兰和魁[1]2000年在《肺表面活性物质相关蛋白A1在大肠杆菌及酵母中的表达与纯化》文中提出呼吸窘迫综合征是一种严重危害人类健康的原发性或继发性疾病，主要病因是肺表面活性物质（PS）的缺乏或者功能不足。PS替代治疗是唯一有效的治疗手段，目前临床所使用的PS主要为动物肺组织和人羊水提取物，但是制备比较困难，产品价格昂贵，不能满足临床的迫切需要，因此人工合成磷脂和肺表面活性相关蛋白质基因工程产物生产PS将是获得大量PS的理想途径。肺表面活性物质相关蛋白A（SP-A）在调节磷脂代谢、调控其它相关蛋白质基因表达、发挥内在免疫方面具有极其重要的功能。人SP-A基因定位于染色体10q21-24，由两个功能基因SP-A1、SP-A2和一个假基因组成，两种基因产物有97％的同源性。人SP-A（hSP-A）属糖结合蛋白家族，主要由Ⅱ型上皮细胞合成。SP-A单体由248氨基酸组成，相对分子质量约26～38kDa。本研究将正常中国人SP-A1基因克隆至多种表达系统并获得高效表达。 将hSP-A1基因克隆到原核表达载体pGEX-2T，转化至E.coliJM101、JM105、JM109、XL1-blue和BL21（DE3）等不同宿主中表达，经IPTG诱导后目的蛋白质GST/SP-A1的表达量为6-15％，于28℃时，该基因在BL21（DE3）宿主中表达产物均为完整蛋白质（52kDa），表达产物占总蛋白质10％，而其它宿主中均有不完全蛋白质（41kDa）表达。经包涵体纯化和GST-Purification Kit纯化得到52kDa的融合蛋白质，纯度为95％，Thrombin酶切后可得到26kDa的SP-A1，两者均能被抗-SP-A的多克隆抗体识别，具有较好的免疫反应性。GST/SP-A1免疫兔和小鼠获得的多克隆抗体能识别天然的SP-A。 重组pVT105U/α-SP-A1转化Saccharomyces cerevisiae S-78，在酵母普通培养基及营养丰富培养基中表达出相对分子质量分别为62kDa和32kDa的蛋白质，表达量约200mg/L，经Sephadex G-25层析柱分批脱盐和 Sepharose 4B层析，纯度达到 95％，目的蛋白质可被兔抗人－SP－A多克隆抗体和鼠抗人－SP－A单克隆抗体特异性识别，体外杀伤实验表明SP－AI 能增加肺巨噬细胞对E．COIi的吞噬和清除功能。 将人SP－AI基因克隆至酵母分泌表达载体PPICg，转化至甲醇营养酵母 Pichia pastoris，得到大量表型是His”Mut“（A0xl＋A0xZ“）的重组菌株和少量表型为 HIS”MSt’M－AOXZO的重组体，以甲醇诱导AOXI 启动子高效表达的SP－AI，表达量约为400mg／L，用SephadexG－25层析脱盐和Sepharose 4B层析得到相对分子质量约32kDa的目的蛋白质，具有调理肺巨噬细胞对病原体的吞噬作用。 综上所述，SP－AI在大肠杆菌、S。CChs。OWC。S C。”””‘S“”S－78、Pichia P。storis中获得表达，酵母表达产物具有调理肺巨噬细胞吞噬病原体的活性，后者的表达产物活性更高，且可高密度发酵诱导表达。
王霞[2]2002年在《肺表面活性物质相关蛋白A1在甲醇酵母中的表达与纯化》文中研究说明呼吸窘迫综合征(RDS)是导致早产儿死亡的主要因素并与一定的遗传背景有关。PS替代治疗是唯一有效的治疗手段。与RDS同样，肺表面活性物质(PS)的功能或成分的改变与其它呼吸系统疾病相关；如成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、特异性肺纤维化(IPF)和肺部感染。目前临床使用的PS主要为动物肺组织和人羊水中提取物，价格昂贵，不能满足临床的需要，因此人工合成磷脂和基因工程产物生产PS将是获得PS的最佳途径。 PS是由肺Ⅱ型细胞合成与分泌的一种脂蛋白复合物，肺表面活性物质相关蛋白(SP-A)是PS中含量最丰富的蛋白质，有多种生理功能。