廖爱能[1]2004年在《细胞间粘附分子-1参与糖尿病肾病炎症损伤反应的临床研究》文中指出目的:探讨糖尿病肾病(DN)患者不同时期血清、尿液细胞间粘附分子-1(ICAM-1)浓度的变化及其临床意义,探讨ICAM-1在DN发病中的作用;初步观察DN肾组织ICAM-1的表达、分布,观察DN肾组织基本病理改变;探讨氯沙坦干预治疗对早期DN患者血清、尿液ICAM-1浓度的影响。方法:分组:正常对照组12人和2型糖尿病患者50人进入本研究,根据尿白蛋白排泄率(UAER)将糖尿病患者分为叁个亚组:正常白蛋白尿组(21例)、微白蛋白尿组(14例)、临床蛋白尿组(15例)。治疗干预试验,分组对照观察:微白蛋白尿组(不伴高血压)患者随机分组,其中一组予连续服用氯沙坦50mg/d,共观察4周;检测方法:酶联免疫吸附实验(ELISA)方法检测不同时期DN患者以及给予氯沙坦治疗后微白蛋白尿患者的血清、尿液ICAM-1浓度;免疫组织化学方法观察肾组织ICAM-1表达、分布;光镜、电镜观察DN肾组织基本病理改变;结果:各组糖尿病患者血清ICAM-1水平、尿液ICAM-1/尿肌酐(Cr)比值均较健康对照组显着升高(P<0.01),并随UAER的增加而增加;应用氯沙坦治疗后,微白蛋白尿患者血清ICAM-1水平、尿ICAM-1/Cr比值均显着下降(P<0.05);血清ICAM-1水平与HbA1c、CRP、UAE、FBG、LDL、Scr、SBP等指标呈正相关(P<0.05或P<0.01);尿液ICAM-1/Cr比值与血清ICAM-1、HbA1c、CRP、UAE、FBG、LDL、Scr、SBP
齐向明[2]2013年在《钙神经蛋白抑制剂对糖尿病肾脏炎症的调节作用及其机制研究》文中指出背景:糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病微血管的严重并发症之一，目前已逐渐成为导致终末期肾病(ESRD)的主要原因。在欧美等发达国家DN是ESRD的首位原因（30%~40%），在中国为第二位，且有逐渐增多趋势。DN的发病机制至今并不十分清楚，近年来炎症学说倍受关注，并认为DN是一种代谢紊乱诱导的炎症性疾病，其中巨噬细胞浸润是DN炎症的特征性表现之一，也是DN发生、发展的中心环节。而DN时蛋白尿的形成与肾组织内炎症及肾小球滤过屏障通透性改变密切相关。足细胞位于滤过屏障的外层，其损伤参与了蛋白尿形成等DN早期病理进程。DN的显着特征是基质蛋白的聚积最终导致肾小球硬化和间质纤维化，以往很多研究集中在肾小球病变上，但肾小管病变及肾小管-间质纤维化在DN中的重要作用逐渐被大家所认识。肾小管-间质病变是DN进展的主要病理基础之一，是影响DN预后的十分重要的因素。肾小管上皮细胞肌成纤维细胞转分化(tubular epithelial myofibroblast transdifferentiation, TEMT)可能是DN中肾小管间质纤维化的关键环节。但是处于静息或非活化状态的巨噬细胞并无损伤作用，只有被激活的巨噬细胞才能有效发挥其炎症效应。Toll样受体家族（TLRs）正是参与免疫炎症反应的一个关键因素，且认为是介导免疫和炎症反应的主体。他克莫司(tacromulis)即FK506是一种钙神经蛋白（Calcineurin，CaN）抑制剂，目前已被用于多种肾脏疾病（如肾移植术后、狼疮性肾炎、难治性肾病综合征）的治疗，具有肾脏保护作用。有报道指出FK506发挥抑制免疫、抗炎活性可能与抑制CaN、骨桥蛋白(Ostepontin，OPN)、NF-κB等多种炎性细胞因子的表达有关。目的：(1)本研究中，通过建立链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导的糖尿病大鼠模型，使用FK506干预，探讨其对糖尿病大鼠肾脏保护作用及可能分子机制;(2)探讨FK506是否通过足细胞的保护作用减轻DN大鼠尿白蛋白排泄，并探讨其可能机制;(3)探讨FK506对DM大鼠肾小管-间质损伤的保护作用，并探讨其机制；(4)探讨FK506对DM大鼠肾脏保护作用的机制与肾脏内巨噬细胞浸润、增殖及活化的关系，以及探讨其可能机制。方法：40只大鼠随机分为对照组（C）、模型组（DM）、DM+FK5060.5mg/kg d给药组（FK5060.5）及DM+FK5061.0mg/kg d给药组（FK5061.0），每组10只。采用STZ腹腔内注射制造糖尿病大鼠模型。FK506给药组按0.5、1.0mg/kg d灌胃，对照组和模型组每日给予等量溶媒，共4周。4周后大鼠血糖、肝功能、肾功能与血脂由全自动生化分析仪测定，24小时尿白蛋白测定采用酶联免疫方法（EnzymeImmunoassay，EIA）。观察大鼠肾重/体重、尿白蛋白排泄率(AER)与肌酐清除率(Ccr)变化，在光镜、电镜下观察肾脏病理组织学改变。应用免疫荧光检测肾组织Nephrin和Podocin表达情况。并应用免疫组化单染及双染技术检测各组大鼠肾组织骨桥蛋白(OPN)，转化生长因子β1(TGFβ1)，E-钙黏蛋白(E-cadherin)，波形蛋白(Vimentin)，巨噬细胞浸润（单核/巨噬细胞表面特异性标志抗原ED-1+细胞），增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen, PCNA巨噬细胞增殖指标)，TLR2，TLR4，核转录因子-κB（NF-κB-p-p65）,诱生性一氧化氮合酶（Inducible nitricoxide synthase, iNOS巨噬细胞活化指标）表达情况。应用Western印迹检测CaN、1α(IV)型胶原、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Nephrin、Podocin、NF-κB-p65及NF-κB-p-p65蛋白表达。结果：1.各组大鼠生化指标变化与C组相比，DM组大鼠表现为血糖升高、体重下降、相对肾重(肾重/体重)增加(P<0.01)，FK5060.5与1.0mg/kg给药4wk没有防止大鼠血糖升高、体重下降。FK5060.5mg/kg给药组相对肾重较糖尿病组有所下降，但未达统计学意义，FK5061.0mg/kg给药组相对肾重明显低于模型组(P<0.05)。DM组大鼠AER明显高于对照组(P<0.01)，FK5060.5与1.0mg/kg给药组大鼠AER水平明显低于模型组(P<0.05,0.01)。FK5060.5与1.0mg/kg给药组大鼠Ccr水平与DM组相比，差异无统计学意义。DM组大鼠血TC、TG水平明显高于对照组(P<0.05)，FK5060.5与1.0mg/kg给药组血TC、TG水平与模型组相比无明显差异。另外，与C组相比，DM组、各给药组血谷丙转氨酶、谷草转氨酶无明显变化。2.肾组织病理形态学变化：DM组4周肾小球平均容量(VG)与损伤指数(Indices for tubulointerstitial injury, TII)明显高于C组(P<0.05,0.01)，提示本模型大鼠已出现肾小球肥大与肾小管-间质损害；FK5060.5mg/kg给药组大鼠VG明显低于DM组(P<0.05), TII较模型组有所下降，但差异未达统计学意义，FK5061.0mg/kg给药组VG与TII均明显低于模型组(P<0.05,0.01)。透射电镜观察DM组肾小球基底膜增厚、结构模糊不清，系膜基质增多，足细胞损伤，而与DM组比较，FK5060.5、1.0组肾组织超微结构改变有不同程度改善。