性水稻中存在着高效特异的防御机制。我们认为抗感性水稻针对褐飞虱采取了不同的防御策略,抗性基因BPH15在其中起着决定性的作用。韧皮部是植物运输、分配光合作用合成的有机代谢产物的重要通道,它也是刺吸式昆虫取食植物的目标组织。除了糖和氨基酸这样的小分子外,高等陆生植物韧皮部汁液中还含有蛋白质。韧皮部汁液中的许多蛋白质参与了植物伤害和防御应答,并可能影响植物与昆虫间的相互作用。我们利用同位素标记的iTRAQ技术分析了感性水稻9311和抗性水稻B5叶鞘韧皮部汁液中的蛋白质。结果表明,韧皮部汁液蛋白质表达量受到了褐飞虱取食的显着影响。一共鉴定了238种韧皮部汁液蛋白质,涉及的功能包括糖代谢,活性氧／氧化还原反应,蛋白质修饰,信号传递等。其中,47种蛋白质在9311和B5之间表达量有着显着不同。在9311中54种蛋白质的含量在褐飞虱取食96小时后发生了显着变化；在B5中40种蛋白质发生了显着变化；11个蛋白质在9311和B5中含量变化的方向相反。我们的研究结果表明,在韧皮部汁液蛋白质水平上9311和B5对褐飞虱的应答是不同的。我们从中选取了5个重要的蛋白质,进行了原位杂交分析,试图从mRNA的水平研究这5个蛋白质在水稻韧皮部的表达模式。其中3个蛋白质在韧皮部检测到了阳性信号。为了进一步筛选韧皮部特异表达基因,我们采用激光显微切割技术收集了水稻韧皮部细胞和薄壁细胞,提取微量RNA,结合RNA体外线性扩增,获得了用于RT-PCR分析的纯净组织细胞RNA,用于进一步研究RGAP、Serpin、WDS和TCTP这4个基因在水稻韧皮部的表达模式,结果显示它们在韧皮部特异表达。我们对Serpin和Serpin的启动子进行了不同长度5’端缺失分析,以寻找控制维管束特异表达的区段和元件。
何青, 袁红雨[3]2005年在《受褐飞虱取食的水稻幼苗的抑制消减cDNA文库的构建及筛选》文中指出采用抑制消减杂交方法,以褐飞虱取食32h的水稻幼苗及未受褐飞虱取食的水稻幼苗为作为对比材料构建了消减cDNA文库,以分离水稻幼苗中褐飞虱应答基因。随机从消减cDNA文库中挑选16个白色菌落提取质粒,进行PCR扩增,发现插入片段的长度位于100～900bp之间。以在受褐飞虱取食的水稻幼苗中特异表达的基因(BpHi008A)为探针,通过斑点印迹分析发现在抑制消减后的cDNA池中,目的基因得到有效富集。利用反向总RNA斑点印迹分析和Northern杂交验证,从消减cDNA文库中筛选到了25个基因受褐飞虱取食的诱导。其中有17个克隆与编码已知功能蛋白的基因有显着的同源性,它们分别参与蛋白质的折迭与降解、蛋白质与蛋白质的相互作用及信号传递、脂类代谢、胁迫反应、物质运输和细胞生长等。总体上,参与胁迫反应和衰老的基因在褐飞虱取食后表达增强。
汪仁[4]2006年在《水稻脂氧合酶基因OsLOX1的克隆功能分析》文中研究表明本研究通过设计简并引物、RT-PCR扩增并结合RACE方法克隆得到水稻脂氧合酶基因OsLOX1，原核表达并结合生化分析方法测定OsLOX1的酶学特性，对该基因的结构特点、表达特性进行了研究。在此基础上，利用农杆菌介导将正义和反义OsLOX1基因导入水稻植株，探讨OsLOX1在植物体内的生理功能及其与抗虫性的关系。研究结果如下：1水稻种子成熟和萌发过程中脂氧合酶同工酶活力分析利用本实验室筛选到的LOX-3缺失突变体北陆PL2和正常的水稻品种越光，研究种子成熟及萌发过程中LOX活性的变化规律，发现2个水稻品种在种子成熟及萌发过程中LOX活性变化规律基本一致，即开花后的10—25天活性持续升高，以后趋于下降，但在LOX-3缺失的品种(北陆PL2)中变化很小；在萌发初期LOX活性迅速升高，浸水萌发后2天达到峰值，然后随萌发时间的延长而下降。同工酶分析显示，在水稻成熟过程中种子LOX-3表达水平及活性都显着高于其它两种酶，而在种子萌发过程中LOX-2表达水平和活性占优势，LOX-1则在两种情况下都显示较低的表达水平和活性。研究也进一步证明北陆PL2是LOX-3缺失的水稻品种。