浙江大学医学院附属儿童医院 浙江杭州 310003
摘要：为探讨糖尿病血脂含量的基础研究价值，我们选取了RIP-mOVA小鼠作为自身免疫性糖尿病模型，即转OVA基因的C57BL/6小鼠，在小鼠胰岛素启动子的调控下，小鼠胰岛组织高表达自身膜结合OVA抗原（OVA139-386），通过对小鼠血总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、血浆同型半胱氨酸（Hcy）、超敏C-反应蛋白（hs-CRP）、空腹血糖（FBG）的含量进行测定，进一步分析血脂含量对机体内分泌代谢影响。结果显示，8只RIP-mOVA小鼠血脂、血糖含量与8只正常对照小鼠血脂、血糖含量比较明显增高，组间经t检验差异显著（t<0.05），两组中hs-CRP含量相同，无明显差异。可见，血脂水平对糖尿病的发生和病情监测有重要的研究价值。
关键词：糖尿病；血脂测定；血糖测定
Abstract：To explore the relationship between diabetes mellitus and blood fat，we choose RIP-mOVA transgenic mouse model as objects，which expresses a membrane bound truncated OVA（OVA139-386）sequence under the control of rat insulin promoter（RIP）in pancreatic islets.Then we examine the concentration of total cholesterol，triglyceride，HDL-cholesterol，hs-CRP，homocysteine and fasting glucose in the blood of RIP-mOVA mice.Results show that the levels of blood fat and glucose in the group of RIP-mOVA mice are significantly higher than that in control group，except that of hs-CRP.After t analysis between groups，it shows a marked difference（t<0.05）.Conclusion is important for developing and monitoring of diabetes mellitus.
Keywords：Diabetes mellitus；blood fat；blood glucose
糖尿病是一组由于胰岛素分泌不足或（和）胰岛素作用低下而引起的代谢性疾病，高血糖是其特征，其发病机制是胰岛B细胞的自身免疫性损伤导致胰岛素分泌不足及机体对胰岛素的作用产生抵抗。糖尿病时，脂蛋白可与相应抗体结合形成复合物，复合物被氧化和糖基化修饰后，在红细胞、内皮细胞等细胞分泌的细胞因子以及黏附分子共同参与下促进粥样硬化的形成[1]。长期高血甘油三酯（TG）促进泡沫细胞产生而加速动脉粥样硬化发展，还可导致B细胞功能损害，B细胞破坏，胰岛素抵抗增加。同型半胱氨酸（Hcy）是体内蛋氨酸的代谢产物，血浆Hey升高可以造成内皮损伤及功能异常，刺激血管平滑肌细胞增生，破坏机体凝血和纤溶的平衡，对脂代谢产生影响等进而导致动脉粥样硬化[2]。超敏C-反应蛋白（hs-CRP）是一种敏感的非特异性炎症标志物，是肝脏分泌的白细胞介素6（IL-6）调控下的一种急性时相蛋白[3]，其可通过多种途径介导和引起血管损伤，介导和加重血管动脉粥样硬化。因此，本实验选取了RIP-mOVA模型小鼠，对8只RIP-mOVA小鼠血脂、血糖含量与8只正常小鼠（对照组）血脂、血糖含量进行了测定，现将实验结果报道如下。
1.材料与方法
1.1 实验动物
C57BL/6小鼠，8只，雌性，6-8周，购自上海必凯实验动物有限公司。RIP-mOVA小鼠，即转OVA基因的C57BL/6小鼠，在小鼠胰岛素启动子的调控下，小鼠胰岛组织、肾近端小管和睾丸高表达自身膜结合OVA抗原（OVA139-386），8只，雌性，6-8周，饲养于浙江大学实验动物中心。
1.2 仪器
日立7170A全自动生化分析仪
快速血糖仪（德国Bayer公司的Glucometer）