3. FK506对糖尿病大鼠肾脏足细胞损伤的保护作用Western blot法显示DM组肾组织和FK5060.5,1.0组肾组织CaN蛋白表达分别是C组的2.4倍、1.5倍和0.7倍，FK5060.5与1.0组较DM组分别下降38.0%与73.2%；DM组Nephrin和Podocin较C组表达明显下降；FK5060.5,1.0组Nephrin和Podocin量较DM组明显增加，与剂量成正相关。免疫荧光显示Nephrin和Podocin在C组大鼠肾小球呈线状均匀分布，DM组大鼠肾小球表达明显减少、且呈颗粒状不均匀分布;FK5060.5,1.0组Nephrin和Podocin表达不同程度增加，呈线状及颗粒状分布。4. FK506对糖尿病大鼠肾小管-间质损伤的保护作用C组大鼠肾小球与肾小管-间质有微弱TGFβ1蛋白表达，模型组肾小球与肾小管-间质TGFβ1蛋白表达明显高于C组(P<0.01)，K5060.5与1.0mg/kg给药组肾小球与肾小管-间质TGFβ1蛋白表达明显低于DM组(P<0.05,0.01)。免疫组化显示DM组肾小管-间质E-cadherin表达阳性面积明显低于C组(P<0.01)，FK5060.5、1.0组表达阳性面积明显高于DM组(P<0.01)，DM组肾小管α-SMA与Vimentin表达明显高于对照组(P<0.01)，FK5060.5、1.0组表达明显低于DM组(P<0.01)。Western blot法显示DM组肾组织和FK5060.5,1.0组肾组织α-SMA蛋白表达较C组分别增加3.5倍、2.1倍和1.1倍，FK5060.5,1.0组较DM组分别下降40.7%与69.1%。而DM组、FK5060.5和1.0组肾组织1α(IV)型胶原蛋白表达较C组分别增加2.4倍、1.6倍和1.2倍，FK5060.5,1.0给药组较DM组分别下降34.5%与50.0%。5. FK506对糖尿病大鼠肾脏巨噬细胞增殖激活的影响免疫组化显示DM组大鼠肾组织ED-1+、PCNA+、TLR2+、TLR4+及iNOS+巨噬细胞数明显高于C组(P<0.01)，FK5060.5,1.0给药组ED-1+的巨噬细胞数与DM组比较无明显变化，PCNA+、TLR2+、TLR4+及iNOS+的巨噬细胞数明显低于DM组(P<0.01)。免疫组化法显示DM组大鼠肾组织NF-κB p-p65蛋白表达明显高于对照组(P<0.01)，而与DM相比，FK5060.5、1.0组肾组织NF-κB p-p65表达明显减少(P<0.01)。Westernblot法显示DM组肾组织NF-κB-p65表达较对照组增加5.33倍，FK5060.5与1.0组肾组织NF-κB-p65表达较DM组分别下降26.32%与47.37%。DM组肾组织NF-κBp-p65表达较对照组增加7.57倍，FK5060.5、1.0组肾组织NF-κB p-p65表达较DM组分别下降56.67%和70.00%。结论：FK506能减少糖尿病大鼠尿蛋白排泄，减轻肾小球肥大及肾小管-间质损伤，改善肾小球基底膜、系膜及足细胞病变，其机制可能与下调肾组织中NF-κB p-p65、OPN、CaN、α-SMA、Vimentin、TGFβ1和1α(IV)型胶原的表达，上调E-cadherin、Nephrin和Podocin表达，同时通过下调肾脏巨噬细胞TLR2与TLR4表达，从而抑制TLR-NF-κB信号转导，调节巨噬细胞的增殖与激活，从而对早期糖尿病大鼠肾脏具有保护作用。
王筝[3]2014年在《肾络通对梗阻性肾病大鼠炎性介质表达的影响》文中提出由于先天性或获得性泌尿系梗阻所致的梗阻性肾病是急性或慢性肾功能衰竭的常见原因之一，也是难治性反复发作的尿路感染的常见诱发因素。造成慢性泌尿系梗阻的机制非常复杂，其中包括血液动力学改变、炎性介质、血管活性物质、氧化应激等因素的共同参与，最终导致肾脏损伤及肾功能衰竭。肾脏病的发生与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(Renin-angiotensin-aldosterone, RAAS)有密切关系，目前对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)的研究较多，其通过转化生长因子-β(Transforminggrowth factor-β, TGF-β)途径促进肾间质纤维化(Renal interstitial fibrosis,RIF)的机制已经比较明确，应用血管紧张素转化酶抑制剂(angiotensinconverting enzyme inhibitors, ACEI)及血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(angiotensin II receptor blockers, ARB)后可减轻慢性肾脏病患者肾脏结构和功能的损伤，但仍有不少患者，即便足量的ACEI及ARB治疗亦未能有效，说明有其他因素如炎性损伤、氧化应激的参与。已有的研究表明，炎性损伤在慢性疾病持续进展中发挥重要作用，故抗炎治疗对于慢性疾病的预后有重要意义。这种炎性损伤并非单纯由外界感染所致，而是以内源性炎性损伤为主，且与RIF的持续进展密切相关，炎性介质在其中的作用也得以重视。有研究指出炎性介质例如单核细胞趋化蛋白-1(monocytechemotactic protein1, MCP-1)、白介素-1β(Interleukin1β, IL-1β)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα, TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶(inducednitric oxide synthase，iNOS)是各种慢性肾脏疾病中引起肾脏炎症和纤维化的重要因素。随着对RAAS的深入研究，发现除了AngⅡ外，醛固酮也可通过激活其下游效应介质血清糖皮质激素诱导蛋白激酶1(Serum andglucocorticoid-induced protein kinase1, SGK-1)及核转录因子κB (NuclearfactorκB, NF-κB)、氧化应激等多种途径导致肾脏炎性细胞浸润和细胞外基质(extracellular matrix, ECM)积聚，最终导致RIF的进展，故阻断醛固酮活化造成的炎性损伤对于减缓肾脏病的进展有重要意义。本次实验通过单侧输尿管结扎(unilateral ureteral obstruction, UUO)建立梗阻性肾病间质纤维化实验动物模型，观察盐皮质激素受体阻断剂依普利酮和化瘀涤痰通络方肾络通煎剂对单侧输尿管梗阻大鼠炎性介质表达的影响，利用实时定量荧光聚合酶链式反应(Real-time polymerase Chain Reaction, Real-timePCR)、免疫组化、蛋白质印迹法(Western blot)、酶联免疫吸附法(enzymelinked immunosorbent assay, ELISA)、放射免疫分析法等技术检测血清醛固酮、血清和糖皮质激素诱导蛋白激酶1(Serum and glucocorticoid-inducedprotein kinase1, SGK-1)及MCP-1、TNF-α、iNOS、IL-1β、核转录因子κB (Nuclear factorκB, NF-κB)和α平滑肌激动蛋白(α-smooth muscleprotein, α-SMA)等指标的变化，从组织、分子、基因水平研究肾络通煎剂的作用机制，为中药治疗梗阻性肾病提供理论和实验依据。第一部分“毒”、“瘀”伤肾机制及关联简述了“毒”和“瘀”的概念、分类、形成机制、两者在肾病中的发病机制，以及毒邪和瘀血的相互影响、毒瘀互结在肾病中的作用、毒瘀相关的分子生物学基础及临床意义等内容。