SP-A基因定位于染色体10q21-23，由两个功能基因SP-A1、SP-A2和一个假基因组成，两种基因在核苷酸水平有94％的同源性，基因产物有97％的同源性。SP-A单体由248个氨基酸组成，相对分子量约为26～38kDa。 甲醇酵母作为单细胞真核生物，既具有大肠杆菌或酿酒酵母的繁殖快、易于培养和便于基因工程操作的特性，又具有高等真核表达系统的蛋白质折叠和翻译后加工功能。并且外源蛋白质表达水平高，还能分泌外源蛋白质到培养夜中，便于蛋白质的纯化。因此，最近十多年来，酵母作为一种基因工程表达系统受到广泛关注。 本研究将正常中国人的SP-A1基因分别克隆至酵母分泌表达载体pPIC9K和胞内表达载体pPIC3.5K中，转化至甲醇营养型酵母Pichiapastoris系统，获得HIS+Mut+和HIS+Muts的重组体，经过G418抗性筛选，筛选出高拷贝重组体。以甲醇诱导，筛选高效表达的重组菌种。通过优化表达条件，目标产物在摇瓶发酵液中高效表达，可达200mg／L。将筛选到的高效表达的重组菌种转入发酵罐中高密度发酵、诱导表达，经过离心和超滤，得到粗提SP-A1，再经过凝胶过滤层析和高效液相色谱(HPLC)进一步纯化、鉴定，得到相对分子量约为32kDa的目的蛋白，表达量为 0．93g／L，纯度为 95q／o以上。 本研究表达的SPAI具有免疫原性，可刺激小鼠产生抗SP叭抗体，并具有生物活性，可调理肺巨噬细胞吞噬病原体。
王霞, 封志纯, 兰和魁, 任大明, 杜江[3]2002年在《人肺表面活性相关蛋白A1在甲醇酵母的胞内表达》文中认为目的 研究人肺表面活性相关蛋白A1(SP A1)在甲醇酵母中的胞内表达。方法 将编码正常人肺表面活性相关蛋白A1基因的cDNA克隆至甲醇酵母的胞内 ,表达载体pPIC3.5K ,构建了重组质粒 pPIC3.5K/SPA1,电穿孔方法转化至酵母宿主菌GS115和KM 71,用PCR方法筛选阳性转化子 ,并用斑点印迹法、G4 18方法筛选多拷贝转化子 ,经甲醇诱导表达 ,SDS PAGE和Western印迹法鉴定表达产物。结果 SP A1基因在甲醇酵母中成功的表达了蛋白质 ,SDS PAGE分析证实目的蛋白分子量为 32kD ,可被SP A多克隆抗体特异识别。结论 人组织特异SP A1蛋白可在甲醇酵母中高效表达 ,表达产物具有免疫源性。
兰和魁, 封志纯, 黄建生, 郑维扬, 陈丽珊[4]2001年在《人肺表面活性相关蛋白A1在酿酒酵母中表达、纯化及活性分析》文中指出将编码正常人肺表面活性物质相关蛋白A1基因的cDNA克隆至酿酒酵母的分泌表达载体pVT10 2U α中 ,构建了重组质粒pVT10 2U α SP A1,转化酵母宿主菌S 78,通过改变培养基的pH值水平 ,经摇瓶培养 ,SDS PAGE结果显示 ,培养上清中SP A1表达量达 40 0mg L以上 ,表达产物分子量为 6 2kD和 32kD。分别以二聚体和单体形式出现。ELISA和Westernblot实验表明表达产物能被抗体特异性识别。生物学活性检测证实其具有调理肺巨噬细胞吞噬E .coli的功能。
任育红[5]2005年在《新型重组别藻蓝蛋白亚基的表达和生物活性的初步研究》文中提出为了研究重组别藻蓝蛋白?镭普克(recombinant allophycocyanin,rAPC)的抗肿瘤机理及筛选更强的抗肿瘤蛋白,本实验进行了重组别藻蓝蛋白及其亚基基因分别在毕赤酵母和大肠杆菌中的表达、表达产物的性质及生物活性的初步研究。将 apc 克隆到表达载体 pPIC6αA 中,用氯化锂法转化毕赤酵母菌株 X-33,Western blot 检测工程菌的培养基上清液,表明重组别藻蓝蛋白(YAPC)由两种亚基组成,相对分子质量分别为 19kD 和 21kD;5 mmol/L LaCl3使表达量提高110%,同时缩短了最适培养时间,摇瓶培养 48h 最高表达量为 4.4 mg/L。