葛秀春[1]2003年在《水稻与白叶枯病菌互作中活性氧与过敏性细胞死亡相关因子的研究》文中提出植物过敏性反应(hypersensitive response, HR)是植物对不亲和病原菌的侵袭表现为受侵细胞及其邻近细胞的快速坏死，病原菌生长受到遏止的一种抗病反应。植物HR中的这种细胞死亡不是病原菌直接破坏的结果，而是受内在基因控制下的一种程序化细胞死亡。目前，植物如何调控HR细胞死亡的机制尚不清楚。本论文以水稻(Oryza sativa L.)悬浮细胞与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)之间的不亲和及亲和互作为实验系统，研究了互作中水稻细胞活性氧产生、NO产生、核酸酶活性等的变化及与HR细胞死亡的关系，活性氧的酶产生机理，以及线粒体活性氧产生和与哺乳动物细胞凋亡相关的一些类似蛋白或同源基因在HR细胞死亡中的作用；此外，还克隆及鉴定了一个与产生活性氧有关的NADPH氧化酶基因，以期探明水稻与Xoo互作中HR细胞死亡的调控机理。 供试水稻悬浮培养细胞的品种为IR-BB10，含抗白叶枯病基因Xa-10；供试Xoo菌株为含avrXa10的PXO99~A(pBUavrXa10)和不含avrXa10的PXO99~A(pBU)，前者与IR-BB10之间为不亲和互作，而后者与IR-BB10发生亲和互作。用Evans blue染色法测定了接种Xoo后水稻悬浮细胞中HR细胞死亡。结果表明，在不亲和互作中，接种后8 h水稻悬浮细胞开始发生快速死亡，而在亲和互作中，接种后24 h之内水稻悬浮细胞基本无死亡。 用细胞色素c及二甲苯酚橙分别测定了接种Xoo后水稻悬浮细胞胞质外O_2~(.-)和H_2O_2的产生。结果表明，在不亲和互作中，水稻细胞胞质外出现两次O_2~(.-)和H_2O_2的突增，第一次突增发生在接种后0.5 h，第二次突增出现在接种后1.5-4 h；在亲和互作中，活性氧只出现不亲和互作中的第一次突增。此外，用四唑染料XTT和二氯荧光黄二乙酸(H_2DCF-DA)分别测定了互作中水稻整个细胞产生O_2~(.-)及细胞内H_2O_2产生的变化。结果显示，白叶枯病菌接种后，整个细胞产生O_2~(.-)的动态与胞外的基本相似，而细胞内H_2O_2产生的两个峰值明显滞后于胞外。用超氧物歧化酶(SOD)在接种前处理悬浮细胞，部分阻止了接种后水稻整个细胞O_2~(.-)的产生，过氧化氢酶(CAT)处理亦同样未能全部抑制接种后细胞内H_2O_2的产生。由此可见，由Xoo侵染引起的HR中水稻细胞出现两个阶段的活性氧突增，而且在水稻细胞胞内外均有活性氧的诱导产生。XOO接种后2 h，发生HR的水稻细胞质中，SOD活性增加，而CAT、过氧化物酶（POD）及抗坏血酸过氧化物酶等的活性均出现不同程度的下降。活性氧清除剂N乙酸半脱氨酸和黄酮均能显着抑制HR细胞死亡，表明活性氧在nO引起的水稻HR细胞死亡中起重要作用。 在不亲和互作中，XOO接种可诱导水稻细胞产生两次NO突增，第一次出现在接种后lh，第二次发生在接种后3－4h；而在亲和互作中，＊O只在接种后lh出现一次突增。NO清除齐PTIO及NO合成酶抑制齐NMMA、L－NAA禾 l，3－PBIT处理均可显着抑制HR细胞死亡，而NO释放剂SNP处理则诱导了对照及亲和互作中的细胞死亡。这些结果表明，NO参与水稻对XoO的HR中细胞死亡的诱导。 分析了n O接种后水稻悬浮细胞中与产生活性氧有关的酶活性变化。结果表明，XOO 接种后，水稻细胞壁上的二胺氧化酶（DAO）、POD、NADH 过氧化物酶（NADHFOD ）及胞内黄嘿吟氧化酶（XO）等的活性升高，在增加时间上与活性氧的产生规律基本一致。而细胞质膜NADPH氧化酶活性仅在不亲和互作中的第二次活性氧突增期间增加。DAO、POD、XO和 NADPH氧化酶的抑制剂均能不同程度地抑制HR中活性氧的产生及细胞死亡。此外，细胞壁上的草酸氧化酶和脂氧合酶的活性在活性氧突增结束之前没有变化。因此，与XoO互作中，水稻细胞第一次活性氧突增可能是由于细胞壁上DAO和过氧化物酶及胞内XO等酶活性的诱导所致，而这些酶与NADPH氧化酶一起又参与HR中的第二次活性氧产生。 Xoo接种后 2 h起，不亲和互作中 Mn－SOD显着增加，暗示在线粒体上可能有活性氧产生。在接种前 15 min用呼吸链复合物1抑制剂鱼藤酮、复合物＊的抑制剂抗霉素A和交替氧化酶抑制剂n一两基没食子酸处理，结果表明，鱼藤酮处理未能抑制Xoo诱导的水稻细胞内第一次Hp。产生（接种后lh人 却能几乎全部阻抑第二次突增峰 （接种后4h），并抑制了＊R细胞死亡：抗霉素A和n一丙基没食子酸却引起对照及亲和互作中胞内H。O；产生及细胞死亡，而这些H。O。产生及细胞死亡可被N乙酸半脱氨酸处理抑制却不受过氧化氢酶处理的影响。由此推测，互作早期产生的活性氧可能诱导了线粒体活性氧的生成，并在XOO诱导水稻HR细胞死亡中起重要作用。 在苯并噬二电诱导水稻系统获得抗性中已经发现了一个特异性表达的、编码NADPH氧化酶的gpgl…”同源基因片段。由于NADPH氧化酶活性与HR中活性氧产生密切相关，因此对该基因进行了克隆、鉴定，并分析了其在水稻与白叶枯病菌互作中 互了 ”7