大量实验研究表明，肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病的病理表现和共同通路，而炎性损伤在肾间质纤维化的进程中是一种启动和诱发因素。现代医学研究表明，炎性细胞的浸润、炎性介质的释放、促纤维化细胞因子的表达等均可归属于中医“内毒致病”范畴，而细胞外基质在肾脏的积聚是“瘀”的表现，由此可见，以炎性损伤为特征的“毒”为起因，纤维化为表现的“瘀”为结果，二者交互错杂，导致和加重肾间质纤维化，且贯穿于肾脏病的整个病理过程。同时，也总结出“毒”和“瘀”可作为慢性肾脏病的基本病机。在临床上，肾脏病的进展与感染有密切关系，或因感染而诱发，或因感染而加重，且肾病患者易于感染，这种感染所致的炎性损伤在肾间质纤维化的进展中发挥着重要的作用，抗炎治疗可能是治疗靶点。“毒”、“瘀”病机学说的提出为临床治疗慢性肾脏疾病提供了理论依据，对于慢性肾病的进展可能有重要意义。第二部分肾络通对梗阻性肾病大鼠肾脏组织病理形态学的影响方法：48只Wistar大鼠随机分为假手术组(Sham group)、UUO组(UUOgroup)、依普利酮组(EPL group)、肾络通组(SLT group)，每组12只。实验动物自由进食和饮水，温度条件控制在(22±2)℃。适应性饲养1WK后，除假手术组(Sham group)，其余大鼠按照Iwai T的方法制备单侧输尿管梗阻模型。大鼠给以10%水合氯醛注射后，于左侧中腹部切开皮肤，游离左侧输尿管，分别在输尿管上1/3处和中1/3处用丝线结扎，切断输尿管，逐层缝合皮肤。假手术组仅将输尿管游离但不结扎离断。术后第3天肾脏组织病理显示炎性细胞浸润，第5日后肾间质胶原纤维沉积，术后第10天梗阻侧肾脏明显大于对侧，肾间质大量炎性细胞浸润以及胶原纤维沉积，肾小管上皮细胞变性、浊肿、脱落甚至坏死，肾小管部分萎缩，管腔闭塞或扩张，与文献报道相似，符合肾间质纤维化病理改变，模型复制成功。本次实验成功率为92％，UUO术后大鼠死亡5只，用备用大鼠补足。术后开始给药，依普利酮组给以依普利酮100mg/(kg.d)从饲料中加入，肾络通组给以肾络通煎剂26g/(kg.d)入水瓶饮用，假手术组及UUO组给予等容量生理盐水饮用。均每天1次。连续干预10天。观察一般情况。于实验结束时，称重，断头取血，分离血清，用于指标检测；取左侧(梗阻侧)肾脏称重，计算各组肾重/体重比值，进行肾脏组织HE、MASSON染色，观察组织病理学改变。数据资料结果使用SPSS13.0for windows统计软件分析处理。各组数据比较前先进行正态性及方差齐性检验，满足正态性及方差齐性者，采用方差分析，多组比较采用单因素方差分析(One-wayANOVA)，组间比较采用LSD检验。数值变量以均数加减标准差(x±s)表示。显着性差异水平以0.05和0.01为标准。结果：1各组大鼠一般情况比较实验中大鼠死亡5只，用备用大鼠补足。整个实验过程中假手术组大鼠一般情况良好：每日饮食、饮水量稳定，体重逐步增长，毛发有光泽，活动敏捷，对外界刺激反应灵敏。UUO术后1天，造模动物的进食量、饮水量、体重均有所下降。术后6天，UUO组大鼠整体状态欠佳：活动较前明显减少，毛发松散无光泽。与假手数组相比，造模动物体重不增反而下降。UUO手术10天后，造模大鼠体重增长缓慢，且与假手术组有显着性差异(P<0.01, P<0.05)；与UUO组相比，依普利酮组及肾络通组大鼠梗阻侧肾重，肾重/体重指数明显下降(P<0.01, P<0.05)。UUO手术后，造模大鼠进食量、饮水量、24h尿量均有所下降，但各组之间无明显差异(P>0.05)。2各组大鼠肾组织病理形态学改变HE染色显示，假手术组肾脏结构基本正常，肾小管上皮细胞排列整齐，无浊肿，间质无水肿，偶见炎性细胞浸润；UUO组肾间质大量炎性细胞浸润，肾小管明显扩张，上皮细胞变性、浊肿、脱落甚至坏死；依普利酮组及肾络通组小管扩张及上皮细胞水肿坏死与UUO组基本相同，但炎性细胞浸润明显减轻。Masson染色显示，假手术组有少量胶原纤维表达，可见于肾小球/肾小管基底膜及肾间质；UUO组结构紊乱，胶原成分显着增多，以肾间质为主；依普利酮组及肾络通组胶原纤维表达较假手术组增多，但与UUO组相比明显减少。3各组大鼠肾间质炎性细胞计数比较与假手术组比较，UUO组大鼠炎性细胞浸润明显增多(P<0.01)。与UUO组相比，依普利酮组、肾络通组大鼠炎性细胞浸润减少有显着性差异(P<0.01, P<0.05)。与髓质区相比，皮质区炎性细胞浸润明显增多有显着性差异(P<0.01, P<0.05)；与皮质区比较，皮髓交界区质区炎性细胞浸润减少，有显着性差异(P<0.01, P<0.05)。第叁部分肾络通对梗阻性肾病大鼠MCP-1、TNF-α、IL-1β、iNOS等炎性介质表达的影响方法：动物分组、模型复制、给药方法同第二部分，共10天。实验结束时留取血清和肾脏标本，采用ELISA测定血清MCP-1含量，放射免疫法测定血清TNF-α、iNOS、IL-1β含量，Real time-PCR、免疫组化、Western blot检测MCP-1、TNF-αmRNA及蛋白的表达。统计学方法同第二部分。结果：1各组大鼠血清MCP-1、TNF-α、iNOS、IL-1β表达比较与假手术组比较，UUO组中血清MCP-1、TNF-α、iNOS、IL-1β含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01, P<0.05)。与UUO组比较，依普利酮组及肾络通组血清MCP-1、TNF-α、iNOS、IL-1β含量均减少，其中以依普利酮组更为明显，差异有统计学意义(P<0.01, P<0.05)。2Real-time PCR检测MCP-1mRNA、TNF-αmRNA的表达与假手术组比较，UUO组中MCP-1mRNA及TNF-αmRNA表达明显增强(P<0.01)。与UUO组比较，依普利酮组及肾络通组MCP-1mRNA及TNF-α mRNA表达均显着下调，其中以依普利酮组更为明显，差异有统计学意义(P<0.01)。3免疫组化检测MCP-1、TNF-α表达假手术组MCP-1、TNF-α呈弱表达， UUO组中MCP、TNF-α表达明显增强，主要表达于肾小管上皮细胞胞浆。与UUO组比较，依普利酮及肾络通组其表达范围及强度均显着减弱。4Western Blot检测MCP-1及TNF-α蛋白表达与假手术组比较，UUO组MCP-1、TNF-α蛋白表达明显上调。与UUO组比较，依普利酮组及肾络通组其表达均被下调，其中以依普利酮组下调更为明显，差异有统计学意义(P<0.01)。第四部分肾络通对梗阻性肾病大鼠血清醛固酮及SGK-1表达的影响方法：动物分组、模型复制、给药方法同第二部分，共10天。实验结束时留取血清和肾脏标本，采用放射免疫分析法检测血清醛固酮含量，Real-time PCR、Western blot测定肾组织SGK-1mRNA及蛋白表达。统计学方法同第二部分。结果：1放射免疫法检测各组大鼠血清醛固酮含量与假手术组比较，UUO组中血清醛固酮含量明显升高，差异有统计学意义(P<0.01)；与UUO组比较，依普利酮组血清醛固酮含量有下降趋势，但无统计学意义(P>0.05)，肾络通组血清醛固酮含量明显降低，有统计学差异(P<0.01)。2Real-time PCR检测SGK-1mRNA的表达与假手术组比较，UUO组中SGK-1mRNA表达明显增强。与UUO组比较，依普利酮及肾络通组SGK-1mRNA表达均显着下调。3Western Blot检测SGK-1蛋白表达与假手术组比较，UUO组SGK-1蛋白表达明显上调。