Behring Nephelometer 100特定蛋白分析仪
IMMULITE化学发光仪
1.3 试剂
血清总胆固醇（TCHO）、甘油三脂（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、空腹血糖（FBG），试剂、定标品及质控品均由日本第一化学公司提供；hs-CRP试剂及定标品由日本奥林巴斯公司提供；DPC试剂盒。
1.4 实验方法
取尾静脉血1滴，用Glucometer测定随机血糖。
小鼠处死前用摘眼球法取全血，4℃、5000g 离心10min，血清置-20℃保存待测。血糖、胆固醇、甘油三酯、HDL-C采用日立7170A全自动生化分析仪及配套试剂，TC、TG采用酶法，HDL-C采用直接法，空腹血糖（FBG）测定应用葡萄糖氧化酶法；取血清100ul，hs-CRP参照试剂盒说明书采用免疫散射比浊法（RIA），运用Behring Nephelometer 100特定蛋白分析仪测定；同型半胱氨酸（Hcy）测定应用ELISA法（DPC试剂盒、IMMULITE化学发光仪）。
1.5 统计学处理
采用SPSS统计软件，计算时符合正态分布的计量资料用表示，不符合正态分布者取以l0为底对数计算值表示。计量资料组间采用方差分析，计数资料组间两两比较采用t检验。相关分析采用线性相关分析。单因素相关检验采用Pearson相关分析，以P<0.05做为差别有显著性的标准。
2.结果
两组血脂、血糖含量测定结果见表1。
根据实验组与对照组所测结果比较，TC、TG、Hcy、FBG明显高于对照组，HDL-C略高于对照组，hs-CRP两组无差异。经统计学处理得t值，t<0.05为差异性显著。
自身免疫性糖尿病的危险因素分析：logistic逐步回归分析表明，糖尿病的发病危险因素有FBG、TC、TG、Hcy。
经Pearson相关分析显示：单因素相关分析表明，自身免疫性糖尿病与TC呈正相关（r=0.788，P<0.05），与TG呈正相关（r=0.919，P<0.05），与Hcy呈正相关（r=0.885，P<0.05），与FBG呈正相关（r=0.981，P<0.05），与HDL-C相关（r=0.376，P>0.05），与hs-CRP不相关。
偏相关分析表明，在校正Hcy、hs-CRP、HDL-C影响后，FBG与TG、TC呈正相关（r=0.755，0.793，P<O.05）；在校正Hcy、hs-CRP、HDL-C、FBG影响后，TG与TC呈正相关（r=0.748，P<O.05）。
3.讨论
糖尿病是一组由于胰岛素分泌不足或（和）胰岛素作用低下而引起的代谢性疾病，高血糖是其特征，其发病机制是胰岛B细胞的自身免疫性损伤导致胰岛素分泌不足及机体对胰岛素的作用产生抵抗。
Ⅱ型糖尿病（T2DM）是一组常见多发、以慢性血糖水平增高为特征的代谢疾病群，常合并脂肪代谢紊乱及动脉粥样硬化及全身血管的病变，病人多伴有肥胖或体重过重，脂肪细胞是炎症产生的重要基地，在2型糖尿病合并其它代谢综合征表现的患者中，高血糖、高血压、高甘油三酯、低高密度脂蛋白、动脉粥样硬化等表现型越多，血清hs-CRP等炎性物质的水平越高[3]。此外，脂肪细胞分泌TNF-α会增多，TNF-α通过抑制胰岛素信号通路中的胰岛素受体底物1的酪氨酸磷酸化，下调脂肪细胞的葡萄糖转运子4等作用直接或间接地介导胰岛素抵抗。脂蛋白可与相应抗体结合形成复合物，复合物被氧化和糖基化修饰后，在红细胞、内皮细胞等细胞分泌的细胞因子以及黏附分子共同参与下促进粥样硬化的形成[1]，甘油三酯（TG）含量增高促使动脉粥样硬化的形成[4]。
但HDL-C却能逆转动脉粥样硬化的形成，它具有抗氧化、抗感染、抗血栓和抗炎作用，可抑制血管炎症，促进血管舒张和血管内皮修复，更重要的是可以促进胆固醇从体内排出，从而减少斑块和巨噬细胞中的脂质数量，有效预防动脉粥样硬化发生。实验中我们也发现，血TG水平与HDL-C水平之间差异有显著性，P<0.05，提示TG水平的升高和HDL-C水平的降低是糖尿病脂代谢异常的特点，与文献相符[5]。