2水稻成熟过程种胚RNA提取方法的建立建立了一种全新、简单的提取水稻种胚RNA的CTAB-LiCl提取法，可在不用液氮的室温下有效地排种胚中大量带有的多糖和本身脂质的干扰，所得RNA样品经紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳分析证明具有较高的纯度和完整性，并可进一步满足RT-PCR、Northern印迹以及cDNA文库构建的实验需要，适用于富含多糖和脂质的植物组织RNA的提取。3水稻种子脂氧合酶基因OsLOX1的克隆、序列分析与表达规律研究根据脂氧合酶的保守序列设计简并引物，利用RT-PCR方法，从水稻种胚中克隆了一个新的脂氧合酶基因cDNA片段。进一步用5'-RACE和3'-RACE的方法得到该基因3154bp的全长cDNA(OsLOX1，GenBank登录号：DQ389164)。进一步克隆了OsLOX1的基因组DNA，OsLOX1基因具有9个外元，8个内元。Southern分析显示该基因在基因组中是单拷贝克隆。分析了该基因启动子序列，发现该启动子含有种子特异表达的顺式元件和多个受伤害以及茉莉酸诱导的顺式作用元件。组织表达谱分析表明，OsLOX1在未成熟胚、萌发过程中的种子及幼苗都以较低的水平表达，在正常的根、茎和叶中都不表达，而叁叶期的幼苗经过伤害诱导3小时后OsLOX1表达量最高，且褐飞虱取食后其转录物表达量也急剧升高，至6小时达到最高值。这些结果都表明，OsLOX1的表达受生物和非生物逆境胁迫诱导，参与水稻的防御反应；另外，该酶还参与水稻的生长发育过程。4水稻种子脂氧合酶OsLOX1在大肠杆菌中的表达与蛋白特性研究以本实验室克隆到的水稻种子脂氧合酶OsLOX1全长cDNA为模板，用含有特异酶切位点的P1、P2为引物，通过PCR方法得到该基因的编码框全长。将其构建到大肠杆菌表达载体pET30(+)上，转化进BL21(DE3)菌株，获得含OsLOX1的重组工程菌。经过IPTG诱导，水稻脂氧合酶基因OsLOX1的表达产物在表达菌株中大量积累。诱导16小时后用超声波破碎仪裂解表达菌株，裂解液用组氨酸标签试剂盒进行纯化和复性。复性后的蛋白以亚油酸为底物进行酶活测定，结果显示，该蛋白具有明显的脂氧合酶催化活性。利用比色法测得该酶的最适温度为30℃及最适PH值4.8。本实验以原核表达的方法得到、并使用组氨酸标记试剂盒纯化出具有生理活性的水稻种子脂氧合酶OsLOX1，为植物种子脂氧合酶的研究提供了一种可靠的供选择方法，也为更好地研究水稻种子脂氧合酶OsLOX1的结构与功能的关系提供了良好的材料和方法。研究的结果也进一步表明本试验所克隆的基因OsLOX1编码的蛋白可能是水稻脂氧合酶-1(LOX-1)。5农杆菌介导获得转正义和反义OsLOX1基因水稻植株及其抗虫性鉴定利用农杆菌介导的方法，将含有水稻脂氧合酶基因OsLOX1的两个双元载体pLOX1S(35SPro．5’+OsLOX1 cDNA+NosTer3’)，pLOX1A(35SPro．5’+antisene-OsLOX1 cDNA+NosTer3’)，转入粳稻栽培品种北陆PL2中，共得到46个独立的转基因植株。经过潮霉素筛选叶片和PCR验证确定得到32个阳性的转基因水稻植株，阳性率为69.6％。潮霉素筛选叶片、种子和Southern blot等检测都表明，目的基因已经整合到水稻基因组中。RT-PCR、酶活测定的结果都表明，目的基因在转基因水稻中有不同程度的表达。对部分转基因植株进行褐飞虱的鉴定发现，与未转化的对照植株相比，转反义基因的水稻植株降低对褐飞虱的抗性；一部分转正义基因水稻植株能提高对褐飞虱的抗性，而另一部分转正义基因植株由于共抑制的结果也表现降低对褐飞虱的抗性。