与UUO组比较，依普利酮组及肾络通组其表达均被下调，其中以依普利酮组下降更为显着。第五部分肾络通对梗阻性肾病大鼠及α-SMA及NF-κB表达的影响方法：动物分组、模型复制、给药方法同第二部分，共10天。实验结束时留取肾脏标本，采用免疫组化、Western Blot检测α-SMA及NF-кB蛋白表达。统计学方法同第二部分。结果：1免疫组化检测各组大鼠NF-κB、α-SMA表达假手术组NF-κB呈弱表达，主要表达于肾小管上皮细胞；UUO组NF-κB表达明显增强，近曲小管尤为明显；依普利酮组及肾络通组NF-κB表达范围及强度较UUO组均明显减弱。假手术组α-SMA仅表达于血管，肾间质及上皮细胞未见表达；UUO组α-SMA表达明显增强，以扩张的肾小管表达为甚，间质亦可见到阳性表达；依普利酮组及肾络通组α-SMA局部呈中度表达，间质可见少量表达。2Western Blot检测各组大鼠α-SMA、NF-кB表达与假手术组比较，UUO组α-SMA、NF-кB蛋白表达明显上调，差异有统计学意义(P<0.01)。与UUO组比较，依普利酮组及肾络通组其表达均被下调，其中以依普利酮组下调更为明显，差异有统计学意义(P<0.01)。结论：1“毒”和“瘀”是慢性肾病的基本病机，以炎性损伤为特征的“毒”为起因，以纤维化为表现的“瘀”为结果，二者相互关联、相互促进，导致和加重肾间质纤维化，且贯穿于肾脏病的整个病理过程。2结扎单侧输尿管复制肾间质纤维化实验动物模型，肾间质炎性细胞浸润及胶原成分显着增多。肾络通及依普利酮能显着减轻UUO诱导的肾实质损伤，减少炎性细胞浸润，延缓间质纤维化进展。3炎性损伤是梗阻性肾病的重要起始因素，炎性介质在其中发挥重要作用。其中，MCP-1、TNF-α、IL-1β及iNOS等炎性介质是慢性肾脏疾病中介导的肾脏炎症和间质纤维化的重要因子。肾络通和依普利酮能下调其表达，从而抑制梗阻性肾病中炎性损伤和炎性细胞浸润，进而延缓间质纤维化的进展。4醛固酮可通过激活其下游效应介质SGK-1引起肾脏炎性损伤。肾络通和依普利酮能降低血清醛固酮含量，下调SGK-1mRNA和蛋白表达，从而进一步抑制梗阻性肾病炎性损伤和间质纤维化进展。5肾络通和依普利酮可以通过NF-κB通路，下调炎性介质表达，抑制信号传导，从而抑制细胞的表型转化，减轻肾脏炎性损伤，减缓肾间质纤维化的进展。
王红盼[4]2012年在《柴黄益肾颗粒对糖尿病肾病大鼠肝损伤L-FABP及相关炎症因子的影响》文中进行了进一步梳理目的：糖尿病肾病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病的微血管并发症之一,在我国终末期肾病的患者中有20%-40%的原发病为DN,给国民经济造成严重负担,是全社会亟需解决的重大公共卫生问题。DN发病机制复杂,目前尚未完全阐明,中医药在治疗DN方面具有明显的特色与优势。近年研究表明炎症因子与炎症反应在DN的发生发展中起着极为重要的作用,认为其与DN病变时全身微炎症状态有关,但是关于炎症在DN并发的肝脏损伤中发挥的作用却有待深入研究。本研究通过观察柴黄益肾颗粒对DN大鼠肝损伤肝组织中肝型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)及相关炎症因子表达的影响,在验证柴黄益肾颗粒药物作用基础上,以DN诊断标记物L-FABP以及相关炎症因子为切入点,探讨柴黄益肾颗粒对DN大鼠肝组织炎症损伤的保护作用机制,并在此基础上借助重组质粒细胞转染实验验证这一机制。方法：1.中药柴黄益肾颗粒对DN大鼠肝损伤肝组织L-FABP及相关炎症因子表达的影响：采用单侧肾切除加链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立1型糖尿病肾病大鼠模型,随机分为模型组、柴黄益肾颗粒组和蒙诺组,另将假手术组设为对照组。分别于第0、4、8、12、16、20周动态观察大鼠一般状态、体重、血糖,第20周时动物取材,测定血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆固醇(CH0)、甘油叁酯(TG),HE染色观察肝组织病理变化；RT-PCR检测各组大鼠肝脏L-FABP、PPAR-α、 PPAR-γ和MCP-1mRNA的表达,Western Blot检测大鼠肝脏L-FABP表达变化。2.大鼠L-FABP/pcDNA3.1/V5-His重组质粒的构建及对相关炎症因子的影响：RT-PCR方法从大鼠肝脏组织总RNA中扩增出编码L-FABP的cDNA,克隆至pUM-T载体、测序,然后亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1/V5-His,双酶切鉴定及测序正确,采用磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞,转染72h后,提取细胞总RNA和蛋白,RT-PCR检测空载体组和重组质粒转染组的L-FABP、PPAR-α、PPAR-γ、MCP-1、TGF-β1等mRNA水平的表达变化。Western Blot检测L-FABP和TGF-β1表达变化。3.相关实验数据统计学处理采用SPSS13.0软件。结果：1.中药柴黄益肾颗粒对DN大鼠肝损伤肝组织L-FABP及相关炎症因子表达的影响：模型组从实验第0周起,状态与体重即明显差于对照组,且随实验的进行差异持续增加,到第20周差异达峰值,与模型组相比,各给药组大鼠状态均有明显改善,柴黄益肾颗粒组体重从第4周起显着升高并持续至实验结束；20周末,模型组大鼠CHO、TG均高于对照组(P<0.05),而模型组肝组织中L-FABP. PPAR-α、PPAR-γ mRNA表达水平较对照组明显降低(P<0.05),MCP-1mRNA表达水平明显高于对照组(P<0.05)；柴黄益肾治疗组CHO.TG均低于模型组(P<0.05),柴黄益肾治疗组肝组织中L-FABP. PPAR-α、PPAR-γmRNA表达水平均较模型组明显升高(P<0.05),而柴黄益肾治疗组中MCP-1表达受到抑制；两治疗组之间比较差异无统计学意义。2.大鼠L-FABP/pcDNA3.1/V5-His重组质粒的构建及对相关炎症因子的影响：1)测序结果证实PCR扩增得到编码L-FABP的cDNA序列正确；2)磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后,在基因和蛋白表达水平结果达到预期；3)RT-PCR结果显示重组质粒转染组的PPAR-α、PPAR-γmRNA表达增加,MCP-1、p65及TGF-β1的mRNA表达降低(P<0.05),4) Fugene HD法转染HepG2细胞后,PCR结果显示下游基因变化不明显,可能与细胞自身L-FABP的表达有关。结论：1.柴黄益肾颗粒能够改善1型糖尿病肾病肝组织炎症病理损伤,其作用机制可能与L-FABP、PPAR-α、PPAR-γ表达的增加,进而降低下游炎症因子MCP-1等的表达有关,L-FABP可能在DN的肝损伤中起到重要的修复作用。2.成功构建了大鼠L-FABP的重组质粒,使该重组质粒在293T细胞中过表达,初步研究了其可能影响的下游因子,为探讨大鼠L-FABP重组质粒的功能提供有力证据。而在HepG2细胞中过表达该重组质粒,下游基因变化不显着,可能与该细胞中自身表达L-FABP有关。