张桂英[2]2009年在《中国、日本、菲律宾水稻白叶枯菌致病性和遗传多样性分析及文库克隆pA254的功能研究》文中研究表明水稻黄单胞菌的两个致病变种水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)和水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzicola, Xooc)是模式植物水稻(Oryza sativa)上的两种模式病原菌,分别引起水稻白叶枯病(bacterial blight, BB)和水稻细菌性条斑病(bacterial leaf streak, BLS),影响了亚洲大部分、非洲部分地区主要粮食作物的生产。水稻白叶枯菌(Xoo)从被发现至今100多年的历史中,一直是植物病理学研究者关注的焦点。研究水稻抗病基因(R)和Xoo无毒基因(A)的互作是阐明抗病基因和Xoo的致病性分化、鉴定小种、无毒基因、致病基因等的基本依据,也是发展有效的病害防治措施的需要。Xoo的小种分化涉及到对现有抗病品种的潜在利用价值。各国的Xoo代表菌株在科研和生产实践中都具有十分重要的意义。在寄主植物上的过敏反应HR最初被认为是一种“抗病现象”受到广泛关注,而病原细菌在非寄主烟草上的HR症状也是判定一个细菌分离物是否具有植物致病性的重要指标。由于HR现象与植物病原菌的致病性及寄主和非寄主植物的抗病性或内生免疫有着重要的关系,因此,研究Xoo菌株在寄主水稻上产生HR相关的avrBs3/pthA家族无毒基因和使非寄主烟草丧失产生HR的文库克隆pA254的组成和功能为更好地阐释植物细菌致病机理,植物病害抗病机理和植物与微生物学的其他方面的基本原理,同时也为内生免疫等方面带来重要启示。1 Xoo代表菌株致病多样性分析通过苗期注射接种法和成株期剪叶接种法,研究了20个来自中国、日本和菲律宾的Xoo不同致病型的代表菌株与36个水稻品种的互作关系。Xoo注射接种入14d的36个水稻品种的叶片中进行非亲和互作的HR表型测定,并对接种后第2-5d的接种叶片进行DAB溶液染色,检测接种叶片中活性氧爆发的情况,来观察HR发生情况。结果显示OS-198与所测试36个水稻品种苗期叶片中都发生有不同程度的非亲和互作,PX061、JXOI、OS-189菌株等与所测试36个品种中大多数品种之间存在特异性互作关系。Xoo注射接种所产生的症状是一复杂的表型,JXOI与IRBB1、IRBB2等发生特异性的互作,产生肉眼可见的典型的HR症状,表现出质量性状,但是更普遍现象是多数的Xoo在水稻品种上产生一种混合症状,即water-soaking症状和HR反应同时存在,但是病斑长度没有明显的变化,推测Xoo中所含有多数的avrBs3/pthA基因具有的无毒性属于一种数量累加效应,不是质量性状。研究结果明确了白叶枯菌与水稻近等基因系等36个水稻品种的互作关系,报道了在Xoo-水稻互作系统中的非亲和性互作与氧爆发的关系,推测不同代表菌株中可能含有的无毒基因,这为克隆对应R基因的无毒基因以及揭示水稻黄单胞菌致病性变异机制奠定了工作基础和提供了科学线索和依据。成株期剪叶接种结果显示在36个水稻品种中,基因累加品系IRBB54(xa5+Xa21)和IRBB55(xa13+Xa21)抗所有测试菌株,在20个测试菌株中,没有发现对36个水稻品种都致病的菌株。带有显性抗病基因Xa4、Xa7、Xal7、Xa21和隐性抗病基因xa5、xa13、xa24的水稻品种对50%以上的测试代表菌株抗病,而带显性抗病基因Xa1、Xa2、Xa10、Xa11、Xa12、Xa14、Xa18和隐性抗病基因xa8、xa19、xa20的水稻品种对50%以上的测试的代表菌株感病,籼稻IRBB3(Xa3)感病的品种也超过50%。IRBB21(Xa21)拥有最广的单基因抗性谱。IRBB54和IRBB55是抗病表现最好的双抗病基因组合的品种。常规品种TN-1感所有的测试菌株,IR26、BJ1、Asminori、Wase Aikoku 3和DV85对60%以上的测试菌有抗性.IR24、Java14、Tetep和Cas209对60%以上的测试菌感病。Xoo在36个水稻品种上的致病表型把测试菌株分成19个致病型,每个代表菌株的致病性各不相同。根据致病型的相似性,19个致病型可聚成7个类群(Cluster),聚类群3是优势群,分布最广,包含有测试的3国的代表菌株。2 Xoo代表菌株的小种遗传多样性分析有证据表明水稻黄单胞菌都含有15个以上的avrBs3/pthA家族基因,它们具有几乎一样的5'端和3'端,不同的只是中间102 bp重复单元的重复数不同。本研究参照PXO99A全基因组序列中已知的avrBs3/pthA基因的组成、数目和序列,以avrBs3/pthA家族成员avrXa3的中间保守区域大小为2.4kb-BamHI和1.4kb-SphI的中间片段为探针,对20个Xoo的代表菌株和Xooc菌株RS105的分别用BamHI和SphI酶切的基因组DNA进行Southern杂交作RFLP分析。杂交结果显示Xoo中很高的avrBs3/pthA家族成员遗传组成多样性。发现Xoo的不同小种间所含有的avrBs3/pthA基因的拷贝数不同,有些条带在所有的小种中都存在,有些条带是某个小种所特有的。发现探针的同源片段主要集中在1000bp到5000bp这个区间,意味着102bp的重复数大约有9-50个,每个菌株有12-38个同源拷贝。各国水稻白叶枯菌间至少共有4.3kb、4.0kb、3.9kb、3.8kb、3.5kb、3.1kb、2.8kb大小的BamHI片段或3.2kb、2.9kb、2.8kb、2.5kb、2.3kb、2.1kb、1.8kb大小的SphI片段的7个大小相同或相近的avrBs3/pthA家族基因。这些共有的基因在维护和展现水稻白叶枯菌的共性特征方面发挥着重要的作用。20个参试菌中总共鉴定了19种RFLP分子型(haplotype),根据分子型的相似性分为7个系群(Lineage).3.Xoo菌株PXO99A的无毒基因缺失突变分析水稻白叶枯菌中含有数目不等的无毒基因,但对大多数无毒基因的功能所知甚少。通过对同源重组获得的一个PXO99A无毒基因的突变体PXO99Δavr,进行Southern杂交验证、突变序列分析和水稻成株期剪叶接种的致病性测定。结果证实了突变体缺失了5个无毒基因,同源重组发生在PXO99A全基因组中一个有5个无毒基因串连的位点上。水稻成株期致病性测定结果表明突变体PXO99Δavr在IRBB10等15个水稻品种上的病斑长度比PXO99A明显缩短,在IRBB14、IRBB21和IRBB55上病斑变长,缺失的5个无毒基因的的综合表现为毒性因子功能。推断在缺失的基因中含有无毒基因avrXa14、avrXa21、avrxal3以及和抗病基因Xa3、Xa4、xa5、Xa10、Xal7亲和互作有关的毒性因子。为利用自杀式载体pKNG101建立模式菌株PXO99A的无毒基因缺失突变体库,进一步研究PXO99A中各无毒基因的功能做了一些初步的探索。