杜霸[5]2015年在《OsCEBiP与OsSerpin基因的抗虫功能研究》文中提出水稻是世界大多数人口的主要粮食作物,其产量对于粮食安全和减少贫困具有重要意义。褐飞虱是对水稻危害最为严重的害虫之一,它通过口针刺穿水稻组织吸食初皮部营养物质而对水稻植株造成危害。在大田生产中,褐飞风持续取食会消耗光合作用产物从而阻碍水稻生长,引起植株蒌蔫,造成减产甚至颗粒无收,这种现象被称为"飞风火烧”。种植抗性水稻来防御害虫是一个资源节约型、环境友好型的举措。深入研究和理解水稻的抗性机制对通过分子设计培育抗虫水稻品种具有重要实践意义。植物是固着生物,不断遭受着外界环境中细菌、真菌和昆虫等入侵者的危害。因此,植物通过受体蛋白识别病程/取食相关分子模式(Pathogen/Herbivory-associated molecular patterns,PAMPs/HAMPs)而触发免疫反应(PAMPs/HAMPs-triggered immunity,PTI/HTI)来应对这些入侵者的危害,该免疫反应在植物基础抗性中发挥着关键作用。几丁质就是许多病原菌的PAMPs分子,细胞膜的表面受体蛋白OsCEBiP是几丁质激发子结合蛋白,它通过胞外2个LysM基序识别几丁质,从而介导了植物对病原菌的PTI免疫反应。我们之前在抗虫和感虫水稻轫皮部汁液蛋白质组中鉴定出了OsCEBiP蛋白,它是受褐飞风取食诱导上调表达的,推测OsCEBiP是初皮部特异表达的蛋白并参与了水稻对褐飞虱的防御反应。首先,我们克隆了基因的启动子,构建了6个全长和截短启动子载体转化水稻合江19,分别获得了独立的单拷贝纯合转基因植株。通过检测报告基因的表达来比较分析了这些启动子的时空特异性。结果表明C0.6,C0.9,C1.3,C1.8启动子都能驱动报告基因在维管束韧皮部细胞中表达,C0.2的表达量最强,随着启动子长度越长,其表达强度逐渐减弱。同时我们也分析出了一些可能与组织特异表达相关的顺式作用元件。然后,为了研究基因是否参与了对褐飞风的防御反应以及它的抗虫功能,我们获得了两个OsCEBiP突变体株系,oscebip-1是基因敲除植株,oscebip-2是过表达植株。同时也利用农杆菌介导的遗传转化方法获得了超量表达和RNAi抑制转基因植株。褐飞虱在oscebip-1上取食后的蜜露量是显着多于在oscebip-2上取食后的蜜露量。宿主选择性实验也表明与oscebip-2相比,褐飞虱更倾向于聚集在oscebip-1植株上。这些实验表明OsCEBiP基因敲除的水稻增加了对褐飞虱敏感性。进一步研究表明褐飞风取食能引起植株胼胝质沉积,抗性相关基因的上调表达,而该类反应在oscebip-】株系中受到了明显抑制。这些结果表明0?(?^:历尸除了介导植物对病原菌的防御反应外(PTI)也参与了对植食性昆虫的防御反应(HTI)。为了分离出OsCEBiP所识别的来源于褐飞风的分子,我们把褐飞虱虫体研磨成粉末,分成了可溶性上清组分和不可溶沉淀组分。在本文中,我们发现褐飞虱虫体沉淀组分同几丁质一样能诱导oscebip-2和野生型植株中活性氧爆发,胼胝质沉积和防御基因的表达,而这些反应在oscebip-1植株中受到了抑制,表明褐飞风虫体沉淀能诱导水稻的防御反应PTI/HTI,而且这些防御反应是依赖于OsCEBiP的。有研宄表明褐飞虱虫体沉淀的主要成分就是几丁质,本实验表明几丁质也能作为褐飞风的HAMPs而促发HTI。此外,我们还发现褐飞风虫体可溶性上清组分能抑制几丁质诱导的氧爆发。前人研究表明病原菌和昆虫能分泌效应子蛋白来抑制植物这层先天免疫反应。为了分离出褐飞虱其他可能的HAMPs分子和效应蛋白,我们通过酵母双杂交实验筛选了褐飞虱酵母文库。通过RACE扩增技术得到褐飞风基因全长后,进行“点对点”验证,目前得到了几个表皮蛋白、凝结蛋白、几个糖蛋白等,这些候选互作蛋白的功能还需要实验进一步验证。OsCEBiP是水稻初皮部特异表达的细胞表面受体蛋白,它能识别褐飞虱虫体沉淀组分,引起水稻的氧爆发,胼胝质沉积和防御基因的上调表达。而褐飞虱虫体可溶性上清却能抑制几丁质诱导的氧爆发。这些结果有利于我们加深理解asCfi■历P在植物免疫系统中的功能,有利于理解植物对刺吸式昆虫的防御反应的机制。蛋白酶抑制剂在保护植物以防御朝皮部取食昆虫方面具有很大的应用前景。大部分丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的成员都能可逆地抑制丝氨酸蛋白酶或半耽氨酸蛋白酶的活性。动物丝氨酸蛋白酶抑制剂在先天免疫,血液凝固和发育等方面发挥了一系列生物学功能。