袁园[5]2013年在《PGE_1改善高糖联合TNF-α损伤大鼠肾小球系膜细胞及机制研究》文中研究说明[背景]随着全球经济的发展,人民生活水平不断提高,大家在享受丰富物质生活带来的便利时,面临的健康威胁也日益严重。糖尿病(diabetes mellitus, DM)正是在这样一个生活方式现代化而人口老龄化的时代以惊人的速度攀升,成为患病率、致残率及死亡率仅次于肿瘤和心血管疾病成为第叁大慢性非传染病,给社会公共健康带来严峻的考验。如若不控制糖尿病发病率逐年增长的势头,预计到2050年,全球糖尿病患者数量将有一到两倍的增加,同时由DM病程进展所致的各种慢性并发症包括糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy, DR)、糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)、糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)、糖尿病心脑血管并发症等也将大幅度增长,从而带来难以预计的社会及经济负担。糖尿病肾病作为糖尿病特有的慢性微血管并发症,现今己成为糖尿病最常见的慢性并发症之一,也是目前欧美终末期肾病(end-stage renal disease,ESRD)最常见的病因,严重威胁着人类的健康。据统计,目前约30%的1型糖尿病及20%～50%的2型糖尿病患者发生肾脏损害,而进展至ESRD的患者5年生存率将小于20%。DN早期的病理改变包括细胞外基质合成增多和排除减少导致的肾小球基底膜增厚、细胞外基质沉积和系膜细胞增生所致的系膜区扩张以及足细胞损害和数量的减少,加上肾小管间质扩张和小管间质细胞外基质积聚,随即会出现蛋白尿及肾小球滤过率的降低,从而共同加剧肾小球硬化及肾小管间质纤维化,最终进展为ESRD.肾小球的病理变化主要有叁种类型,包括结节性肾小球硬化、弥漫性肾小球硬化和渗出性病变,其中以结节性肾小球硬化最具特征性,又将其称为毛细血管间肾小球硬化或Kimnel-Steil-Wilson结节(K-W结节)。由此可见,系膜细胞在糖尿病肾病发病初期就出现改变,并进一步引发疾病进展过程中的组织病理异常和功能障碍甚至衰竭,在DN的发生发展中充当着极为重要的角色。DN是由环境和遗传因素相互作用所致的多因素紊乱,确切的发病机制尚未完全阐明,目前研究发现较经典的机制概括来说主要包括两大方面,即代谢损伤和血流动力学损伤,具体来说有以下致病因素：1、高血糖引起的多种生化代谢异常,包括非酶糖基化作用的加强、多元醇通路和己糖胺生物合成通路的激活,以及葡萄糖直接改变细胞内信号通路而发挥的毒性作用等；2、高血压引起的肾小球损伤；3、蛋白尿影响,蛋白质的超负荷诱导小管间质损害,诱发促进硬化的细胞因子释放,从而促进疾病的进展；4、分子介质包括转化生长因子β1(TGF-β1)、结缔组织生长因子(CTGF)、血管内皮生长因子(VEGF)等的影响,以及转录因子和细胞内信号通路的参与；5、此外,DN被证实具有遗传易感性。近年来,学者们在上述经典的发病机制外,越来越关注“代谢性炎症”在DM及其慢性并发症中的参与程度,并致力于探索与DN相关的炎症因子和信号通路。关于炎症与代谢疾病相关研究最早始于二十世纪90年代,但直到2006年Hotamisiligil在《Nature》上才首次定义这一概念,并阐述了参与糖尿病及其慢性并发症的发生与发展,他指出代谢性炎症是指一种代谢诱发的长期而持续的低强度炎症反应,主要由长期的慢性营养过剩状态以及TNF-α过表达而使正常胰岛素信号通路受抑制所触发,虽然其临床症状有别于传统的急性炎症的表现包括红、肿、热、痛等,但其分子机制和信号通路与传统的炎症反应相类似。在这之后,越来越多的研究开始致力于炎症在糖尿病及其慢性并发症中参与程度和具体机制。有研究证实免疫介导的炎症反应是糖尿病肾病发生发展过程不可缺少的致病因素,参与其中的炎症细胞众多,包括白细胞、单核细胞、巨噬细胞等,而细胞因子更甚,包括单核细胞趋化因子(MCP-1)、细胞间粘附因子(ICAM-1)、转化生长因子β (TGF-β)、肿瘤坏死因子(TNF-α)、白介素(IL)以及核因子-κB (NF-κB)等,这些细胞及细胞因子参与并贯穿疾病始末。再众多的细胞因子当中,MCP-1、TGF-β1及IL-6是与DN发生发展最为密切的炎症因子,在疾病过程中它们即有各自独立的作用也相互交联共同加速了DN进程。MCP-1在绝大多数细胞包括系膜细胞和单核细胞中表达,对单核及巨噬细胞具有很强的趋化活性。既往研究证明,无论在糖尿病肾病动物模型,亦或糖尿病肾病患者的尿液及血液中,MCP-1的表达水平均是明显增高的,高水平的MCP-1能够诱导炎症细胞在肾脏组织的浸润来引起肾功能的损害。TGF-β1是DN中另一个重要的细胞因子,既往认为对糖尿病肾小球硬化的过程有极为关键的作用,TGF-β1具有促进硬化的重要特征,诱导细胞肥大和凋亡。体外研究也证实,TGF-β1能够增加肾小球系膜细胞和小管上皮细胞胶原、纤维连接蛋白和层粘连蛋白的合成,同时还可抑制胶原酶的合成,刺激金属蛋白抑制剂产生,使细胞外基质降解减少,加剧基质积聚；然而除了致纤维化以外,同时也具有调节免疫和炎症反应的功能,在肾脏,TGF-β1能够上调MCP-1和IL-8等炎症因子的表达,促进肾脏炎症反应的发生。研究表明,糖尿病患者肾小球损害的严重程度与肾小球系膜细胞和足细胞中IL-6mRNA的表达程度相关,提示IL-6可能对这些细胞外基质分泌有促进作用。此外,近期许多研究发现2型糖尿病患者肾小球基底膜增厚程度与IL-6的水平有着密切的关系,而肾小球基底膜增厚被认为是评判糖尿病肾病发生发展过程中强有力的指标。因此可以认为IL-6对DN的发展也有预测作用。核因子-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)蛋白家族是一种多效性的转录因子,是系膜细胞表达多种免疫炎症相关基因的调控枢纽,与系膜细胞增殖和分泌炎症因子密切相关。NF-κB一般以同源或异源二聚体形式存在,在静息状态下以非共价键的形式与IκB形成复合体散在于胞浆中,受到多种因素刺激后,通过IκBs降解从而活化NF-κB,复合体解聚而转移至细胞核内,继而介导下游一系列反应。NF-κB能够促进多种细胞粘附分子和细胞因子mRNA合成,在基因早期应答中发挥着关键性作用。研究显示,NF-κB介导了牵张刺激及高糖诱导的系膜细胞MCP-1产生,同时还参与调节细胞内TGF-β1信号通路。这些初步证据显示,NF-κB极有可能通过调控炎症反应来参与糖尿病肾小球损伤的发病,同时,能够抑制NF-κB通路激活以达到抗炎作用的药物将得到广泛的开发。目前,干预糖尿病肾病进展的方法除了严格的血糖控制、低蛋白饮食、血压控制(特别是ACEI和/或ARB药物物的使用)外,改善细胞内高凝状态也是重要的治疗方案。基于此目的,前列腺素E1(PGE1)等抗血小板药物或抗凝药得到了广泛的应用。李鹏飞等应用PGE1治疗不同分期的DN患者并随访1年发现,短期应用PGE1能够迅速降低各期患者的尿白蛋白水平,甚至是Ⅳ期和Ⅴ期的DN患者尿白蛋白也出现了不同程度的降低。在此之外,还有研究发现PGE1在降低DN患者尿蛋白排泄率的同时,血循环中炎症因子CRP、ICAM-1等均有所降低,提示PGE1在改善血流动力学及改善微循环之外,可能有一定改善炎症反应的作用,但是这一作用是否与改善微循环引起全身炎症状态的改变有关,或是PGE1对肾脏局部也有作用,在这些研究中并未探讨。于是随后大量的体外实验开始研究PGE1在肾脏局部的作用。Dell等运用PGE1处理大鼠系膜细胞后发现,低剂量的PGE1能够抑制环孢素A诱导的大鼠系膜细胞PAI-1的表达。随后他在体外实验中又发现PGE1能降低环孢素A诱导的大鼠系膜细胞TGF-β1mRNA的表达,而M.Kishida等观察到PGE1能抑制TNF-α诱导的人系膜细胞表达PAI-1,提示PGE1在糖尿病肾病引起的肾小球硬化症中有治疗意义。