（1广西柳州市妇幼保健院重症医学科 广西 柳州 545001）
（2广西柳州市妇幼保健院检验科 广西 柳州 545001）
（3广西柳州市妇幼保健院儿科 广西 柳州 545001）
（4广西柳州市妇幼保健院输血科 广西 柳州 545001）
【摘要】 目的：探讨建立荧光定量PCR法直接检测临床标本的肺炎链球菌并对其进行血清学分型的可行性。方法：针对肺炎链球菌种属特异性基因lytA及该菌常见的21种血清型设计荧光探针及引物，构建Taqman荧光定量PCR法。使用荚膜肿胀试验作为金标准检测PCR方法的灵敏度及特异度，选择1209份临床样本同时做培养及PCR方法，比较两种方法的肺炎链球菌检出率及血清分型情况。结果：构建Taqman荧光定量PCR法灵敏度及特异度分别为94.2%及70%。Taqman荧光探针PCR法鉴定的主要血清型别为19F（43.7%）、6A/B（17.2%）、23F（13.8%）、19A（6.8%），未能分型的肺炎链球菌为17.2%。荚膜肿胀试验鉴定的主要血清型别为19F（39.1%）、6A/B（17.2%）、23F（9.2%）、19A（5.7%），未能分型的肺炎链球菌为28.7%。1209份临床样本仅培养出16份肺炎链球菌，Taqman荧光定量PCR法检出44例肺炎链球菌，其对临床样本肺炎链球菌阳性检出率更高，其差异有显著统计学意义（χ2=13.39，P<0.001）。结论：Taqman荧光探针PCR法灵敏度高、特异度好，能直接对临床样本进行血清学分型，可大幅度缩短肺炎链球菌检测的报告时间。
【关键词】 Taqman荧光探针PCR法；肺炎链球菌；血清分型；荚膜肿胀试验
【中图分类号】R378.1+2 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2017）25-0036-03
Establishment of real - time fluorescence quantitative PCR for rapid diagnosis of Streptococcus pneumoniae and its serum typing
Liang Zhuoxin, Fu Jinjian, Long Yiqin, Wei Haichun.
Guangxi Liuzhou Maternal and Child Health Care Hospital, 1Department of Intensive Medicine, 2Department of Laboratory, 3Department of Pediatrics, 4 Department of Transfusion, Liuzhou 545001, China
【Abstract】 Objective To investigate the feasibility of establishing a quantitative method for the direct detection of Streptococcus pneumoniae in clinical specimens and its serological typing. Methods The fluorescent probes and primers for series of serotypes of Streptococcus pneumonia was designed for the development of Taqman fluorescence quantitative PCR. Capsular swelling test was used as the gold standard to determine the sensitivity and specificity of the PCR method. 1209 clinical samples were selected and cultured at the same time. Results The sensitivity and specificity of Taqman fluorescence quantitative PCR was 94.2% and 70%, respectively. The main serotypes identified by Taqman PCR were 19F (43.7%), 6A / B (17.2%), 23F (13.8%), 19A (6.8%) and 17.2% of Streptococcus pneumonia cannot be typed. The main serotypes identified by capsular swelling were 19F (39.1%), 6A / B (17.2%), 23F (9.2%), 19A (5.7%) and 28.7% of Streptococcus pneumonia cannot be typed. Sixteen cases of Streptococcus pneumoniae were cultured positive in 1209 clinical samples, and 44 cases of Streptococcus pneumoniae were detected by Taqman fluorescence quantitative PCR. The positive rate of Streptococcus pneumoniae detected by PCR was significantly higher than that of capsular swelling method (χ2 = 13.39, P<0.001). Conclusion Taqman Fluorescence Probe PCR method has high sensitivity and good specificity, and it can detected the streptococcus pneumoniae directly from clinical samples and can shorten the reporting time.