4.无毒基因avrXa3介导的水稻白叶枯病菌在不同水稻品种上的致病适应性分析从水稻白叶枯JXOIII菌株中克隆到一个无毒基因avrXa3,它属于avrBs3/pthA家族成员。根据无毒基因avrXa3的序列,构建了水稻白叶枯PXO99A菌株缺失5个串联的无毒基因的突变体PXO99Δavr。将avrXa3导入PXO99A和PXO99Δavr后,得到衍生菌株PXO99A/avrXa3, PXO99Δavr/avrXa3,与36个含不同抗病基因的水稻品种进行互作分析。结果显示导入avrXa3后的菌株在不同的水稻品种上表现出了明显的寄生适应性变化。进一步分析证明无毒基因avrXa3在Wase Aikoku 3、IRBB2、IRBB3、IRBB203、IRBB204、IRBB205、IRBB211、IRBB53、IR24、TN-1等11个水稻上病斑缩短,表现明显的无毒活性；在IRBB21、IRBB10、IRBB14、IR26、Cas209、Java14等6个品种病斑明显变长,体现无毒基因的毒性功能。实验结果表明,无毒基因avrXa 3对PXO99A中其它无毒基因的表达有明显干扰作用,单个效应分子的变化也会使细菌在不同水稻品种上的寄生适应性发生复杂的改变。5.Xoo菌株与非寄主HR相关的PXO99A基因文库克隆pA254的功能分析来源于水稻白叶枯病菌PXO99A的文库克隆pA254,分别使水稻黄单胞菌PXO99A和RS105的致病力下降及丧失在烟草上激发过敏反应的能力。用SacI、EcoRI、KpnI和BamHI四种内切酶进行了交叉消化,构建了文库克隆pA254的酶切物理图谱。亚克隆导入RS105进行功能互补,在烟草上进行HR测定。结果显示亚克隆获得SacI, KpnI, EcoRl, BamHI完全和不完全酶切的29个亚克隆,导入RS105得到的接合子,都可以使烟草产生HR反应,没有与文库克隆pA254表型一致的亚克隆,即还未获得pA254的最小的功能片段。对所获得的pA254的亚克隆进行测序分析,通过序列同源性分析发现pA254与已经公布的PX099A的全基因组序列100%同源,与另外2个水稻白叶枯病菌具有99%以上同源性。这个克隆带有的外源片段大小为42572bp,位于PX099A基因组序列中相对保守的区域,包含约46个基因,也分别和MAFF11081和KACC10331中的37和42个基因同源。其中发现有毒力调控子基因、毒力蛋白基因、转录抑制子和含HTH基序的转录调控子等毒力相关因子,另外还有12个为未知功能基因,推测为保守的蛋白,4个转座酶基因,4个DNA连接酶,3个细胞色素C氧化还原酶,2个谷胱甘肽S转移酶,2个氨基酸-tRNA(Asp)合成酶,2个饥饿胁迫蛋白,2个抑制子(多羟基链烷酸合成抑制子),有一个乙酰辅酶Co-A还原酶,GumN蛋白和脂蛋白,YjeF家族蛋白,DNA错配修复酶,铁硫簇结合蛋白,乙酰丙氨酸酰胺酶,脱氧核糖核酸酶(亦称DNase),核糖核酸酶,可溶解胞壁转糖基酶等。文库克隆中有一大小约21kb的序列具有基因岛或致病岛的许多典型特征：带有1个或多个毒力相关因子、它们有明显的GC含量的变化,在连接处有整合酶基因,边界有tRNA作为整合位点,还有多个遗传移动性基因转座酶基因以及氨基酸偏爱密码子等。推测文库克隆pA254是hrp致病岛以外另一个和非寄主HR有关新的致病岛或基因岛(genomic island)。
刘桂英[3]2004年在《中生菌素对水稻悬浮细胞主要防御酶的系统诱导》文中指出中生菌素是一种防治水稻白叶枯病非常有效的农用抗生素类生物农药。本实验对中生菌素介导的水稻悬浮细胞与白叶枯病菌互作中，叁种主要防御酶POD、PPO、PAL活性及POD、PPO同工酶的动态变化进行了研究。结果如下： (一)建立了粳稻品种感病品系沈农1033及其携带Xa-4抗病基因的近等位基因系CBB4的愈伤组织、胚性悬浮细胞系。 (二)中生菌素对水稻悬浮细胞主要防御酶酶活性的影响：(1)5mg／l、10mg／l、15mg／l的中生菌素处理水稻悬浮细胞后，72h POD活性达高峰时，1033中POD活性比空白对照分别增加了111.1％、151.5％、182.1％，CBB4中POD活性比空白对照分别增加了189.8％、178.2％、224.2％；24h PPO活性达高峰时，1033中PPO活性比空白对照分别增加了150.9％、189.2％、171.9％，CBB4中PPO活性比空白对照分别增加了98.7％、181.8％、93.4％；48h PAL活性达高峰时，1033中PAL活性比空白对照分别增加了121.1％、139.7％、135.4％，CBB4中PAL活性比空白对照分别增加了128.8％、143.6％、141.2％。以上结果说明5mg／l、10mg／l、15mg／l的中生菌素对抗、感水稻悬浮细胞中POD、PPO、PAL均具有诱导作用，且对CBB4中POD、PAL的诱导效果较1033好，对PPO的诱导效果则是1033比CBB4好：在叁种处理浓度中，15mg／l的中生菌素对POD的诱导效果较好，10mg／l对PPO和PAL的诱导效果较好。 (2)中生菌素作用于抗、感水稻悬浮细胞后，POD、PPO、PAL活性与空白对照相比均呈先升后降趋势，24～72h，PPO、PAL、POD活性相继上升到最大值，POD增加幅度最大，PAL次之，PPO则最小。 (叁)中生菌素对水稻胚性悬浮细胞主要防御酶同工酶的影响： (1)POD同工酶谱带变化：经中生菌素处理后，无论抗、感水稻悬浮细胞接菌与否，a区谱带基本不变；b区中b2、b4带变化较大，b1、b3带虽有变化，但变化不大：c区中，主要是c1、c2带的变化，c3带的变化也不大，说明中生菌素可诱导或增强b2、b3、c1、c2、c3带POD同工酶谱带的表达。 (2)PPO同工酶谱带变化：在中生菌素作用下，无论抗、感水稻悬浮细胞接菌与否，a区PPO同工酶谱带变化较大，a1、a3存在增强现象．a2带存在减弱现象；b区中酶带变化较大，酶带存在减弱或消失现象；c区中谱带变化也不大，c1、c2带基本无变化，c3带存在增强现象，说明中生菌素可诱导或增强a3、b1、c1带PPO同工酶谱带的表达。 以上结果说明，中生菌素能诱导植物防御酶系中重要成员POD、PPO、PAL的表达，从而诱导植物防御反应和系统获得抗性的发生，增强植物的抗病性。 本研究可为中生菌素作用机制的阐明及适时、适量的田间应用和农抗筛选模型的建立提供理论指导。