至此,PGE1能够改善肾脏纤维化越来越明确,但是否对肾脏局部炎症因子表达有作用有待进一步研究。因此,本研究旨在探讨PGE1对高糖联合TNF-α诱导的大鼠肾小球系膜细胞株(HBZY-1)损伤的保护作用,并探讨其可能的机制。选取HBZY-1细胞株作为研究对象,观察高糖联合TNF-α对细胞增殖的影响,并同时从蛋白和基因水平上观察炎症因子包括MCP-1、TGF-β1和IL-6表达水平；而加用不同浓度的PGE1处理后,是否能够抑制细胞增殖和上述炎症因子的表达；同时将进一步探讨以上抑制作用产生的可能机制,以期为临床上PGE1治疗糖尿病肾病提供依据。具体研究内容分为以下两个部分：第一章PGE1改善高糖联合TNF-α损伤大鼠肾小球系膜细胞[目的]观察PGE1对高糖联合TNF-α诱导的大鼠肾小球系膜细胞损伤的保护作用。[方法]1、实验对象：选取大鼠肾小球系膜细胞株(HBZY-1)作为研究对象,用含10%胎牛血清的DMEM(正糖)完全培养基进行培养,置于37℃、5%CO2的培养箱内体外培养,每3天传代一次。2、实验分组：根据实验设计分为以下处理组：NG组：正糖(5.6mmol/L)对照组；HT组：高糖(30mmol/L)+TNF-α (10ng/mL)处理组;HTP1组：高糖(30mmol/L)+TNF-α (10ng/mL)+PGE1(0.01ng/mL)处理组；HTP2组：高糖(30mmol/L)+TNF-α (10ng/mL)+PGE1(0.05ng/mL)处理组;HTP3组：高糖(30mmol/L)+TNF-α(10ng/mL)+PGE1(O.lng/mL)处理组；HTP4组：高糖(30mmol/L)+TNF-α (10ng/mL)+PGE1(0.5ng/mL)处理组;HTP5组：高糖(30mmol/L)+TNF-α (10ng/mL)+PGE1(1ng/mL)处理组。各组在正式干预HBZY-1细胞前均先用含0.5%胎牛血清的DMEM(正糖)完全培养基饥饿24h,使细胞同步化于静止期。3、实验方法：四甲基偶氮盐渗入法(MTT法)：测定各组]HBZY-1细胞光密度值(optical density, OD),评价细胞增殖水平。酶联免疫吸附法(ELISA法)：测定HBZY-1细胞培养上清液中MCP-1、TGF-β1及IL-6蛋白浓度；实时荧光定量PCR法(qRT-PCR法)：测定HBZY-1细胞MCP-1、TGF-β1及IL-6mRNA表达情况；4、统计方法：采用SPSS13.0统计软件进行处理,数据采用均数±标准差(x±s)表示,各组均数比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA),任意两组间比较当满足方差齐性时采用LSD法(Least-significant difference test),方差不齐时采用Dunnett's T3法。P<0.05被认为差异具有统计学意义。[结果]1、PGE1对高糖联合TNF-α诱导HBZY-1细胞增殖的影响：与正糖组相比,在培养至48h以内高糖联合TNF-α均能明显促进HBZY-1细胞的增殖(0.704±0.096vs.0.840±0.040;0.789±0.104vs.1.122±0.136),差异具有统计学意义(P=0.004：P=0.001)。与高糖组相比,在作用24h时,低浓度的PGE1(0.01、0.05及0.1ng/mL)对细胞增殖抑制作用不明显,差异不具统计学意义(P>0.05);而较高浓度的PGE1(0.5及1ng/mL)能够显着降低细胞OD值(0.708±0.095vs.0.840±0.040;0.687±0.082vs.0.840±0.040),差异具有统计学意义(P=0.005；P=0.002)；随着培养时间延长至48h,除HTPl组外,其余药物浓度组较高糖组细胞OD值均明显下降(0.862±0.239vs.1.122±0.136;0.800±0.211vs.1.122±0.136;0.720±0.146vs.1.122±0.136;0.678±0.137vs.1.122±0.136),差异具有统计学意义(P=0.10; P=0.002; P=0.000; P=0.000)。2、PGE1对高糖联合TNF-a诱导的HBZY-1细胞培养上清液中MCP-1、TGF-β1、 IL-6蛋白含量的影响：2.1、各组MCP-1蛋白浓度的比较：与NG组相比,处理的48h以内HT组HBZY-1培养上清液中的MCP-1蛋白浓度均显着增加(51.639±6.699vs.79.932±17.543,82.159±5.389vs.151.353±12.229),差异具有统计学意义(P=0.030；P=0.000)。与HT组相比,24h时药物处理组与HT组相比未出现显着性差异(P>0.05);培养时间延长至48h时,较高浓度的PGE1(0.5、1ng/mL)可明显降低MCP-1蛋白浓度(117.171±25.589vs.151.353±12.229;114.302±14.611vs.151.353±12.229),差异具有统计学意义(P=0.014；P=0.009)；而较低浓度的PGE1(0.05、0.lng/mL)作用不明显,差异没有统计学意义(P>0.05)。2.2、各组TGF-β1蛋白浓度的比较：与NG组相比,24h时HT组细胞上清液中TGF-β1蛋白浓度变化不明显,统计学未见明显差异(P>0.05),48h时,HT组细胞上清液中的TGF-β1蛋白浓度显着增加(644.939±97.461vs.947.349±144.847),差异具有统计学意义(P=0.004)；与HT组相比,24h时各PGE1处理组细胞上清液中的TGF-β1蛋白浓度无明显下降,差异不具有统计学意义(P>0.05)；48h时,较高浓度的PGE1(0.5、 lng/mL)可明显降低TGF-β1蛋白浓度(709.691±130.684vs.947.349±144.847;615.691±75.904vs.947.349±144.847),差异具有统计学意义(P=0.017;P=0.002),而较低浓度的PGE1(0.05、0.1ng/mL)组的抑制作用不明显,差异不具有统计学意义(P>0.05)。2.3、各组IL-6蛋白浓度的比较：试剂盒检测结果显示,各组OD值均低于最低浓度标准品(0.312pg/ml)的OD值,认为在培养48h内上清液中未检测到IL-6。3、PGE1对高糖联合TNF-α诱导HBZY-1细胞MCP-1、TGF-β1、IL-6mRNA表达的影响：3.1各组MCP-1mRNA表达水平的比较：与NG组相比,HT组MCP-1mRNA的表达显着增加(0.240±0.056vs.1.000±0.207),差异具有统计学意义(P=0.000)；与HT组相比,较低浓度的PGE1(0.05,0.1ng/mL)的抑制作用不明显,差异不具有统计学意义(P>0.05),较高浓度的PGE1(0.5、1ng/mL)可明显抑制MCP-1mRNA的表达(0.736±0.073vs.1.000±0.207,0.656±0.107vs.1.000±0.207),差异具有统计学意义(P=0.049;P=0.015)。3.2、各组TGF-β1mRNA表达水平的比较：与NG组相比,HT组TGF-β1mRNA的表达明显增加(0.429±0.150vs.1.000±0.202),差异具有统计学意义(P=0.002)；与HT组相比,较低浓度的PGE1(0.05,0.1ng/mL)的抑制作用不明显,差异不具有统计学意义(P>0.05),较高浓度的PGE1(0.5及lng/mL)可明显抑制TGF-β1mRNA的表达(0.702±0.095vs.1.000±0.202;0.671±0.113vs.1.000±0.202),差异具有统计学意义(P=0.039；P=0.025)。