而在植物中它们的生物学功能尚不清楚。丝氨酸蛋白酶抑制剂参与到了各个生物学过程中,调控着蛋白降解级联反应,故推测其可能参与到水稻对褐飞虱的防御反应过程中。在本研究中,我们从抗性水稻中克隆了一个丝氨酸蛋白酶抑制剂基因(ChSerpin、。之前激光显微切割和RT-PCR分析了该基因在勒皮部细胞中特异表达,所以我们构建了5个全长和截短启动子载体转化水稻,分别获得了独立的单拷贝转基因株系。由于启动子活性低,在转基因植株中检测不到GUS报告基因的表达。基因在各个器官中都有表达,包括幼叶,成熟莲,成熟叶等。此外,褐飞虱取食后该基因表达上调4倍之多。然后我们对进行了超量表达RNAi抑制的转基因研究。宿主选择性实验表明与超量表达株系相比,褐飞虱更倾向于聚集在RNAi抑制株系上。褐飞风取食超量表达株系的蜜露量少于其取食野生型的蜜露量,而褐飞风取食RNAi抑制株系的蜜露量与取食野生型之间无显着性差异。最后,我们尝试研究OsSeipin的蛋白活性。这些结果表明基因在植物防御植食性昆虫方面发挥着重要作用,有利于我们培育出抗褐飞虱的优良水稻品种。
刘裕强[6]2009年在《水稻抗褐飞虱基因的分子定位及其抗性机制的初探》文中研究表明褐飞虱是危害亚洲稻区的主要害虫之一。成虫和若虫群集于稻丛基部,刺吸茎叶组织汁液,消耗稻株养分,使谷粒不饱满,千粒重减轻,瘪谷率增加；刺吸取食时分泌的凝固性唾液形成“口针鞘”,阻碍稻株体内水分和养分输导；虫量多、受害重时,稻株下部变黑、腐烂发臭和瘫痪倒状,称为“虱烧”(Hopper burn),俗称“冒穿”,给水稻生产带来严重的影响。此外,褐飞虱还是传播水稻病毒病—草状丛矮病(Grass Stunt)和齿叶矮缩病(Ragged Stunt)的虫媒。长期以来,对褐飞虱的防治主要依赖化学农药。但是广谱杀虫剂的长期使用,在灭杀褐飞虱的同时,往往也杀死或驱赶了褐飞虱天敌,破坏了褐飞虱与天敌的生态平衡,导致褐飞虱数量大量增加；此外,化学药剂的使用不可避免地对自然环境造成污染和破坏。利用品种抗性被认为是防治褐飞虱为害的最佳途径之一。然而,在育种家努力选育一个又一个抗虫品种以抵抗褐飞虱为害的同时,褐飞虱生物型的改变相继克服了水稻品种的抗性。自1973年以来,IRRI先后育成和推出了具有Bph1,bph2和Bph3基因的抗褐飞虱水稻品种,对褐飞虱的防治起到了巨大的作用,然而数年后这些抗虫品种抗性又先后丧失。因而,不断挖掘和利用新的抗褐飞虱主基因,选育具有持久抗虫性的水稻品种,已成为防治褐飞虱危害的首要任务。抗虫基因的分离与克隆,不仅有助于阐明水稻抗褐飞虱的分子机制,而且可以加快其在育种中的应用。精细定位是图位克隆的关键步骤,同时抗性基因紧密连锁分子标记的开发与鉴定,也为抗褐飞虱基因的利用提供了有利的工具。然而即使一个基因被精细定位在较小的染色体区间内,但仍然会存在多个候选基因。但如果已经清楚了该基因的作用机制,便可以为目标基因的确定提供依据,加速目标基因的分离和克隆；还将更加有利于提高其在生产上的利用效率。抗虫机制的激活往往涉及到一系列的信号调控网络,而现有的研究表明,系统素、茉莉酸、水杨酸、ABA、乙烯和一些过氧化物等信号分子在植物的抗虫调控网络中起着十分重要的作用.本研究从抗虫的叁机制(趋避性,抗生性和耐虫性)对12份抗虫品种的抗性类型进行了划分,为后面的基因分离奠定了一定的基础；完成了一个耐虫主基因BPH20的精细定位；研究了褐飞虱取食对SA,JA和乙烯合成关键酶活性及过氧化氢含量的影响,并构建了SA, JA和乙烯合成相关基因的干扰载体,获得了相应的转基因植株；全面阐述了NO作为一个重要的信号分子参与了水稻对褐飞虱的防御反应；同时,分析了一个越南抗褐飞虱品种抗褐飞虱的遗传基础。有关研究结果如下：1抗褐飞虱水稻品种上褐飞虱取食行为研究从水稻抗虫的叁种机制：抗生性(antibiosis)、趋避性(antixosis)、耐虫性(tolerance.)