郭威[4]2011年在《水稻条斑病菌致病相关基因的鉴定与功能研究》文中研究表明水稻条斑病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzicola, Xoc)是水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)种下两致病变种之一,引起水稻细菌性条斑病(Bacterial Leaf Streak,简称条斑病,BLS)。近年来该病发生日趋严重,成为水稻上第四大病害。该病原菌从气孔或伤口侵入,在薄壁细胞间繁殖与危害,因受叶脉限制产生条斑病症状。由于感病杂交水稻大面积推广,且生产上无有效的抗条斑病种质资源,水稻安全生产受到严重的威胁。近年来,X. oryzae pv. oryzicola大量致病性相关基因(如hrp、avr、 rpf及其它毒性候选基因等)的研究揭示,毒性相关基因的鉴别是全面解析病原菌致病机理以及发展高效生物防治的基础。目前,构建植物病原菌突变体库是挖掘新基因和进行功能基因组学研究的有效途径。因此,为了从全基因组范围内挖掘X. oryzae pv. oryzicola致病性相关因子,本研究以RS105为出发菌株,构建了一个包含25,000突变子的X. oryzae pv. oryzicola Tn5转座子插入突变体库,约5×ORF于基因组(约4,600个ORF)的覆盖量。Southern Blot分析表明,Tn5插入突变体库是稳定的、随机的。将每个突变子分别接种感病寄主水稻(cv. Shanyou63),经第一轮筛选共获得了1,753个致病性完全丧失或毒性减弱的突变体。为了进一步验证其在水稻上的致病表型,经第二轮筛选,共获得了114个致病性完全丧失或毒性显着减弱的突变体,其中致病性完全丧失的14个。随后,将114个致病性完全丧失或毒性显着减弱的突变体分别接种非寄主烟草(cv. Xanthi),共获得23个过敏性反应(hypersensitive response, HR)丧失或明显减弱的突变体,其中HR完全丧失的15个。以上突变体的获得,为分析X. oryzae pv. oryzicola致病性相关基因提供了材料基础。为了快速准确地确定Tn5插入的位点和具体功能基因,本研究采用热不对称交错PCR(TAIL-PCR)技术对114个致病性完全丧失或显着减弱的突变体进行了鉴别。结果显示,转座子Tn5插入在致病性相关基因上,包括hrp、avr、rpf、wxoc、代谢相关基因、conserved hypothetical protein及其它毒性基因等。大批致病相关基因的发现,不仅为从分子水平上解析X. oryzae pv. oryzicola的致病机理,而且对于揭示植物-病原物互作的致病性和抗病性,具有全局性的科学价值。关键毒性基因的功能鉴定是理解X. oryzae pv. oryzicola致病机理的先决条件。为此,对27个在水稻上完全丧失致病性或毒性显着减弱的突变体进行了分析。其中14个突变体完全丧失在水稻上的致病性和在烟草上激发过敏性反应(hypersensitive response, HR)的能力(表型为Pth-/HR-);另外13个突变体全毒性显着减弱,但仍具有在烟草上激发HR的能力(Vir-/HR+)。Tn5插入基因序列分析揭示,14个Pth-/HR-突变体是Tn5插入在以下基因上：hrcC(2个)、hrcT、hrcV(4个)、hpaP、hrcQ、(2个)/hrpF、hrpG和hrpX(2个)；13个Vir-/HR+突变体被Tn5插入的基因分别是：tal-C10c-like(TAL效应分子)、rpfC(致病性调控子)、oxyP(过氧化压力调控子)、dsbC(二硫化合物异构酶)、opgH(葡聚糖生物合成葡(萄)糖基转移酶H)、rfbA(1-磷酸葡萄糖乙酰基转移酶)、amtR(氨基转移酶)、purF(氨基磷酸核糖转移酶)、thrC(苏氨酸合成酶)、trpA(色氨酸合成酶a亚基)和3个功能未知蛋白的基因Xoryp_02235、Xoryp_00885和Xoryp_2910。即这27个突变体是Tn5插入在21个不同的ORFs上。此外上述13个全毒性减弱的突变体,功能互补都能恢复至野生型水平,这表明amtR、purF、thrC、trpA、Xoryp_02235、Xoryp_00885和Xoryp_22910是参与X. oryzae pv. oryzicola全毒性的新基因,未见在其它植物病原细菌中报道。Real-time PCR证明,上述7个新毒性基因在植物中是受诱导表达的,但是它们在参与X. oryzae pv. oryzicola致病机理上的详细功能,仍需进一步的研究。植物病原细菌与寄主互作的一个重要方面是病原菌在植物组织内获取营养的能力。碳水化合物的获取对于病原菌在寄主植物中生长繁殖、成功建立营养寄生关系至关重要。尽管代谢途径一般不认为是毒性因子,但是阐述碳水化合物获取与代谢的详细机制对于全面理解X. oryzae pv. oryzicola的寄生性和致病性具有重要科学意义。果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(FbaB),是有机生物体糖酵解和糖异生途径中的一个重要代谢酶。X. oryzae pv. oryzicola基因组中唯一的fbaB基因突变,不仅导致病原菌丧失利用丙酮酸和苹果酸进行生长的能力,也延缓其利用果糖作为唯一碳源时的生长；而且也降低了胞外多糖(EPS)的产量及降低了细菌在水稻上毒性和生长。经序列分析发现fbaB启动子区含有一个不完全的PIP-box (Plant-inducible promoter, TTCGT-N9-TTCGT)。有意义的是,fbaB的表达受hrp调控子HrpG和HrpX的负调控,且PIP-box碱基置换改变了它们对fbaB的调控。