【Key words】 Taqman fluorescence probe PCR method; Streptococcus pneumoniae; Serotype; Capsular swelling test
我国每年因肺炎链球菌相关疾病导致儿童死亡人数列全球前10名[1]。现有肺炎链球菌血清分型方法操作复杂，且发热病人常在门诊接受抗生素治疗后才行病原体培养，导致难以培养出肺炎链球菌，对临床诊断提出很大的挑战[2]。TaqMan荧光探针PCR法可克服传统血清学分型的缺点，并可直接用于临床标本检测。我院自2015年10月起对临床样本及培养分离的肺炎链球菌运用荚膜肿胀试验及TaqMan荧光探针PCR法分别进行检测，结果报道如下。
1.研究方法与对象
1.1 研究方法
1.1.1研究对象
⑴研究对象及监测时间 由临床儿科医生收集儿科临床常见发热患儿的样本，在1小时内送达细菌室，由细菌室将标本按要求处理。在本院进行为期1年的监测，研究时间：2015年10月1日至2016年9月31日。根据分子流行病学调查结果，分析7价结合疫苗（PCV7）（4、6B、9V、14、18C、19F、23F）及13价疫苗（PCV13）在柳州市儿童群体中的覆盖情况。
⑵病例纳入标准：①年龄≤12岁；②纳入临床诊断肺炎、支气管肺炎、脑膜炎等感染体征的患儿；③获得患儿法定监护人同意。⑶ 排除标准 除上下呼吸道感染、发热等疑似肺炎链球菌感染的症状，如腹泻、流感样症状的患儿。
1.1.2样本收集与培养处理 标本一部分接种于普通羊血培养基，35℃ 5%CO2孵箱培养24小时，转种形态可疑的菌落，并进行奥普托欣敏感性检测和胆汁溶菌实验，鉴定为肺炎链球菌则存于保存培养基，于-80℃保存，用于荧光定量PCR实验；另一部分标本则直接提取DNA，用于进行荧光定量PCR检测。
1.1.3荧光定量PCR检测方法
⑴引物设计：针对肺炎链球菌种属特异性基因lytA及该菌常见的21种血清型设计引物和探针，见表1。
⑵DNA提取：收集新鲜培养的菌株，用杭州博日科技有限公司试剂盒提取菌株DNA。临床标本的处理按照相同试剂盒操作说明书进行。
⑶TaqMan荧光定量PCR：按照说明书进行。
1.1.4统计分析 将数据导入至肺炎链球菌SS17.0软件，并进行数据分析。样本率的比较用χ2检验，以P<0.05为差异具有统计学意义。
2.结果
2.1 Taqman荧光探针PCR方法的灵敏度及特异度
以传统的肺炎链球菌血清学分型的方法即荚膜肿胀试验作对照，对87株肺炎链球菌菌株对设计的荧光定量PCR方法进行灵敏度及特异度检验。构建的Taqman荧光探针PCR方法对肺炎链球菌血清学分型的灵敏度为94.2%，特异度为70%。
2.2 荚膜肿胀试验及Taqman荧光探针PCR方法血清分型的比较
自2015年10月至2016年9月，运用Taqman荧光探针PCR法对临床培养分离的87株菌株进行血清学分子分型，主要型别为19F（43.7%）、6A/B（17.2%）、23F（13.8%）、19A（6.8%）、15（1.1%），未能分型的肺炎链球菌为17.2%。同时运用荚膜肿胀试验对上述87株肺炎链球菌进行分型，其分离的主要型别为19F（39.1%）、6A/B（17.2%）、23F（9.2%）、19A（5.7%），未能分型的肺炎链球菌为28.7%，见表2及表3。
3.讨论
本研究结果表明荧光定量PCR方法可直接应用于临床标本检测肺炎链球菌及其血清分型，其阳性检出率远高于传统培养法。
现有的肺炎链球菌血清学分型方法是荚膜肿胀试验，被认为是传统的“金标准”[3]。然而，该方法操作复杂，型别间可出现交叉反应，使用该方法，某些菌株无法进行血清学分型[4]。对专业技术知识的要求以及需要活菌进行检测是培养检测系统的主要缺点。事实上，大部分发热病人往往在门诊接受过抗生素治疗后才采样进行病原体培养，加上肺炎链球菌易在培养基上发生自溶，这些因素会导致在培养板上难以长出肺炎链球菌，从而对诊断及以培养为基础进行血清学分型的方法提出了很大的挑战[5]。无需活菌即可进行细菌DNA检测的分子生物学方法，被认为是培养法的一种重要辅助手段，尤其是当抗生素治疗已经开始后再进行病原体检测。