入手,评价了褐飞虱在12份抗褐飞虱水稻品种上的取食行为RH (BPH3)和Balamawee (BPH9)表现较强的抗生性和趋避性；之前的报道认为Kaharamana, Pokkali和Balamawee都含有同一个显性抗褐飞虱基因BPH9,但褐飞虱在Balamawee上的取食行为与Kaharamana和Pokkali存在显着的差异。Co1.5在分蘖的抗生性显着强于苗期抗性,表明其含有的抗性基因受发育调控。本研究将测试水稻品种苗期对褐飞虱的抗性划分为四种类型：RH和Balamawee属于抗生性或趋避性水稻品种；DV85,Pokkali, Karhamana, Col.5, Col.11和Chin Saba属于耐虫性品种；TN1,NJ11和Kinmaze属于感虫品种,其他品种为兼抗品种。2抗褐飞虱主基因BPH20的精细定位DV85为一高抗褐飞虱的籼稻品种,其抗性受一对显性基因控制,之前的研究将该基因定位在第十一染色体,将其命名为BPH20,通过对其抗褐飞虱机制的评价,表明该品种为一耐虫性的水稻品种,并不具有较强的抗生性和趋避性。为完成该基因的精细定位,我们构建了BPH20的高密度连锁图谱。利用与BPH20紧密连锁的分子标记分别从4025株DV85/Kinmaze和5926株DV85/9311F2中选取重组个体,最终将该基因精细定位在两InDel标记Indel59和Indel66之间,约28Kb的区间内。3越南籼稻品种YAGYAW (YA)抗褐飞虱基因的定位为了发掘新的抗源,本研究分析了一个抗褐飞虱越南地方品种抗褐飞虱的遗传基础。利用抗褐飞虱越南地方品种YAGYAW与感虫品种Cpslo17构建了包含有180个单株的F2群体,并构建了全基因组连锁图谱,结合180个F2：3家系的抗褐飞虱表型。结果分别在第2、4、7和11染色体上检测到四个抗褐飞虱位点,贡献率为8.7%-16.5%,四个抗性位点均来自抗虫品种YAGYAW,其中在第2染色体上检测到的QTL可能为一个新的抗虫位点。第2染色体上检测到的新抗虫位点为抗褐飞虱水稻育种提供了新的抗源。4褐飞虱刺吸诱导水稻防御相关酶的活性变化褐飞虱刺吸导致稻株体内丙二醛含量迅速上升,表明褐飞虱刺吸引起了水稻植株膜脂的过氧化；抗虫和感虫品种植株体内脂氧合酶(LOX)、脂氢过氧化物裂解酶(HPL)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)的活性均显着升高；而过氧化氢酶(CAT)活性在抗虫品种稻株体内明显受抑制,H202含量提高,但在感虫品种植株体内CAT的活性略有提高,H2O2含量略有下降。对抗虫品种植株不同器官的测定结果表明,褐飞虱刺吸对PAL和H2O2的影响是系统性的,而对LOX的影响则仅局限于褐飞虱刺吸部位的茎杆中。并利用RNAi技术获得了PAL, AOS和ACC敲除的转基因植株,这叁个基因敲除转基因材料的获得将有利于阐明SA, JA及乙烯途径在水稻抗褐飞虱反应中的作用。5一氧化氮(Nitric oxide)的产生参与了水稻抗褐飞虱防御反应研究发现褐飞虱取食增加了抗、感品种叶片和茎杆中内源一氧化氮的含量；但根中一氧化氮的含量在抗、感品种中的变化存在差异,抗虫品种根中NO的含量显着增加,但感虫品种中NO的含量不但没有增加,反而有所下降。褐飞虱取食一小时后,在褐飞虱取食部位茎杆的韧皮部检测到有NO的释放。通过表达谱分析和酶活力测定,表明褐飞虱取食诱导产生的NO可能部分依赖于一氧化氮合酶(nitric oxide synthase)途径,而并不依赖于硝酸还原酶(nitrate reductase),此外,可能还有其他途径也参与了该过程中NO的合成。NO可以通过影响水稻气孔的关闭,改变根系的形态建成,有效的降低褐飞虱取食造成的植株水分损失,降低植株的死亡率,而且还可以诱导干旱胁迫相关基因的表达,降低株高,延缓叶片的衰老。综上所述,NO可能作为一个重要的信号分于参与了水稻的抗褐飞虱反应。