重组大肠杆菌 P2、P3 和 PMBP 表达的新型重组别藻蓝蛋白亚基 MαAPC 和 MβAPC 以及 rMBP,用 Amylose 亲和层析分离纯化,经 SDS-PAGE 和 HPLC 检验纯度达 88%以上;相对分子质量分别为 61kD,61kD 和 43kD;最大吸收波长分别为 275nm、285nm 和 281nm;经 Western blotting 检测,MαAPC和 MβAPC具有与天然 APC 相同的免疫原性。含 pET-28a/APC 载体的大肠杆菌 P4表达的重组别藻蓝蛋白 HAPC,经金属螯合亲和层析法分离纯化,纯度达 90%以上;其α亚基和β亚基的相对分子质量分别为 21kD 和 17kD;HAPC 最大吸收波长为 235nm;具有与天然 APC 相同的免疫原性;邻二氮菲—Fe2+氧化法和邻苯三酚自氧化反应速度测定结果显示:HAPC 具有较强的清除羟自由基和超氧阴离子自由基的能力;药理生理学实验结果显示:HAPC 具有显著升高白细胞活性和一定的肿瘤抑制活性。运用 MAPPP 和 ProPred 及 ABCpred 服务器对 HAPC 和 rMBP 中的 T 细胞表位和 B 细胞表位进行了预测,结果显示两种重组蛋白都有多种通用 T 细胞表位和 HLA 限制性表位及 B 细胞表位,提示具有免疫促进功能,为确定免疫药理靶点奠定了基础,可作为多抗原肽疫苗有一定的应用前景。本文实现了重组别藻蓝蛋白基因在毕赤酵母中的异源表达。首次发现 LaCl3可增加毕赤酵母表达系统的表达水平,从而有效地降低成本并缩短生产流程。重组别藻蓝蛋白及亚基的表达、纯化方法的建立及生物活性的初步分析,为深入研究重组别藻蓝蛋白的抗肿瘤机理以及开发基因工程新药奠定了基础。
王霞, 封志纯, 兰和魁, 任大明, 杜江[6]2004年在《SP-A1在甲醇酵母中的分泌表达及产物的鉴定》文中研究指明目的 :研究人肺表面活性物质相关蛋白A1 (SP A1 )在甲醇酵母Pichiapastoris(P .pastoris)中的分泌表达、产物的分离纯化及免疫活性测定。 方法 :将人SP A1基因克隆至P .pastoris的分泌表达质粒pPIC9K上 ,获得重组表达质粒pPIC9K/SP A ,转化P .pastorisGS1 1 5、KM71。通过G4 1 8筛选获得高拷贝转化子 (HIS4Mut+ ) ,在摇瓶中培养、甲醇诱导表达SP A1 ,纯化目的蛋白 ,并免疫小鼠 ,ELISA法和westernblotting分析SP A1的免疫活性。 结果 :SDS PAGE结果显示 ,在P .pastoris中经甲醇诱导 ,SP A1获得表达 ,其表达量在上清中为 2 0 0mg/L。经过纯化可获得纯度达 95 %以上的蛋白质。ELISA法和westernblotting结果表明 ,目的蛋白可被多克隆抗体识别 ,可刺激小鼠产生抗体。 结论 :人组织特异性蛋白SP A1可在P .pastoris中表达 ,表达产物具有免疫原性
张峰[7]2012年在《重组猪肺表面活性蛋白A在体外抑制PRRSV感染宿主细胞的研究》文中研究指明猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)引起的妊娠母猪发热流产,仔猪与育肥猪呼吸障碍为特征的传染病,是目前危害养猪业最为严重的传染病之一,给我国的养猪业带来了巨大的经济损失。国内外学者已经对PRRS进行了大量的研究,对其致病机理等方面有了深入的了解。PRRSV是RNA病毒,感染的主要途径为呼吸道,其宿主细胞为猪肺泡巨噬细胞(Porcine Alveolar macrophage,PAM),病毒在不同亲代之间变异较大。由于没有有效的疫苗控制病毒的感染,所以动物体的天然免疫系统对该病毒的抵御作用显得异常重要。天然免疫系统不仅能及时清除外来的病毒,同时也可促进或激活机体的获得性免疫系统。已有研究表明,SP-A分子中含有能够识别病毒表面多糖分子的结构域,具有一定的抗病毒作用。所以在目前尚无有效的PRRS疫苗的情况下,通过研究SP-A抗PRRSV感染宿主细胞的作用,从先天性免疫方面为抗PRRSV感染的研究提供了新的途径。