糖尿病的不断进展与高血糖的毒性和血脂异常所致的高血脂毒性密切相关的。葡萄糖刺激胰岛素分泌是体内最主要的刺激胰岛素分泌的方式。一定量的高血糖可使B细胞胰岛素储存减少或胰岛素胞吐受抑，此时葡萄糖调节的敏感性即告丧失，如能及时良好控制血糖水平，这种葡萄糖正性调节失调可以逆转；但如长期过高血糖负荷，则最终引起不可逆的胰岛素基因转录的反常性负调节，使胰岛素分泌下降。高TG血症者，其血中游离脂肪酸（free fat acid，FFA）水平明显上升，FFA在B细胞内氧化代谢水平的增高，抑制了葡萄糖的氧化代谢，从而引起了胰岛素刺激的胰岛素分泌障碍，其升高严重的患者会严重抑制胰岛素分泌，最终导致胰岛素分泌障碍和胰岛素抵抗[6]。此外，在肥胖糖尿病的动物模型研究中观察发现TG在细胞内堆积几乎与高血糖同时发生与进展。提示高TG血症对血糖代谢的具有不利影响及损害B细胞功能，加重胰岛素抵抗，从而加重葡萄糖代谢障碍。
大多数文献报道Ⅱ型糖尿病血TC水平也增高，并且TC、TG水平增高与2型糖尿病病情轻重、病程和有无大血管并发症有关，我们在实验中也验证了这一点，血TG水平与血TC水平之间差异有显著性，P<0.05。
另外，同型半胱氨酸（Hcy）是动脉粥样硬化的危险因子之一。其主要机制为氧化生成二聚体时产生过氧化氢，释放氧自由基对血管内皮有直接细胞毒作用；促进血管平滑肌细胞增生；使血小板存活期缩短，促进血小板凝聚和黏附；增加凝血因子V、X的活性，抑制组织纤溶酶和抗血栓形成因子Ⅲ、Ⅶ活性；促进动脉壁低密度脂蛋白（LDL）氧化为氧化LDL，巨噬细胞吞噬氧化LDL后成为泡沫细胞而始动动脉粥样硬化过程[7]。本研究结果发现实验组中，血TG水平与血Hcy水平之间差异有显著性，P<0.05，提示Hcy对糖尿病程中动脉粥样硬化的形成和发展都起了促进的作用。肾脏是Hcy代谢与消除的主要场所，肾脏存在Hcy再甲基化和转硫基的多种酶系，约70％的Hcy从肾脏排泄。研究发现血Hcy水平与肾小球滤过率呈负相关。糖尿病肾损害是T2DM患者高Hcy血症的主要决定因素[8]。Tessari等[9]研究发现T2DM患者甲硫氨酸的转甲基作用和同型半胱氨酸的清除较正常对照者下降，而且胰岛素诱导的甲硫氨酸转甲基作用和同型半胱氨酸的转硫基作用及清除显著降低，容易发生高Hcy血症。应用葡萄糖钳夹试验研究发现输注胰岛素后，正常人血浆Hcy水平均有所下降。而伴胰岛素抵抗的T2DM患者无论给予大剂量还是小剂量胰岛素，血浆Hcy水平都无变化；推测胰岛素对葡萄糖弥散的抵抗作用与胰岛素对Hcy代谢的影响有关。另外胰岛素也可通过其他激素的作用而影响血清Hcy水平，高Hcy血症可能是糖尿病代谢异常的一部分。总之，胰岛素抵抗重，胰岛素作用效果差，较早发生糖尿病肾损害，结果Hcy的分解代谢下降，肾脏排泄及肾小管代谢Hcy减少，并有继发性的Hcy代谢异常，共同造成高Hcy血症。
炎症反应参与T2DM的发病机制。超敏C-反应蛋白（hs-CRP）是一种敏感的非特异性炎症标志物，是肝脏分泌的白细胞介素6（IL-6）调控下的一种急性时相蛋白[3]，其可通过多种途径介导和引起血管损伤，介导和加重血管动脉粥样硬化，已经被认为是心血管疾病的独立危险因素。另外，在糖尿病病人的病程中全身血管慢性炎症在动脉粥样硬化的起始和发展阶段中起重要作用。血清hs-CRP增高，提示心血管疾病的发生与发展。我们的研究发现，实验组与对照组的的hs-CRP无差异，它表明RIP-mOVA小鼠中并不存在急性时相反应，也非低度慢性损害状态，意味着小鼠暂时还没有相关的心血管疾病的发生。此外，hs-CRP水平与血TG、TC、Hcy、FBG水平也不相关，这也告诉我们，本来Ⅱ型糖尿病的发病机制中存在炎症反应的发生，其中来源于巨噬细胞、脂肪细胞及内皮细胞分泌的IL-6、TNF-α、IL-1等炎性因子，由于长期过度分泌，导致胰岛B细胞分泌胰岛素功能受损及产生胰岛素抵抗，同时这些因子均可导致肝脏CRP合成增加，进一步发挥免疫调节功能，但为什么hs-CRP的水平不会升高还需进一步研究。
糖尿病系终身疾病，此类病人经减肥和降脂后可得到明显改善。为避免动脉粥样硬化发生的危险，降低TG和提高HDL-C水平也是一个不可忽视的问题。近年来国内外提倡开展个体化及强化和通讯技术干预的教育措施，Ⅱ型糖尿病人在克服不利因素的基础上治疗目标是控制血糖，但血脂水平的改变也应同步引起关注。本实验通过对RIP-mOVA小鼠血脂、血糖含量的检测及分析，将有助于糖尿病的基础研究。
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论文作者:王成
论文发表刊物:《健康世界》2017年第1期
论文发表时间:2017/2/24
标签：胰岛素论文; 小鼠论文; 糖尿病论文; 水平论文; 血糖论文; 细胞论文; 动脉论文; 《健康世界》2017年第1期论文;