李冉[7]2012年在《水稻抗虫相关基因OsWRKY24、OsWRKY70和OsNPR1的功能解析》文中进行了进一步梳理在自然条件下,水稻经常会受到各种害虫的取食,比如二化螟(SSB,Chilo suppressalis)、褐飞虱(BPH,Niaparvata lugens)、稻纵卷叶螟(LF,Cnaphalocrocis medinalis)等。植食性昆虫取食造成了水稻转录组发生了很大的变化,虫害诱导的防御反应信号途径被激活,抗性基因得以表达,其中转录调控因子起了非常重要的调控作用。然而,目前对在诱导抗虫反应中起作用的转录调控因子还了解得很少。本文中我们选取了两个水稻中植食性昆虫诱导的转录因子以及OsNPR1基因,对它们在植物抗虫途径中的作用机理进行了分析：1) OsWRKY70基因可以被机械损伤、二化螟取食强烈诱导,而褐飞虱取食微弱诱导该基因的表达。OsWRKY70定位在细胞核中,可以和W-box结合,具有转录激活活性。体外GST pull-down实验证明OsWRKY70可以和OsMPK3和OsMPK6互作,并且位于MAPK的下游。OsWRKY70正调控茉莉酸(jasmonic acid, JA)和胰蛋白酶抑制剂(TrypPIs)合成及水稻对SSB的抗性,而负调控赤霉素(gibberellin acid, GA)、水杨酸(salicylic acid,SA)、过氧化氢(H2O2)合成及水稻对BPH的抗性。其中我们首次发现了GA信号途径参与了植物应答植食性昆虫的抗性。OsWRKY70是一个各种虫害诱导防御网络中的关键节点。2) OsWRKY24基因可以被机械损伤、二化螟取食诱导上调,而褐飞虱取食微弱的诱导该基因的表达。该基因也是位于MAPK下游、微弱的正调控了JA和TrypPIs合成及水稻对SSB的抗性,而对BPH的抗性影响不大。通过构建ir-wrky24/70双突变体,我们发现OsWRKY24基因在二化螟诱导的抗性途径中贡献不大。3) OsNPR1基因可以被机械损伤、二化螟取食、稻纵卷叶螟取食和信号分子SA、JA诱导上调,而机械损伤和SA诱导后该基因的表达要明显早于虫害诱导。反义抑制该基因后提高了二化螟诱导的JA、ET含量以及二化螟诱导的JA合成酶OsHI-LOX以及ET合成酶OsACS2基因的表达,并且提高了虫害诱导的TrypPIs的含量、挥发物的含量以及对二化螟的抗性。我们的结果表明OsNPR1是一个虫害诱导早期的响应基因,并且可以通过调节激素信号途径来有效的、特异的调控植食性昆虫诱导的抗性。我们的研究结果表明叁个基因通过调控激素信号途径参与了水稻植食性昆虫诱导的防御反应。
刘艳玲[8]2014年在《水稻抗褐飞虱基因Bph27(t)候选基因验证及育种利用与褐飞虱抗性机制的初探》文中进行了进一步梳理褐飞虱(Nilaparvata lugens Stal)是水稻生产中最具破坏性的害虫之一。作为水稻的单食性害虫,褐飞虱取食量大、繁殖快,一旦大爆发,可造成受害区域颗粒无收。此外,褐飞虱还可以传播水稻病毒病(如:草状丛矮病和齿叶矮缩病),对水稻生产造成严重危害。在亚洲水稻种植区,褐飞虱已跃升为水稻生产的头号害虫。目前,褐飞虱防治仍依靠化学农药,不仅增加生产成本,污染环境,而且促使褐飞虱抗药性增强。因此,挖掘新的抗性基因、探索抗性基因的调控机制、阐述水稻与褐飞虱之间的互作模式,有助于我们合理利用寄主抗性、培育抗褐飞虱水稻品种,为褐飞虱防治提供经济、有效又环保的途径。本研究内容主要包括以下方面:1.水稻抗褐飞虱基因Bph27(t)候选基因的验证及其在育种中的应用(1)水稻抗褐飞虱基因Bph27(t)候选基因的验证我们将来自Balamawee的抗褐飞虱基因Bph27(t)精细定位至水稻第四染色体分子标记Q20与Q31之间,物理距离为46 kb,定位区间内共有8注释的基因。根据之前的报道,其中6个基因可能参与了植物抗虫、抗病反应,分别为磷脂酶C基因、蛋白激酶基因、Harpin诱导的蛋白、蛋白酶抑制剂基因、F-BOX基因及Q31紧密连锁的NB-LRR基因。我们将6个基因作为候选基因,分别转化感虫亲本02428发现,结果发现当感虫亲本02428全部死亡时,各转基因家系与02428无显着差异也几乎全部死亡,说明6个抗性相关的基因均不能单独提高水稻对褐飞虱的抗性。据此推测:1)Bph27(t)可能为定位区间内的其他基因。2)ph27(t)的褐飞虱抗性是由定位区间内的多个基因共同作用,而非单个基因控制。