因此,为研究SP-A是否具有抗PRRSV感染宿主细胞的活性,我们制备了重组猪SP-A蛋白,并在体外进行了与PRRSV相互作用的研究。本实验首先采用PCR方法从含有猪SP-A基因的质粒中扩增SP-A基因,并将其插入到含有人CD5信号肽序列的真核表达载体pcDNA3.1A-CD5中,构建成SP-A基因的真核分泌型表达载体pcDNA3.1-CD5-SPA/MH。将重组表达载体通过磷酸钙介导转染HEK293T细胞进行瞬时表达,通过Western blot方法鉴定表达产物,采用Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析法从培养基中分离和纯化重组SP-A蛋白,通过ELISA方法检测SP-A蛋白与PRRSV的结合活性。将SP-A蛋白与PRRSV孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,感染72 h后测定病毒滴度,分析重组猪SP-A蛋白对PRRSV感染的抑制作用。结果表明构建的真核表达载体能够介导SP-A基因在HEK293T细胞中进行分泌表达;表达的重组猪SP-A蛋白能够与PRRSV进行剂量依赖性结合;用重组猪SP-A蛋白与PRRSV进行孵育,然后感染MARC-145细胞和猪肺泡巨噬细胞,结果显示SP-A处理的PRRSV感染细胞后的病变程度显著低于对照组。感染72 h后,SP-A处理组的PRRSV在MARC-145细胞和PAM细胞的滴度显著低于SP-A非处理组。综上所述,可以得出以下结论:重组猪SP-A蛋白在体外对PRRSV的感染有显著的抑制作用,具有抗PRRSV的活性。
李兰[8]2016年在《重组胶原样凝集素的体外抗 PRRSV 活性研究及 PRRSV-GEM 纯化技术的建立》文中指出猪繁殖与呼吸综合征(porcine reproductive and respiration syndrome, PRRS),是由PRRSV引起的一种急性高度传染性的疾病,虽然科学家在防控方面已经做了大量的工作,仍然是危害生猪养殖业的重大疫病之一,给全世界的生猪养殖造成了重大的经济损失。目前控制PRRSV的主要措施包括生产管理因素、后备母猪适应策略和疫苗免疫等,但对这种极具破坏力的疾病以上措施还是不能满足生猪养殖业的需要,因此为更好地控制该病在猪群中的发生与流行,对PRRSV的致病机制、免疫逃避机制等进行更深入研究的基础上,应寻求更好更有效的PRRSV防治措施。本文利用Bac-to-Bac表达系统表达了猪SPA/Ficolin和PA-Ficolin/SPA两类四种蛋白,以抗病毒药物和PRRSV纯化为出发点,探索了猪SPA的抗PRRSV作用及GEM-PA-Ficolin/SPA体系对PRRSV细胞毒的浓缩纯化技术,旨在为PRRSV的防控提供一个更好的研究方向。1.利用Bac-to-Bac系统表达猪SPA/Ficolin和PA-Ficolin/SPA两类四种蛋白本研究采用Bac-to-Bac系统进行猪SPA/Ficolin和PA-Ficolin/SPA两类四种蛋白的表达。利用Primer Premier 5.0设计特异性引物,为方便目的蛋白的纯化和检测,引物中引进了His-Tag,以实验室已构建好的含有猪SPA、Ficolin和锚钩PA基因的重组质粒为模板,进行PCR扩增,获得的PCR产物克隆至PMD-18T载体,双酶切鉴定正确后进行测序分析,将鉴定为正确的阳性质粒命名为18T-Ficolin、18T-SPA和18T-PA。