3.3、各组IL-6mRNA表达水平的比较：与NG组相比,HT组IL-6mRNA的表达明显增加(0.436±0.044vs.1.000±0.221),差异具有统计学意义(P=0.001)；与HT组相比,低浓度的PGE1(0.05,0.1,0.5ng/mL)的抑制作用不明显,差异不具有统计学意义(P>0.05),高浓度的PGE1(lng/mL)可明显抑制IL-6mRNA的表达(0.701±0.027vs.1.000±0.221),差异具有统计学意义(P=0.023)。[结论]1、体外模拟高糖联合TNF-α环境下,48h内大鼠系膜细胞均出现明显的增殖,且随着时间延长增殖越来越明显：而一定浓度的PGE1能抑制其增殖。2、高糖联合TNF-α环境能诱导大鼠系膜细胞细胞分泌MCP-1以及TGF-β1蛋白,较高浓度的PGE1能抑制大鼠系膜细胞MCP-1以及TGF-β1蛋白的分泌。3、高糖联合TNF-α环境能诱导大鼠系膜细胞细胞MCP-1、 TGF-β1以及IL-6mRNA分泌,较高浓度的PGE1能抑制大鼠系膜细胞MCP-1、TGF-β1以及IL-6mRNA的表达。第二章PGE1改善高糖联合TNF-a损伤大鼠肾小球系膜细胞的机制[目的]探讨PGE1改善高糖联合TNF-α诱导大鼠肾小球系膜细胞损伤的潜在机制。[方法]1、实验对象：选取大鼠肾小球系膜细胞细胞株(HBZY-1)作为研究对象,采用含10%胎牛血清的DMEM(正糖)完全培养基进行培养,置于37℃、5%CO2的培养箱内体外培养,每3天传代一次。2、实验分组：根据实验设计分为以下处理组：NG组：正糖(5.6mmol/L)对照组；HT组：高糖(30mmol/L)+TNF-α (10ng/mL)处理组;HTP5组：高糖(30mmol/L)+TNF-α (10ng/mL)+PGE1(1ng/mL)处理组。各组在正式干预细胞前均采用含0.5%胎牛血清的DMEM(正糖)完全培养基饥饿24h,使细胞同步于静止期。4、实验方法：细胞免疫荧光法：检测细胞内NF-κB p65核转位情况。[结果]与NG对照组相比,高糖联合TNF-α诱导的细胞核NF-κB p65荧光强度明显增强；与HT组相比,HTP5组的细胞核内NF-κB p65荧光强度明显减弱。[结论]高糖联合TNF-α可诱导HBZY-1细胞内NF-κB p65核转位；PGE1能够抑制高糖联合TNF-α诱导的HBZY-1细胞的NF-κB p65核转位,提示NF-κB通路可能是PGE1改善高糖联合TNF-α诱导的HBZY-1细胞损伤的机制。
李淼[6]2009年在《ICAM-1在原发性慢性肾脏疾病肾组织的表达及意义》文中认为目的:研究细胞间粘附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)在原发性慢性肾脏疾病患者肾组织的表达及分布情况。探讨其表达水平与各病理类型及临床资料之间的关系。方法:采用免疫组织化学方法对7例局灶增生性肾炎患者、6例膜性肾病患者、6例膜增生性肾炎患者、8例轻微病变性肾炎患者、8例系膜增生性肾炎患者肾组织细胞间粘附分子-1的表达水平进行检测,并结合临床资料进行统计学分析。结果:1)正常对照组肾小球及肾小管间质少许表达细胞间粘附分子-1,各疾病组肾小球及肾小管间质细胞问粘附分子-1表达增高,与正常对照组相比有明显统计学差异(P＜0.01)。2)各疾病组间比较肾小球及肾小管间质细胞间粘附分子-1的表达:肾小球的表达面积除局灶增生性肾炎、膜性肾病、膜增生性肾炎及系膜增生性肾炎分别与轻微病变性肾炎两两比较有统计学意义(P＜0.05)外,其余各组间比较肾小球及肾小管间质表达面积均无明显统计学差异(P＞0.05)。各组间比较细胞间粘附分子-1表达的平均灰度均无统计学意义(P＞0.05).3)局灶增生性肾炎组、膜性肾病组及膜增生性肾炎组24小时尿蛋白定量与细胞间粘附分子-1表达的平均灰度之间有相关性,相关系数分别为(0.646、0.785、0.828)。轻微病变性肾炎组和系膜增生性肾炎组各临床项目与肾小球及肾小管间质细胞间粘附分子-1表达之间均无相关性。结论:1)细胞间粘附分子-1在正常肾组织的肾小管上皮细胞、肾小球系膜细胞、内皮细胞少许表达。在胞浆、胞膜及胞核部分呈颗粒样表达,以胞浆为主。而在各疾病组中肾小球系膜细胞、内皮细胞、壁层上皮细胞、肾小管上皮细胞及间质浸润的淋巴、单核细胞中表达明显增多。2)各组问比较细胞间粘附分子-1表达的平均灰度均无统计学意义,表明细胞间粘附分子-1在原发性慢性肾脏疾病患者肾组织的表达与患者的肾脏疾病的病理类型无关。3)细胞间粘附分子-1在原发性慢性肾脏疾病患者的疾病进展及肾脏纤维化的发生中可能有重要作用,并且可能成为一个潜在的治疗目标。4)患者临床资料中24小时尿蛋白定量很可能对判断疾病的进展及预后有较好作用。
贾辛未[7]2010年在《辛伐他汀联合山莨菪碱在冠脉介入治疗中的心肾保护作用》文中研究说明经皮冠状动脉介入治疗是冠心病治疗的重大进展,每年有大量的冠心病患者从中获益。和世界各国一样,我国的冠心病介入治疗病例逐年增多,据统计,我国2002年的经皮冠状动脉介入治疗例数为3万例,2005年为7万5千例,到2009年,我国的冠心病介入治疗例数已经突破24万例,目前还在快速上升期。冠状动脉介入治疗后缓复流(无复流)现象和急性对比剂肾损伤是影响经皮冠状动脉介入治疗近远期效果的主要因素。虽然目前其发病机制尚未明确,但是,微循环功能障碍、炎症以及氧化应激反应等被认为是发生无复流和对比剂肾病的共同病理基础。他汀类药物和山莨菪碱均具有改善微循环、抗炎、抗氧化应激、改善血管内皮功能等作用。已有研究表明,常规剂量的他汀类药物可显着改善心肌灌注,降低对比剂肾病的发生,我们以前的研究也已经证明了山莨菪碱对冠脉无复流的防治作用。目前,关于强化剂量的他汀类药物能否进一步改善冠脉灌注、山莨菪碱对急性对比剂肾损伤的防治作用以及二者联合使用的效果等尚无研究。本研究在既往工作的基础上,进一步探索强化辛伐他汀治疗以及辛伐他汀联合山莨菪碱对冠脉介入治疗中心肌灌注的影响以及对急性肾损伤的保护作用并探讨起可能机制。本研究分为以下五部分:第一部分强化降脂治疗对急性冠脉综合征患者经皮冠状动脉介入治疗中心肌灌注的保护作用目的:探讨强化他汀治疗对急性冠脉综合征患者经皮冠状动脉介入治疗过程中心肌灌注的保护作用,并探讨其可能机制。方法:行择期PCI的急性冠脉综合征患者228例,随机分为标准他汀组(n=115)和强化他汀组(n=113)。于PCI术前7天,纪录PCI后的TIMI血流、纠正的TIMI计桢数(CTFC)以及TIMI心肌灌注分级(TMPG)等。于PCI前后测量肌酸磷酸激酶(CPK)、CPK同工酶MB(CPK-MB)、肌钙蛋白(ITnI)、高敏C反应蛋白(hs-CRP)、P选择素和细胞间粘附分子(ICAM)水平。结果:强化他汀组支架植入后TIMI血流0-1级显着少于标准他汀组,3级显着多于标准他汀组(P<0.05)。强化他汀组无复流发生率显着低于标准他汀组(P<0.001)。CTFC在强化他汀组显着低于标准他汀组(P<0.001)。强化他汀组的TMPG也显着优于标准他汀组(P=0.001)。PCI术后24小时,CPK-MB和TnI在强化他汀组显着低于标准他汀组(CPK-MB:18.74±8.41对21.78±10.64 P=0.018;TnI:0.99±1.07对1.47±1.54 P=0.006)。标准治疗组CK-MB升高者占27.8% (32/115),强化他汀组则只有15.9%(18/113)(P=0.030)。