3)定位区间有待验证。为此,已将另外两个基因进行转基因试验,同时利用宁粳3号为背景含有Bph27(t)位点的近等基因系与宁粳3号杂交重新构建定位群体,进一步验证并缩小定位区间。本研究获得的与Bph27(t)紧密连锁的分子标记,为通过分子标记辅助选择培育抗褐飞虱水稻品种及Bph27(t)克隆奠定了基础。(2)Bph27(t)与Bph3的聚合育种褐飞虱对抗虫品种具有极强的适应能力,抗虫品种推广后,褐飞虱很快就能形成适应抗虫品种的新种群,导致品种抗性的丧失。为培育持久抗褐飞虱新品种,本研究利用Balamawee及含有抗褐飞虱主基因Bph3的斯里兰卡地方品种Rathu Heenati(RH)分别与农艺性状优良的粳稻品种宁粳3号(NJ3)回交,并通过分子标记辅助选择,分别获得了一系列携带有Bph3或Bph27(t)的抗褐飞虱的粳稻新品系。苗期室内及成株期后期鉴定的结果均表明,携带Bph3或Bph27(t)的粳稻新品系高抗褐飞虱。受体对照品种NJ3与抗褐飞虱新品系,抽穗期分别接虫褐飞虱,进行产量损失比较试验,结果表明,受体亲本NJ3的千粒重及单株产量显着下降,其产量较未接虫对照下降17.9%;而抗虫新品系的产量并未受显着影响。同时,分别利用携带Bph3和和ph27(t)的抗褐飞虱品系与NJ3杂交,对获得的F1植株进行褐飞虱抗性鉴定,结果发现F1杂合植株具有与纯合品系相同的抗性水平,表明这两个基因均为显性抗性基因,可用于杂种优势利用。进一步利用分别携带Bph3和Bph27(t)的抗褐飞虱品系相互杂交,并结合分子标记辅助选择,获得了 一批Bph3和Bph27(t)两个基因聚合的粳稻新品系。上述材料的创制,为持久抗褐飞虱水稻新品种的培育及通过品种抗性防治褐飞虱奠定了基础。2.水稻褐飞虱基抗性机制的探索研究(1)苯丙氨酸和二萜类植物抗毒素代谢途径参与了植物对褐飞虱的响应本研究利用全基因组表达谱芯片,分析了抗虫品种Rathu Heenati(RH,携带Bph3)与感虫品种02428及抗、感池的接种褐飞虱前后的表达谱差异。结果发现,褐飞虱取食后,RH较02428(RHT vs 02428T),极抗池较极感池(RT vs ST)苯丙氨酸代谢途径和二萜类植物抗毒素合成途径基因均显着上调。并且RH诱导后较诱导前(RHT vs RC)这两条代谢途径相关基因也显着上调表达。Real-timeRT-PCR分析,进一步证实褐飞虱取食1、12、24小时后,RH中苯丙氨酸及二萜类代谢途径相关基因的表达较02428均显着升高。上述结果表明,苯丙氨酸和二萜类植物抗毒素代谢途径可能参与了植物抗褐飞虱反应。(2)苯丙氨酸代谢途径在抗褐飞虱中的作用为进一步验证苯丙氨酸代谢途径在水稻抗褐飞虱中的作用,我们获得了以抗虫品种IR64为受体的苯丙氨酸裂解酶(phenylalanine ammonia-lyase,PAL)的RNAi转基因植株。转基因植株的褐飞虱抗性较IR64显着降低,并且抗性的降低水平与PAL表达的下调显着相关。通过测定PAL下游主要代谢产物的含量,发现褐飞虱取食后,RNAi转基因植株中木质素及总黄酮的含量与IR64相比均无明显差异,而水杨酸(salicylic acid,SA)含量较IR64有显着降低。外源施加 SA及其类似物苯并噻二唑(beasanzothiadiazola，BTH),可以显着提高RNAi转基因植株的褐飞虱性,达IR64抗性水平的90%以上。为研究内源SA在抗褐飞虱中的作用,我们利用日本晴(Nipponbare,NIP)的SA缺失转基因植株NIP(NahG)。褐飞虱接种3天后,感虫材料NIP尚未呈现明显受害症状,而NIP(NahG)的存活率则下降至20%左右。外施SA或BTH则可将NIP(NahG)存活率提高至90%左右,表明SA在和水稻抗褐飞虱途径中起着关键作用。SA含量测定结果表明褐飞虱取食后,RH较02428积累更多的SA。外源施加SA后,即使无褐飞虱取食时,也可以同时提高RH与02428中的二萜类植物抗毒素合成途径中基因的表达。这也说明Bph3识别褐飞虱取食后,可能通过激活RH中PAL途径积累较多的SA,SA作为信号分子调控了二萜类基础防御物质的表达进而达到防御目的。