利用限制性内切酶EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ分别对18T-Ficoln、18T-SPA和pFastBac1转移载体进行酶切,利用T4 DNA连接酶分别进行目的片段与pFastBac1转移载体的连接,然后将连接产物转化至DH5α感受态细胞,得到重组转移载体pFast-SPA和pFast-Ficolin;为节省时间重组转移载体pFast-PA-SPA和pFast-PA-Ficolin的制备采用三组份一步连接法,具体步骤如下：利用限制性内切酶对杆状病毒转移载体质粒和含有目的基因的重组质粒进行双酶切,利用T4 DNA连接酶进行SPA、PA和pFastBacl的连接及Ficolin、PA和pFastBac1的连接,然后转化,得到重组转移载体pFast-PA-Ficolin和pFast-PA-SPA。重组转移载体pFast-SPA/pFast-Ficolin、pFast-PA-SPA/pFast-PA-Ficolin和pFastBac1分别转化含有穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态细胞,经三轮蓝白斑筛选及PCR鉴定获得重组Bacmid即：rBacmid-SPA、rBacmid-Ficolin、rBacmid-PA-SPA、rBacmid-PA-Ficolin和rBacmid-pFast,同时挑取蓝斑得到野生型Bacmid。上述Bacmid转染sf9细胞,收获培养上清,利用通用引物M13F/R进行PCR鉴定,鉴定正确的说明转染成功,得到的重组毒命名为rBV-SPA、rBV-Ficolin、rBV-PA-SPA、 rBV-PA-Ficolin、rBV-pFast及野生型杆状病毒BV。扩繁后进行蛋白表达。Western Blotting结果说明除Ficolin外,SPA和PA-Ficolin/SPA三种蛋白都能进行可溶性表达,可以用于后续研究。其中猪SPA还需要进行纯化、脱盐、除菌等操作获得高纯度的目的蛋白进行抗病毒的研究。2.重组猪SPA的表达及其抗病毒活性和作用机制初探关于凝集素抗微生物的研究,在人医领域研究较多,在兽医领域研究相对较少,而关于动物凝集素抗PRRSV的研究资料非常有限。本研究表明重组猪SPA (RpSPA)能够显著降低PRRSV在Marc-145上的感染,30 μg·mL-1 RpSPA使蚀斑减少77%,15 μg·mL-1 RpSPA使蚀斑减少43%,呈现出一定的剂量依赖性,同时能够降低PRRSV总RNA及总蛋白水平,并且SPA具有钙离子依赖性,提示SPA中和PRRSV的作用可能是由其碳水化合物结构域介导的。进一步研究发现RpSPA主要通过抑制PRRSV吸附于Marc-145细胞而发挥抗病毒作用,对病毒内化的作用较弱,且随着RpSPA加入时间的延迟抑制效应逐渐降低,提示病毒进入细胞后RpSPA则不能发挥作用；Real-Time qPCR结果显示病毒只进行一个复制周期时,RpSPA对PRRSV总RNA水平没有影响,而病毒进行多个复制周期时却导致PRRSV总RNA水平显著下降,提示RpSPA可能作用于释放的子代病毒,使其丧失继续感染细胞的能力。研究显示PRRSV表面糖蛋白能够介导病毒的入侵,RpSPA很可能通过与PRRSV表面的糖蛋白GP2、GP3、GP4或GP5中的一种或几种结合,从而阻断了病毒入侵途径,然而由于对靶细胞、PRRSV及RpSPA之间相互作用的了解还不十分清楚,上述作用机制模式还需要进一步的研究加以验证。3.构建GEM-PA-Ficolin/SPA病毒纯化体系本研究的GEM纯化体系的设计构想为：首先GEM颗粒与具有锚定功能的融合蛋白,即锚钩蛋白PA-凝集素(Ficolin或SPA),进行结合,然后利用凝集素对PRRSV的特异性结合而实现病毒纯化。具有锚定作用的融合蛋白的设计是本研究中实现病毒纯化的关键,本研究采用Bac-to-Bac表达系统制备的PA-Ficolin/SPA具有预想的功能,即通过PA与GEM的特异性结合使融合蛋白展示在GEM颗粒表面,同时通过凝集素Ficolin/SPA与PRRSV的特异性结合使PRRSV也结合在颗粒上,另外,Ficolin/SPA的微生物结合谱比较广泛,还可以与HIV, HCV, AIV等结合,提示不仅可以纯化PRRSV,还可以纯化所有可以与SPA和Ficolin结合的病毒。说明本研究建立的病毒纯化体系具有广泛的应用。