Real-time PCR结果显示,RS105菌株中的fbaB在植物中是受诱导表达的；而且fbaB缺失抑制了hrpG和hrpX的表达,hrcC、hrpE和hpa3的转录反而增强,对其余的hrp-hrc-hpa基因表达没有影响。而碳源利用能力测定揭示,hrcC、hrpE和hpa3突变体相应减弱了病原菌利用丙酮酸和苹果酸的能力。另外,fbaB突变体在植物上的毒性和生长以及EPS的产量,功能互补能够完全恢复至野生型水平。这是第一次报道表明,X. oryzae pv. oryzicola吸收的碳水化合物在fbaB基因位点通过一个未知因子在调节hrp基因的表达上扮演着重要作用。另外,对X. oryzae pv. oryzicola全基因组搜索发现了两个编码6-磷酸葡萄糖脱氢酶的基因,催化6-磷酸葡萄糖转化成6-磷酸葡萄糖酸,在2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸裂解途径(ED途径)与磷酸戊糖途径中发挥着重要作用。为了明确这两个基因的功能,本研究对X. oryzae pv. oryzicola中起主导作用的zwf(Xoryp_12765)基因进行了缺失突变。结果显示,zwf突变后,病原菌利用葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖和半乳糖的能力显着降低,但不影响其利用丙酮酸或苹果酸的能力。这表明,zwf突变可能阻碍了磷酸戊糖途径和ED途径,但不影响糖异生途径。同时也发现zwf是受诱导表达的,相对于无糖条件下的,葡萄糖、蔗糖、果糖、甘露糖及半乳糖均显着增强zwf的转录水平达3倍以上。有趣的是,zwf突变导致DSF信号通路关键基因如rpfF、rpfG、clp基因的转录表达发生改变,这暗示,zwf可能参与对DSF下游某些毒性因子的调控。此外,zwf突变,X. oryzae pv. oryzicola胞外蛋白水解酶活性增强,胞外多糖的产量降低、游动性及水稻上的毒性减弱。经功能互补能够完全恢复至野生型水平。这些结果说明,zwf是X. oryzae pv. oryzicola全毒性所需的。6-磷酸葡萄糖异构酶在碳水化合物代谢中具有重要作用,可逆的催化6-磷酸葡萄糖转化成6-磷酸果糖。Xoryp_10540(pgi)是X. oryzae pv. oryzicola全基因组中6-磷酸葡糖异构酶唯一编码基因。实验表明,pgi突变致使病原菌不能有效利用果糖、蔗糖、甘露糖、丙酮酸,但是不影响其在葡萄糖或半乳糖作为唯一碳源的培养基上生长。值得一提的是,pgi突变导致DSF信号通路关键基因rpfF、rpfG、clp基因的转录表达发生显着改变。DSF信号检测显示,pgi突变体产生的DSF信号较野生型RS105水平明显减弱。这些结果提示,pgi突变可能对DSF信号调控网络下游基因的表达有一定的影响。同样地,pgi突变降低了病原菌的胞外多糖(EPS)的产量、游动性,并减弱病原菌在水稻上的毒性。功能互补能够完全恢复至野生型水平。这些结果说明,pgi是X. oryzae pv. oryzicola EPS产生和全毒性所需的。水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)是水稻黄单胞菌(Xanthomonas oryzae)种下另一致病变种,通过T3SS将各类效应蛋白注入寄主植物细胞内,引起水稻白叶枯病(bacterial blight, BB),是水稻上叁大病害之一。病原菌通过叶尖和叶缘上的水孔侵入水稻叶片,定殖于维管束中并在木质部进行传播。依据本实验室基因芯片数据,筛选获得一个参与X. oryzae pv. oryzae能量代谢的基因,PXO03531(ketoglutarate transport protein, kgtP)。该基因在hrpX或hrpG突变体中的表达显着下调。分析发现,kgtP启动子区存在一个不完全的PIP-box (TTCGA-N21-TTCGC),且其编码产物KgtP的N端前50个氨基酸具有典型的Ⅲ型分泌信号。这提示,X. oryzae pv. oryzae kgtP可能是HrpX的调节子及T3SS效应分子。RT-PCR实验证实,HrpX和HrpG正调控kgtP的表达。免疫杂交结果显示,KgtP依赖T3SS,但不依赖于T3S出口控制蛋白HpaB进行分泌。细胞定位结果显示KgtP定位在细胞膜上,推测其结合到植物细胞膜上从而有利于从植物体内获取α-酮戊二酸。kgtP缺失突变,减弱了病原菌在植物上的生长与毒性,且细菌不能在含有α-酮戊二酸或琥珀酸钠为唯一碳源的基本培养基上生长,功能互补能有效恢复至野生型水平。RT-PCR结果显示,X. oryzae pv. oryzae在加入α-酮戊二酸为唯一碳源的基本培养基或与水稻悬浮细胞互作,kgtP的表达受到显着诱导,表明kgtP是受诱导表达的。有趣的是,kgtP缺失突变可以导致水稻上合成α-酮戊二酸的异柠檬酸脱氢酶基因表达明显下降。据此推测,在腐生状态下,X. oryzae pv. oryzae借助KgtP把体外的α-酮戊二酸转运至细胞内；当与水稻细胞互作时,则在HrpX调控下进行表达,通过T3SS进行分泌,结合在寄主细胞膜上,并把寄主细胞内的α-酮戊二酸转运至细菌细胞内以获得营养。