钱前, 瞿礼嘉, 袁明, 王小菁, 杨维才[9]2013年在《2012年中国植物科学若干领域重要研究进展》文中研究表明2012年中国植物科学研究继续快速发展。中国科学家在植物科学多个领域中取得了大量的原创性、高水平研究成果,包括植物基因组研究、植物天然免疫抗性及其应答环境的信号转导机制以及植物去甲基化作用和DNA双链断裂修复机制研究等,受到国内外的高度评价。该文对2012年中国本土植物生命科学若干领域取得的重要研究进展进行概括性评述,旨在全面追踪当前中国植物科学领域发展的最新前沿和热点事件,并展现我国科学家所取得的杰出成就。
于慧[10]2013年在《利用RNAi技术抑制褐飞虱蔗糖酶基因和蔗糖转运子基因的研究》文中指出褐飞虱(Nilaparvata lugens (Stal))属同翅目(Homoptera)飞虱科(Dekphacidae),是我国及许多亚洲国家稻区的主要害虫。目前,防治褐飞虱的主要方法是化学防治。但是,长时间使用化学农药带来了农药残留,环境污染和害虫产生抗药性等问题。RNA干扰(RNA interference, RNAi)近年来迅速发展,广泛应用于基因功能确定、基因敲除、抗癌症和病毒病药物研究等方面的研究,也为病虫害防治提供了一个新的方向。本论文选取了4个褐飞虱生理活动相关基因作为靶标基因。基于RNAi技术构建了RNA干扰载体并转化水稻,获得了4种能分别表达各自靶标dsRNA的转基因植株。其中,2个靶标基因是褐飞虱蔗糖酶基因(命名为145、282),2个是蔗糖转运子基因(命名为303、246)。本论文采用玉米泛素启动子(Zea may polyubiquitin-1promoter, ZmUbi)指导dsRNA表达,用抗草甘膦基因G10evo(5-烯酮式丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶,EPSPS)作为筛选标记,构建dsRNA的表达载体。利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导转化的方法将表达载体分别转化粳稻品种“秀水134”,获得了表达各自靶标基因dsRNA的抗草甘膦转基因水稻。在T0代转基因植株(145基因17株、282基因15株、303基因15株、246基因13株)的褐飞虱生物活性测定中,实验组褐飞虱数量与对照组并没有明显差异。虽然虫体死亡或数量减少,但大多为接虫时的机械损伤或褐飞虱逃逸所致,转基因植株相较对照组并没有表现出褐飞虱抗性。在T0代145、282、303、246转基因植株中,每个基因选取7个株系的种子进行发芽,并在水稻5叶期喷施200倍的草甘膦筛选阳性转基因植株。用Northern Blot的方法对阳性植株的dsRNA表达情况进行检测,结果表明每个基因中均有dsRNA表达量较高的株系存在(145基因为4、7号,282基因为1、3、7号,303基因为4、6号,246基因为2、5、7号)。根据Northern Blot的结果,每个基因选取3个dsRNA表达量最高的株系进行褐飞虱生物活性测定,结果发现,转基因水稻并没有表现出明显的褐飞虱抗性。对转基因水稻T1代植株进行Northern Blot实验,发现T1代植株可以表达靶标基因的dsRNA。这说明转基因水稻表达dsRNA这一性状能稳定地遗传至T1代,但是转基因水稻T0和T1代都没有表现出明显的褐飞虱抗性,这可能是由于植株内dsRNA浓度太低、摄取过程中dsRNA被降解或无法运输至靶标位点、有其他基因代替被降解的靶标基因发挥作用等原因所致。
参考文献：
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[9]. 2012年中国植物科学若干领域重要研究进展[J]. 钱前, 瞿礼嘉, 袁明, 王小菁, 杨维才. 植物学报. 2013
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