孙英新[9]2011年在《螺旋藻藻蓝蛋白抗百草枯诱导大鼠肺纤维化的研究》文中研究指明海洋是药物的宝库，近年来，随着海洋生物学研究的不断深入，发现许多海洋藻类含有多种特有的天然的药用活性物质。藻蓝蛋白(Phycocyanin, PC)主要存在于蓝藻、红藻、隐藻和少数一些甲藻中，是藻胆蛋白的重要组分，在螺旋藻中的含量较高。研究表明，PC具有抗炎症、抗氧化、清除自由基、抗肿瘤等生理活性，为螺旋藻在保健和药用领域的开发提供重要的依据。百草枯（Paraquat, PQ），是目前世界范围内应用最广泛的除草剂之一。随着在我国农业上的广泛应用，PQ中毒也日趋增多。PQ对人畜均有较强毒性，致死剂量小，发展快且无特效解毒药物，临床上病死率很高。肺为PQ中毒的主要靶器官，大剂量中毒常由于急性肺损伤所致的呼吸衰竭及心、肝、肾等多脏器功能衰竭而死亡；较小剂量的中毒往往引起迟发性的肺纤维化，病程相对较长，晚期多死于肺间质纤维化所致的呼吸衰竭。传统的糖皮质激素和细胞毒药物长期应用副作用大，疗效并不理想。因此寻找行之有效的治疗药物是目前医疗界迫切需要解决的问题。PQ的中毒是多系统、多器官、多水平的，中毒机制尚未完全阐明，但多数学者认为，其中毒机制在于氧化损伤。PC能有效地清除氧基自由基，有较强抗氧化能力，对小鼠或大鼠炎症模型具有明显的抑制作用。这些活性作用对PQ中毒有潜在的治疗效果。目前，海洋药物尚未用于中毒治疗学研究，本课题研究的主要目的旨在研究PC对抗急性PQ中毒引起的急性肺损伤和肺纤维化作用，以期为临床救治和探索海洋药物治疗急性中毒提供科学依据。本研究首先对钝顶螺旋藻中的PC进行了提取和纯化。采用磷酸盐缓冲液循环冻融联合超生波破碎法，50%硫酸铵沉淀获得PC，提取率达到13.2%。粗蛋白提取液再经过两次羟基磷灰石柱(HA)层析和sephacrylS-200HR凝胶层析对其进行纯化，纯度比（A620/A280）达到4.75。然后我们对PC抗PQ诱导肺纤维化进行了研究：（1）肺组织病理变化：①苏木精伊红染色法(hematoxylin-eosin staining, HE)：模型（PQ）组1-7d以急性肺泡炎为主要表现，3d时炎症表现最重，14-28d成纤维细胞增生，大量肺泡结构萎陷、破坏，胶原沉积，肺纤维化初步形成。PC组各观察点病理变化和模型组相似，但程度较轻。早期（3、7d）即肺泡炎期，肺泡渗出、细胞浸润少，中后期（14、28d）即肺纤维化进展和纤维化期，在胶原沉积，肺纤维化进展程度轻。②马松三色（Masson）染色：28d时模型组可见较多蓝色胶原沉积于支气管壁及肺泡间隔，蓝染面积百分比较对照组有显著性差异（P<0.01）。PC组蓝染胶原沉积较少，蓝染面积百分比较PQ组差异有显著性（P<0.05）。③电镜：PQ组：早期可见肺泡I型上皮细胞受损，纤毛脱失，基膜断裂，肺泡腔内有大量水肿渗出液，多见巨噬细胞，间质炎性细胞浸润；后期可见到肺泡间隔增厚，内含大量增生、肥大的肺泡n型上皮细胞，板层小体空泡化，多见异型核，肺泡隔内弹性纤维、胶原纤维和网状纤维多，胶原纤维增生明显。PC治疗后PQ中毒大鼠肺组织超微结构表现为肺泡炎及纤维增生减轻。（2）血清和肺组织均浆丙二醛（MDA）含量变化：染毒后，染毒大鼠血清和肺组织均浆MDA含量均明显升高（P<0.01），PC治疗后，各观察点PC组MDA含量升高程度明显低于PQ组（P<0.01）。（3）肺组织中羟脯氨酸（HYP）含量变化：染毒后，染毒大鼠肺组织均浆HYP含量均明显升高（P<0.01），PC治疗后，各观察点PC组HYP含量升高程度明显低于PQ组（P<0.01）。（4）血清中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活力变化：染毒后，染毒大鼠血清中GSH-Px活力均明显降低（P<0.01），PC治疗后，各观察点PC组GSH-Px活力明显高于PQ组（P<0.01）。