蒋细良[5]2005年在《中生菌素对水稻主要防御酶的系统诱导》文中研究说明中生菌素是通过微生物发酵生产的一种农用抗生素,对水稻白叶枯病等农作物细菌性病害具有良好的防治效果。多年的田间试验结果表明,中生菌素的预防效果明显地好于化学农药,但它的治疗效果比化学农药差,且多年应用田间也未见抗药性菌株出现。因此,我们推测中生菌素除具有杀菌作用外,还可能提高植株的抗病性。 通过应用抗、感白叶枯病水稻近等位基因系悬浮细胞及不同抗性水稻品种作为研究体系,研究中生菌素对水稻悬浮细胞中重要防御酶苯丙氨酸解氨酶基因(pal)、过氧化物酶基因(po)、查尔酮合成酶基因(chs)转录表达的影响,PO和多酚氧化酶(PPO)同功酶谱带的变化及稻株中PO、PAL、PPO活性的变化与防效的关系,试图较为全面地阐述中生菌素的作用机制。 首先,建立了感病品系沈农1033及其携带Xa-4粤抗病基因CBB_4的悬浮细胞系,为防卫反应基因表达研究提供了较好的研究体系。 中生菌素对水稻悬浮细胞中白叶枯病菌生长繁殖有很强的抑制作用,在悬浮细胞系中加入中生菌素7天后,中生菌素处理的悬浮细胞系中的白叶枯菌数量比未处理减少约10~5倍;感病品种悬浮细胞系中的白叶枯病菌的数量是抗病品种的10多倍,说明水稻对白叶枯病抗性与抑菌作用有关。 中生菌素、中生菌素+白叶枯菌和白叶枯茵处理都能诱导悬浮细胞中防卫基因po、pal、chs的转录表达。白叶枯菌处理时,CBB_4叁种防御酶基因诱导转录表达较沈农1033快,转录表达量大,表达持续时间长。中生菌素和中生菌素+白叶枯菌处理,对抗、感品种悬浮细胞叁种防御酶基因转录表达影响效果相似,都能使二种酶的转录表达提前、表达量增加、表达时间延长。 中生菌素对悬浮细胞PO和PPO同功酶的影响表明,CBB_4、沈农1033两种酶的同功酶都有叁个谱带区,CBB_4比沈农1033多一条PO同功酶b2带,少一条PPO同功酶b1带,接种白叶枯菌使CBB_4 PO同功酶b2带消失,而中生菌素能诱导沈农1033 PO同功酶b2带的形成,推测PO同功酶b2带可能与白叶枯病抗性相关。 中生菌素对水稻芽期、茁期和成株期的PO、PPO和PAL叁种防御酶活性的影响表明,种子经中生卤素浸种处理后,在芽期接种白叶枯病菌24h,苗期高抗品种2RCBB幼芽中叁种防御酶活性显着增加。种子经中生菌素浸种、3-4叶期和移栽前5天喷施中生菌素,苗期接种白叶枯菌24h后,中生菌素对中抗品种CBB_7叁种防御酶诱激作用最强。中生菌素处理同苗期,成株期水稻接种白叶枯菌24h后,中抗品种叶片中叁种防御酶活性提高高幅度最大。中生菌素前期处理对中抗品种防效最好,与中等抗性品种苗期和成株期叁种防御酶活性提高程度最大相一致,说明中生菌素对水稻防御酶的诱激作用是防治白叶枯病的机理之一。 中生菌素前期处理能显着降低白叶枯病的严重度,在人工剪叶高菌量接种的情况下,防效最高者为中等抗性品种丰锦,达58.4%,其次为高抗品种CBB_7,最低者为易感病品种金刚30。 以上研究表明,中生菌素既能抑制白叶枯菌的生长繁殖,又能诱导水稻的重要防御酶的表达,提高防御酶的活性,这是中生菌素对水稻白叶枯病取得良好防效的主要机制。
朱艳[6]2011年在《植物与黄单胞病原菌互作体系中交替呼吸途径的运行及H_2O_2来源与功能分析》文中研究表明本文利用交替氧化酶单克隆抗体、交替呼吸途径的特异性抑制试剂和一些专一性的活性氧清除剂对单子叶植物水稻和双子叶植物豇豆与黄单胞病原细菌不同互作模式中交替氧化酶的表达、生理学功能、过氧化氢的来源及对AOX的调控、植物光合系统功能状态的影响进行了系统研究,主要实验结果如下：论文建立了抗生素利福平(Rifampicin)对双子叶植物内寄生的细菌黄单胞菜豆致病变种AhpC突变体(XpahpC)和野生型菌株(Xpw)的抑制作用互作系统,确定了能根除植物体内繁殖病菌的最佳利福平浓度及处理时间。利用利福平及两种细菌组合处理检测出互作体系中诱导产生的过氧化氢分子,一部分来自于植物,另一部分来自于病原细菌。在细菌黄单胞菌与单子叶植物的互作系统中也发现部分过氧化氢由植物病原细菌产生,说明病原菌在互作中产生过氧化氢是一个相对普遍的现象。这将有助于我们从一个全新的角度去理解植物病原细菌的致病机理以及植物-病原菌相互作用的机理。野生型Xanthomonas campestris pv. phaseoli可以引起寄主植物内较高水平的过氧化氢累积,同时交替氧化酶也被迅速诱导表达。利用组织化学法检测过氧化氢的生成,发现产生的过氧化氢多沉积在植物的叶绿体中,该体系中植株的光合速率参数显着降低,叶绿体结构遭破坏,植物叶绿体的功能被影响。突变体与植物互作系统中AOX表达几乎不受影响。当用抗生素抑制病原菌后,我们发现伴随野生型菌株与植物互作体系中过氧化氢浓度的减少,AOX表达量也减少了,说明菌源的过氧化氢对植物AOX的表达有诱导作用。植物光合系统功能参数与过氧化氢浓度的变化也呈正相关关系。我们推测病菌产生的过氧化氢分子可能参与了植物与病原物互作中植物光合作用和交替呼吸作用运行的调控过程,与植物的发病紧密相关。在单子叶植物水稻-细菌黄单胞菌水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo)互作的早期,非亲和互作能够显着诱导抗氰交替呼吸途径的运行,AOX的蛋白浓度较高,同时SHAM抑制处理后使病原菌对交替氧化酶的诱导作用有所减弱；但亲和互作体系的诱导能力延迟于非亲和互作体系的诱导能力。在互作一段时间后(60h),非亲和互作体系诱导AOX的能力仍强于亲和互作体系,SHAM抑制处理后,非亲和互作体系对AOX的诱导低于亲和互作体系,同时该体系中过氧化氢的水平有所提高。说明AOX在寄主植物非亲和互作中具有重要生理功能,可以清除体系中产生的过氧化氢。ROS抑制剂实验显示：过氧化氢对寄主的交替途径活性的影响与交替氧化酶活性蛋白的总量紧密相关；超氧阴离子对寄主交替途径活性及交替氧化酶蛋白的表达影响不大,说明AOX的诱导是通过植物与病原菌互作中产生的过氧化氢而不是超氧阴离子来调控的。