利用分子分型方法对肺炎链球菌菌株进行血清学分型可提高诊断的特异性，却无法将其用于培养阴性的样本。早期的研究认为：由于样本量少或采样前已使用过抗生素，或样本运输、保存的条件不理想等，致使病原体再培养基上分离出来的可能性下降，从而导致培养法常给出假阴性的结果，许多疑似病例无法得到确诊。与传统培养法相比，荧光定量PCR法检测肺炎链球菌及其血清型不用购买昂贵的血清型抗血清，避免高劳动量的临床操作，又能达成准确、简单、高通量地检测血清型[6]。
本研究结果表明，在可分型的72株临床菌株中，由19F、19A、23F及6A/B等5种型别引起的肺炎链球菌血清型别占总的可分型型别的98.6%。在1209份临床样本中检测出的44份肺炎链球菌阳性标本中，可分型的标本为32株，由上述5种型别引起的肺炎链球菌血清型别为100%。
总之，荧光定量PCR方法直接检测临床标本，并对阳性标本进行血清学分型，无需进行细菌培养，不受抗菌药物影响，只需少量临床样本即可检测出来病原体，3～5小时即可完成诊断，不仅能快速对肺炎链球菌感染进行诊断，及时控制病情发展，亦可对肺炎链球菌行血清型分析，其对评价肺炎链球菌的疾病负担、疫苗血清型覆盖率、疫苗免疫学效果评价以及了解该菌血清型与耐药特征之间的关系尤为重要。同时通过建立的荧光定量PCR法检测分离自柳州市儿童的样本，初步了解柳州市儿童肺炎链球菌血清群的分布状况，可填补在本地区监测肺炎链球菌血清型别流行情况的空白，为国家选择适合中国国情的疫苗提供流行病学依据。
【参考文献】
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[2] Resti M，Micheli A，Moriondo M，et al.Comparison of the effect of antibiotic treatment on the possibility to diagnose invasive pneumococcal disease by cultural or molecular methods:a prospective observational study of children with proven pneumococcal infection[J].Clin Therapeutics,2009,31: 1266–1273.?
[3] Arai S,Konda T,Wad A,et al.Use of antiserum-coated latex particles for serotyping Streptococcus pneumoniae[J]. Microbiol Immunol，2001，45:159–162.
[4] Henrichsen J.Typing of Streptococcus pneumoniae:past, present, and future[J].Am J Med,1999,107:50S–54S.
[5]谢兴凤，罗红.肺炎链球菌自溶素与自溶相关性研究进展[J]. 中国病原生物学杂志，2016,12（12）：1154-1157.
[6]王良玉，郭东星，蔚然，等.荧光定量PCR检测肺炎链球菌感染方法的建立[J].中国妇幼健康研究，2016,27（10）：1184-1186.
基金项目:柳州市科学研究与技术开发计划 （2014J030422）；广西壮族自治区卫生厅科研基金(Z2014379)
论文作者:梁卓信1,傅锦坚2（通讯作者）,龙易勤3,韦海春4
论文发表刊物:《医药前沿》2017年9月第25期
论文发表时间:2017/9/7
标签：链球菌论文; 肺炎论文; 荧光论文; 血清论文; 定量论文; 方法论文; 柳州市论文; 《医药前沿》2017年9月第25期论文;