（5）血清和肺组织均浆超氧化物歧化酶（SOD）活力变化：染毒后，染毒大鼠血清和肺组织中SOD活力均明显降低（P<0.01），PC治疗后，各观察点PC组SOD活力升高，与PQ组相比差异显著（P<0.01）。（6）肺组织均浆细胞转化生长因子-β1（TGF-β1）的蛋白水平变化：染毒后，染毒大鼠肺组织中TGF-β1的蛋白水平均明显升高（P<0.01），PC治疗后，各观察点PC组TGF-β1的蛋白水平降低，与PQ组相比差异显著（P<0.01）。（7）肺组织肿瘤坏死因子-α （TNF-α）、核因子-κB（NF-κB）的影响：染毒后，染毒大鼠肺组织中TNF-α的含量均明显升高(P<0.01)，3d时肺组织中TNF-α的含量最高，其后逐渐降低，28d时肺组织中TNF-α的含量最低。各观察时间点，PC组大鼠肺组织中TNF-α的含量均低于染毒组（P<0.01）。NF-κBp65的结果与TNF-α相似，7d时肺组织中NK-κBp65的含量最高，其后逐渐下降。各观察时间点，PC组大鼠肺组织中NK-κBp65的含量均低于染毒组（P<0.01）。结果表明：PC可以提高肺组织SOD和血浆GSH-Px、SOD活性，降低肺组织HYP、MDA和血浆MDA含量，降低肺纤维化大鼠肺组织TGF-β1的蛋白水平，抑制NF-κB亚基p65及TNF-α活性，减轻PQ中毒大鼠肺泡炎及后期纤维化程度，对PQ诱导的大鼠肺泡炎及肺纤维化具有显著的抑制作用，对PQ中毒有较好的治疗效果。该研究将为海洋药物治疗PQ中毒致肺纤维化提供新的思路。
窦清理[10]2017年在《基于氧供需平衡冠心病大鼠安全输血基础研究》文中研究指明目的:(1)在冠心病大鼠模型基础上制备输血相关急性肺损伤模型;(2)制备原核表达基因突变型(99,8位LysCys)重组血红蛋白并进一步纯化,观察突变型Hb和rHb1.1、rHb2.0对冠心病大鼠模型的氧代谢的影响,明确突变型Hb在氧代谢中的性能。(3)明确N-乙酰半胱氨酸加载的聚左旋乳酸纳米颗粒的在输血相关急性肺损伤中的治疗效果。(4)评估右美托咪定或可乐定联合罗哌卡因在蛛网膜下腔麻醉的作用。方法:(1)在冠心病大鼠模型基础上通过腹腔注射LPS建立输血相关急性肺损伤模型,模型建立后通过对大鼠心电图、心功能、肺质量、肺组织学评分、心肌组织和肺组织形态学观察评估模型;(2)制备突变型Hb后进行纯化。将冠心病大鼠随机分为五组,正常对照组和模型对照组输入人血清白蛋白,突变组输入纯化的突变型Hb,rHb1.1输入人重组血红蛋白rHb1.1,rHb2.0组输入人重组血红蛋白rHb2.0。实验中连续监测MAP、HR、Q_(SMA);测定大鼠在HAS、突变型Hb、rHb1.1和rHb2.0输入后0、30、60、90和120min时的动脉、肠系膜上静脉血气值进行氧供需及代谢分析。观察实验大鼠心肌组织的形态学改变。(3)制备输血相关急性肺损伤的动物模型,模型成功后取肺组织观察病理改变,提取肺细胞,将单喷嘴电喷雾法制备的N-乙酰半胱氨酸加载的左旋乳酸纳米颗粒进行体外干预,检测制备颗粒的生化、电化学阻抗法、毒性。(4)将出生7天(P7)和21天(P21)大鼠幼崽给予0.5%罗哌卡因的蛛网膜下腔麻醉。随机分为六组:对照组:不给予罗哌卡因;ROP组:给予罗哌卡因蛛网膜下腔麻醉;ROP+0.03mgCLO组:给予0.03mg/kg b.wt可乐定联合罗哌卡因蛛网膜下腔麻醉;ROP+0.1mgCLO组:给予0.1mg/kg b.wt可乐定联合罗哌卡因蛛网膜下腔麻醉;ROP+3μgDEX组:给(1)与正常对照组相比,TRALI模型组和阳性对照组在肺组织病理综合评分和肺组织湿予3μg/kg b.wt右美托咪定联合罗哌卡因蛛网膜下腔麻醉;ROP+10μgDEX组:给予10μg/kg b.wt右美托咪定联合罗哌卡因蛛网膜下腔麻醉。进行活化的caspase-3表达和TUNEL测定的免疫组织化学,以评估脊髓部分的神经细胞凋亡。通过检测胶质纤维酸性蛋白质和离子钙结合衔接子分子1来测量胶质反应性。