王艳丽[7]2012年在《水稻白叶枯病菌oxyR/ahpF/ahpC基因簇在过氧化氢（H_2O_2）抗性和毒性中的功能分析》文中研究说明在植物—病原菌互作的长期共进化过程中，形成了复杂的氧化—抗氧化作用机制。寄主植物为了抵抗病原菌侵染，会产生氧胁迫作用，体内迅速积累并释放一些活性氧（ROS），以杀死外来入侵的病原微生物;或以ROS作为信号分子激发体内的抗病防卫机制。在这种高氧条件下，病原菌要在寄主植物组织中生存并扩散，就必须建立并活化抗氧化代谢系统。已知细菌抗氧化代谢系统主要通过OxyR、OhrR、SoxR和PerR等转录调控蛋白调控。水稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo）基因组中存在oxyR基因，也存在烷基过氧化氢酶基因ahpC和ahpF，且它们在基因组序列上处于相邻的位置，因此我们推测它们可能对过氧化氢(H_2O_2)的降解起重要作用。为了阐明基因簇oxyR/ahpF/ahpC在H_2O_2降解途径中的重要作用，本文对此展开了以下几方面研究。一、为了阐明Xoo中OxyR的功能作用，构建了基因突变体△oxyR。通过抑菌圈法检测突变体的H_2O_2抗性，结果表明，△oxyR突变体对外源H_2O_2的抗性明显减弱；在进行生长曲线检测时发现，在稳定期时野生型菌量大概为突变体的1.3倍，说明在生长后期病菌的生长速度受到抑制或者裂解速度比野生型快；用剪叶法检测了突变体菌株的致病性，发现突变株致病力显着下降。因此，可以认为OxyR与H_2O_2的降解相关，并且影响Xoo的毒性。二、为了研究oxyR/ahpF/ahpC基因簇的转录调控，采用RT-PCR方法检测了3个基因的转录情况，发现ahpC和ahpF为共转录的。然后通过将lacZ报告基因与ahpC启动子构建载体导入oxyR突变体中，并对lacZ活性进行检测，发现在△oxyR中检测不到lacZ的活性，说明OxyR正调控了ahpC/F基因的表达。叁、为了阐明AhpC/F在抵抗H_2O_2时的作用及其与病菌毒性的关系，构建单基因（ahpC和ahpF）和双基因(ahpC/F)缺失突变体△ahpC、△ahpF和△ahpC/F，这些突变体过氧化氢酶的活性明显增强，大概为野生型PXO99~A的4倍，从而使其对外源H_2O_2的抗性增强，这可能是过氧化氢酶基因的补偿性表达所产生的。突变体对外源H_2O_2的抗性增强的同时，在对数生长期生长缓慢。同时，在突变体内检测到了高浓度的H_2O_2的含量，推测AhpC/F主要功能可能是清除内源H_2O_2。此外，与PXO99~A相比，△ahpC、△ahpF和△ahpC/F在水稻叶片组织中的增殖量明显下降，同时致病性也显着下降，表明AhpC/F与Xoo的毒性相关。总之，本研究结果说明在Xoo中ahpC与ahpF为共转录，而AhpC/F可能对内源H_2O_2降解起重要作用；ahpC/F的转录受到OxyR的正调控，并且AhpC/F是Xoo在培养基及植物中生长所必须的，表明AhpC/F可能在有氧生长以及与植物互作时产生氧化胁迫进行应激反应的重要酶类。
金杨[8]2009年在《水稻类病变突变体spl5细胞坏死机理及其抗病性的研究》文中研究表明植物类病变广泛地代表了一类能自发产生细胞坏死的突变体,这类突变体的突变表型是由于细胞死亡失调引起的,与过敏性反应表型相似,因此类病变突变体是分析植物细胞程序性死亡途径的有效工具。水稻类病变突变体spl5是由粳稻Norin 8经γ射线辐射诱导而成,植株从苗期开始叶片上就会自发地出现红棕色类病斑,属于典型的类病变坏死突变体。对spl5突变体病斑表型发生机理的研究结果表明,O_2~-类活性氧在细胞发生死亡之前就开始积累,并且在只有少数病斑的时候其体内O_2~-浓度达到最高。通过对两个ROI清除酶SOD和CAT活性的测定,spl5突变体内的活性氧清除系统基本没有变化,据此我们推测spl5突变体内活性氧代谢失控可能是由于活性氧的产生系统加强从而导致活性氧的过度积累。对spl5突变体的白叶枯病抗性鉴定结果表明,spl5突变体较野生型显着提高了对白叶枯病菌菲律宾生理小种的抗性,尤其是对PXO145(P8)生理小种,抗性指标达到了高抗水平,另对PXO280(P7)、PXO87(P9)和PXO124(P10)等3个小种达到抗性水平。抗性机理的研究表明接菌后spl5突变体保护酶POD和PAL活性提高快且幅度较大,在整个过程中均能保持较高水平,说明spl5突变体较野生型能更快更强地启动自身的过敏性反应。OsPR1基因通常作为研究植株系统获得性抗性的标记基因,而OsAOS是茉莉酸合成途径的关键调节酶,抗性相关基因的表达分析表明spl5突变体和野生型体内PR基因OsPR1、OsPR3和OsPR8以及茉莉酸合成途径的关键调节酶基因OsAOS均有表达,但spl5突变体内的表达量更高。RT-PCR结果说明spl5突变体内的系统获得性抗性以及茉莉酸信号传导途径在形成病斑时可能已被激活。以上结果表明spl5突变体具有较强的抵御病原菌入侵的能力。为了进一步研究spl5突变体细胞死亡的机制以及spl5突变体与病原菌互作的机制,我们构建了spl5突变体的悬浮细胞系并对影响spl5突变体悬浮系构建的因素进行了分析。结果表明激素2,4-D对于spl5突变体愈伤组织的诱导是必不可少的因素,胞外过氧化物酶偏低以及胞外H_2O_2偏高是导致spl5突变体细胞悬浮系较难建立的原因,所以缩短继代周期有益于spl5突变体细胞悬浮系的构建。
薛高峰[9]2009年在《硅提高水稻对白叶枯病抗性的生理与分子机理》文中研究指明前人对硅在抵御水稻病害中的研究报道多集中在稻瘟病、纹枯病等由真菌引起的病害,而有关硅对由细菌引起的水稻白叶枯病抗性的研究,国内外鲜见报道。本文采用水培试验,研究了在不同方式硅处理条件下,硅对水稻白叶枯病的抗病效果、硅吸收以及对水稻生长的影响;硅对抗氧化系统酶活性及多种与抗病相关的生理生化指标的影响;利用实时荧光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR)技术,在水稻与白叶枯病互作过程中,硅对相关防卫基因表达的调控。从生理生化和分子水平上系统而深入地研究了硅抗白叶枯病的机制,主要结论如下:(1)施硅能显着提高水稻对白叶枯病的抗性,减缓白叶枯病菌的危害。施硅处理感病植株病情指数显着降低,与对照相比降低11.83%-52.12%,对白叶枯病的相对防御效果达16.55-75.82%。后期施硅对水稻抗性提高的效果明显高于前期。接种前施硅处理(+Si-Si)的植株失去部分抗性,接种后施硅处理(-Si+Si)的植株与一直加硅处理(Si+)的植株具有较高的抗性;硅作为“机械屏障”作用在水稻抗白叶枯病中有一定作用,但不是主要作用。硅对水稻生长具有促进作用,施硅能明显提高植株硅含量和干物质累积量。接种白叶枯病菌后,植株地下部和地上部干物质均显着降低。施硅处理的水稻叶片组织迅速坏死,从而阻止了病菌的发展,而不施硅处理的水稻叶片表现为明显的失水、青枯、卷曲、萎蔫现象。(2)接种白叶枯病菌后48 h内,施硅处理的水稻植株,叶片中丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)含量显着升高;施硅能显着提高感病植株叶片中脂氧合酶(LOX)和超氧化物歧化酶(SOD)活性,降低过氧化氢酶(CAT)、过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性,促进过氧化氢(H2O2)在植物体内积累,加强膜脂过氧化作用。因此,硅可通过参与植株体内代谢,调节抗氧化系统酶活性,激发机体过敏反应(HR),诱导植株对白叶枯病的抗性。(3)水稻感染白叶枯病后,施硅能使受白叶枯病菌侵染的水稻叶片中苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)活性以及总可溶性酚和木质素含量显着提高。结果表明,硅能够调控与抗病有关的酚类物质代谢过程,参与植物防卫反应而增强水稻对白叶枯病的抗性。(4)叶片感染白叶枯病菌后,β-1,3-葡聚糖酶活性和几丁质外切酶、内切酶活性均快速上升。β-1,3-葡聚糖酶活性在感染白叶枯病菌的8天内,施硅处理显着高于不施硅处理,接种后第8天达到最大值。整个试验过程中,加硅处理的水稻植株,叶片中几丁质外切酶、内切酶活性明显增加。施硅能提高病程相关蛋白β-1,3-葡聚糖酶和几丁质外切酶及内切酶的活性,从而提高水稻对白叶枯病的抗性。(5)感染白叶枯病菌后,施硅处理能激活Os03g0109600基因的表达,表达量也显着高于不施硅处理,有利于增强该转录因子的活性;在感病后期,施硅抑制转录阻遏物Os03g0126000基因的表达,有助于保持植物正常生理代谢和抗病反应。施硅能调控酚类物质代谢的关键酶PAL基因表达,在感病初期,施硅处理的PAL基因的表达量高于不施硅处理;施硅能诱导Pr1a和Rcht2基因更早更快表达,表达量也显着高于不施硅处理。施硅能显着提高Lox2osPil基因的表达量,同时调控CatA基因的表达,在感病前期能显着抑制CatA基因的表达。结果表明,在白叶枯病菌与水稻互作过程中,硅积极参与对相关防卫基因的诱导和调控,从而产生一系列生理生化抗病机制是硅抗白叶枯病的主要机制。综上所述,硅对水稻生长具有促进作用,施硅能显着提高水稻对由细菌病害引起的白叶枯病的抗性。硅能积极参与生理代谢活动,诱导和调控植物相关防卫基因,产生一系列的防御机制来阻止病原菌的入侵。本研究为防治植物细菌病害提供了既经济高效又安全环保的实用技术,对于发展新型病害综合防治措施,具有十分重要的理论和实际意义。
孙亮庆[10]2008年在《利用水稻悬浮细胞检测水稻白叶枯病菌突变菌株的致病性研究》文中提出水稻抗白叶枯病基因Xa23是从我国普通野生稻(Oryza rufipogon)中鉴定出来的优良基因,对国内外鉴别菌系表现为高抗、完全显性和全生育期抗病。目前未发现能克服Xa23基因抗性的白叶枯病天然菌株。利用Tn5转座系统构建了Xa23鉴别菌株P6的突变体库,约2.4万个突变菌株,期望从中检测出能使携带Xa23基因的水稻材料感病的白叶枯菌株。目前鉴定白叶枯菌致病菌株的方法主要采用水稻植株剪叶接种法和注射接种法,这两种方法工作量大,且往往受水稻生长季节等条件的制约。在实验室条件下,研究利用水稻悬浮细胞系检测P6突变体致病性实验系统,为在细胞水平筛选和研究其它病原菌提供新的思路。研究结果如下:1、以水稻中野1号的成熟胚为外植体,在pH值为5.8的N6诱导培养基上诱导愈伤组织,25℃黑暗条件下继代培养3个月后,可以得到大量胚性愈伤组织。选择淡黄色、质地疏松的胚性愈伤组织为悬浮培养的细胞来源,并在pH值为5.6的N6液体继代培养基中,26℃,110-130rpm,暗光条件下进行悬浮培养,再经过4-6次继代,可获得理想悬浮细胞系。2、亲和菌株XMS-25、XMS-30诱导的水稻细胞死亡率低,在1-78h内与未经处理的对照无明显差异,表明亲和性菌株不能诱导水稻悬浮细胞过敏性反应(Hypersensitive reaction,HR)。在非亲和菌株P6和悬浮细胞非亲和性互作中,48h前互作体系的死亡率和抽提液的颜色变化均不明显;48-60h之间,悬浮细胞死亡率逐渐增加,抽提液的颜色也逐渐加深;60h后,细胞死亡率增至最大,细胞死亡率和抽提液的颜色的变化均趋于稳定。这说明悬浮细胞在48h后开始大量死亡,也说明非亲和菌株能诱导水稻悬浮细胞产生HR。本研究建立了携带Xa23基因的水稻品种中野1号的悬浮细胞系,系统研究了悬浮细胞与白叶枯菌P6及其突变体致病菌株的互作,发现中野1号悬浮细胞与致病菌株互作中存在强烈的HR,溴酚蓝染色细胞抽提液的颜色和OD_(595)值可以作为检测致病菌株与非致病菌株的指标,建立了利用水稻悬浮细胞系检测P6突变体致病性的实验系统。
参考文献：
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[2]. 中国、日本、菲律宾水稻白叶枯菌致病性和遗传多样性分析及文库克隆pA254的功能研究[D]. 张桂英. 南京农业大学. 2009
[3]. 中生菌素对水稻悬浮细胞主要防御酶的系统诱导[D]. 刘桂英. 中国农业科学院. 2004
[4]. 水稻条斑病菌致病相关基因的鉴定与功能研究[D]. 郭威. 南京农业大学. 2011
[5]. 中生菌素对水稻主要防御酶的系统诱导[D]. 蒋细良. 中国农业大学. 2005
[6]. 植物与黄单胞病原菌互作体系中交替呼吸途径的运行及H_2O_2来源与功能分析[D]. 朱艳. 兰州大学. 2011
[7]. 水稻白叶枯病菌oxyR/ahpF/ahpC基因簇在过氧化氢（H_2O_2）抗性和毒性中的功能分析[D]. 王艳丽. 中国农业科学院. 2012
[8]. 水稻类病变突变体spl5细胞坏死机理及其抗病性的研究[D]. 金杨. 浙江师范大学. 2009
[9]. 硅提高水稻对白叶枯病抗性的生理与分子机理[D]. 薛高峰. 中国农业科学院. 2009
[10]. 利用水稻悬浮细胞检测水稻白叶枯病菌突变菌株的致病性研究[D]. 孙亮庆. 广西大学. 2008