结果:(1)干比明显升高(P<0.05),肺泡细胞KP-1染色可见肺泡巨噬细胞胞浆染色呈棕色,细胞核未着色。肺损伤模型组大鼠肺肺组织HE染色观察可见:内支气管壁增厚,肺泡间隔増宽,肺泡腔増大,部分肺泡断裂、融合,肺泡腔内可见炎性浸润;肺组织伴有出血、滲出;肺间质有大量炎性细胞浸润。冠心病大鼠血清中促炎细胞因子TNF-α含量显著高于对照组(P<0.05),在3h达到高峰,随后略有降低,但仍保持较高水平,至12h仍显著高于对照组(P<0.01)。TNF-α相对表达量用TNF-α和GAPDH条带灰度值的比值来衡量,P<0.05。(2)突变型Hb和rHb在输入30-60min内MAP均下降。突变型Hb组QSMA直到实验结束仍然显著高于正常组的Q_(SMA)(输液120min时,突变型Hb组vs正常组,6.9土0.7vs3.6土0.5mmHg,P<0.01),rHb1.1输入后各时间点Q_(SMA)比基础值略有降低,但无统计学差异(P>0.05),rHb2.0输入后直至实验结束,其Q_(SMA)显著低于突变型Hb组(输液120min时,4.6土0.4vs6.9土0.7ml/min,P<0.05),且显著高于处置前的水平(4.6土0.4vs2.9土0.4,P<0.05)。同时,突变型Hb和rHb的输入可以快速高效的恢复血液的pH和BE值(P<0.05),纠正缺氧状态下的血液代谢性酸中毒的症状。rHb的短期输入冠心病大鼠心肌细胞的形态学与正常对照组比较未见变化。(3)NAC-PLLA纳米颗粒的直径分布在115-650nm之间变化;50至100μg/ml不同浓度的NAC-PLLA纳米颗粒细胞毒性无明显差异(P>0.05);NAC-PLLA处理的样品的阻抗与NAC和对照样品比较的波特图提示处理组的阻抗增加;NAC-PLLA实验组的细胞因子水平低于NAC组(170±13vs240±23pg/mL,P<0.05),显著低于对照组(170±13vs560±45pg/mL,P<0.05);对照组、NAC组和NAC-PLLA试验组的亚硝酸盐/硝酸盐的浓度分别为18.3±1.05、14.7±1.23和10.4±1.34μmol/L,组间比较均有统计学差异(P<0.05);NAC-PLLA组肺组织中MDA的浓度样品低于NAC组(159±11.5vs219.8±10.6nmol/g,P<0.05)和对照组(159±11.5vs330.5±15.4nmol/g,P<0.05)。(4)麻醉后,测试大鼠幼崽的感觉和运动障碍,鞘内注射罗哌卡因与可乐定或右美托咪定联合延长了感觉障碍的持续时间。与可乐定或右美托咪定给予罗哌卡因蛛网膜下腔麻醉相比,给予罗哌卡因的大鼠幼崽的下降潜伏期较短。与单次注射罗哌卡因相比,接受可乐定或右美托咪定联合用药的大鼠幼崽的凋亡细胞计数和胶质细胞活性显著降低(P<0.05)。结论:(1)在冠心病大鼠基础上通过腹腔注射LPS建立输血相关急性肺损伤模型是可行的。(2)突变型血红蛋白与商业重组血红蛋白改善冠心病大鼠的氧供需平衡能力相似,突变型血红蛋白的生产成本更低。(3)NAC加载的PLLA纳米颗粒对急性肺损伤的具有保护作用,且具有药物释放时间长,靶向给药的优势。(4)使用可乐定或右美托咪定联合罗哌卡因麻醉可增加脊髓阻滞的强度和持续时间,从而增加麻醉效应,降低罗哌卡因引起的神经毒性。
参考文献：
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[8]. 重组胶原样凝集素的体外抗 PRRSV 活性研究及 PRRSV-GEM 纯化技术的建立[D]. 李兰. 中国农业大学. 2016
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[10]. 基于氧供需平衡冠心病大鼠安全输血基础研究[D]. 窦清理. 新疆医科大学. 2017
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