标准他汀组TnI升高者显着多于强化他汀组[36.5% (42/115)对19.5%(22/113),P=0.04],其中,标准他汀组的心肌坏死发生率为13%(15/115),而在强化他汀组仅为4.4%(5/113)(P=0.021)。PCI术后24小时,强化他汀组的hs-CRP、P选择素及ICAM-1水平均显着低于标准他汀组(P<0.001)。结论:PCI术前使用强化他汀治疗比标准他汀治疗能更有效改善急性冠脉综合征患者的心肌灌注、减轻心肌损伤。同时伴有hs-CRP、P选择素和ICAM-1水平的显着降低。第二部分辛伐他汀联合山莨菪碱治疗对约克猪冠状动脉介入治疗后心肌灌注的保护作用目的:缓复流/无复流不但增加冠脉介入治疗过程中的手术风险,还严重影响术后患者的长期预后。研究无复流的发生机制、寻找有效的预防和治疗的手段,是目前冠心病介入治疗领域的研究热点之一。山莨菪碱具有改善微循环,抗氧化、保护心肌细胞的良好作用。他汀类药物具有改善血管内皮细胞功能、抗凝、抗血小板、抗氧化、抗炎、改善血流动力学效应等多重效应。目前尚未发现有二者联合使用改善冠脉介入治疗中心肌灌注效果的研究报告。为此,我们在既往实验性微型猪冠脉介入治疗后无复流模型的基础上,进一步评价了强化的辛伐他汀联合山莨菪碱对冠脉介入治疗过程中心肌微循环灌注的保护作用。并通过测定炎症因子高敏C反应蛋白(hs-CRP)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和一氧化氮(NO)的水平,探讨其可能机制。方法:健康约克猪16头,体重30-40kg,被随机分为山莨菪碱组和辛伐他汀+山莨菪碱治疗组。联合治疗组预先饲喂辛伐他汀1mg/kg,山莨菪碱组则给予安慰剂,7天后开始实验。利用微导管超选择LAD,将多普勒导丝置于LAD中段,纪录LAD中段血流速度的变化,并监测LCA开口处压力。于LAD中段注射PMBS混悬液,5ml/次,每十分钟一次,共四次,每次注射PMBS前2分钟LAD内注射山莨菪碱5000ug,PMBS注射后5分钟行冠脉造影,纪录LAD的TIMI血流、TMPG和CTFC,评价心肌灌注情况。于试验结束时处死动物,取坏死和正常交界处缺血心肌分别测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO),并行病理学检查。于实验前、实验后采静脉血测定CKMB、TnI以及血清C反应蛋白(CRP)水平。利用染色法计算梗死心肌占左室重量之百分比。结果:联合治疗组的TIMI血流显着优于山莨菪碱组,TFCs显着低于山莨菪碱组(均P<0.05)。早期LAD内注射PMBS后两组心率均较基础值显着上升(P<0.05),但两组之间无显着差别(P=0.47,P=0.85)。以后山莨菪碱组的心率进一步显着升高(P=0.005),而联合治疗组则仍保持原水平。早期LAD内给与PMBS注射后两组的冠脉灌注压均显着上升(P<0.01)。以后山莨菪碱组的冠脉灌注压开始降低(P<0.05),联合治疗组则仍维持较高的冠脉灌注压力(P=0.042)。晚期联合治疗组冠脉灌注压力仍维持无显着降低,而山莨菪碱组则显着降低。早期冠脉注射PMBS后,两组的bAPV均有增高,但山莨菪碱组更明显;hAPV在山莨菪碱组降低,而在联合治疗组则维持高水平(P=0.000)。第叁次PMBS注射后hAPV两组均较基础值显着降低(P<0.01),但联合治疗组仍显着高于山莨菪碱组(P=0.000)。至第四次PMBS注射后,两组的hAPV进一步降低,两组比较无显着差别。在第一、二次冠脉注射PMBS后,联合治疗组CFR无显着降低,而山莨菪碱组的CFR则持续显着降低(P=0.006)。第叁、四次注射PMBS后两组的CFR均连续显着降低(P<0.05),但联合治疗组始终优于山莨菪碱组(P=0.025)。第一、二次注射PMBS后山莨菪碱组的h-MR均显着增高(P=0.032),而联合治疗组则无显着增高。在第叁次冠脉LAD内注射PMBS后,两组的h-MR均显着增高(P=0.030),两组间比较联合治疗组的h-MR仍显着低于山莨菪碱组(P=0.010)。在第四次冠脉LAD内注射PMBS后,两组的h-MR进一步显着增高(P=0.024),两组间比较h-MR已无显着差别。试验前山莨菪碱组血清总胆固醇水平为4.44±0.47mmol/L,联合治疗组的血清胆固醇水平为3.93±0.53mmol/L(P=0.063)。实验后60分钟,肌酸激酶同工酶MB、TnI、hs-CRP、MDA均显着增高,但山莨菪碱组显着高于联合治疗组;NO水平均显着增高(P=0.000),但联合治疗组的NO水平显着高于山莨菪碱组(P=0.006)。SOD水平显着降低(P=0.000),但联合治疗组的SOD水平高于山莨菪碱组(P=0.000)。山莨菪碱组心肌坏死平均坏质量占左心室总质量的18.5±3.1%,联合治疗组为11.3±2.9%。(P<0.05)。光镜下改变联合治疗组的心肌坏死显着轻于山莨菪碱组。结论:联合应用山莨菪碱和辛伐他汀治疗可显着改善冠脉介入治疗中的冠脉血流,增加心肌灌注,保护心肌。改善冠脉血流动力学、抗炎、抗氧化可能是其潜在机制。第叁部分强化他汀治疗对经皮冠状动脉介入治疗后肾损伤的保护作用目的:研究强化他汀治疗对PCI后肾功能的保护作用和预防对比剂肾病的效果,探讨其可能机制。方法:228例接受择期PCI的急性冠脉综合征,随机分为标准他汀治疗组(SSG n=115)和强化他汀治疗组(ISG n=113)。于PCI术前7天开始,SSG组患者口服20mg/天辛伐他汀,ISG组患者则口服80mg/天辛伐他汀。于PCI术前、术后24、48小时分别测定血清肌酐水平,按Cochcroft-Gault公式计算肌酐清除率。于PCI术前、术后24小时分别测定血清高敏C反应蛋白(hs-CRP)、P选择素和细胞间粘附分子1(ICAM-1)水平。结果:PCI后血肌酐水平显着升高,并于术后24小时达高峰,然后逐渐下降。PCI术后48小时,ISG组血肌酐水平显着回降(和术后24小时比P<0.001)并恢复到术前水平(和术前比P=0.94),而SSG组PCI术后48小时血肌酐水平未显着回降(和术后24小时比,P=0.11)。PCI术后24、48小时,ISG组的血肌酐水平均显着低于SSG组(术后24小时,P<0.05;术后48小时P<0.001)。PCI术后,两组肌酐清除率均显着降低,最低值出现在术后24小时,然后逐渐回升。术后48小时,SSG组肌酐清除率显着回升(和术后24小时相比,P=0.03),但仍低于术前水平(和术前相比,P<0.001),而ISG组术后48小时显着回升(和术后24小时相比,P<0.001)并恢复到术前水平(和术前相比,P=0.87),在术后24、48小时,ISG组肌酐清除率的回升程度均显着高于SSG组(均P<0.001)。虽然PCI术后血清hs-CRP、P选择素和ICAM-1水平均显着升高(均P<0.001),但ISG组低于SSG组(均P<0.001)。结论:和标准剂量他汀治疗相比,PCI前使用强化剂量他汀治疗可进一步保护PCI术后肾脏功能,降低CIN的发生率。这种益处伴随有血清hs-CRP、P选择素和ICAM-1水平的显着降低。第四部分急性对比剂肾损伤动物模型的建立目的:随着血管内使用对比剂日益增多,对比剂急性肾脏损伤已经成为当前医院内获得性急性肾损伤的第叁位原因。急性对比剂肾损伤的发生机制及预防措施,是当前心血管介入领域研究的焦点问题。但是迄今为止,还没有研究急性对比剂肾损伤的动物模型。本研究的目的是探讨利用大鼠复制急性对比剂肾损伤动物模型的效果。方法:健康SD大鼠24只,随机分为A组(实验组)和B组(安慰剂对照组)。A、B两组再分别随机分为12小时组和24小时组。大鼠正常饲养7天,待适应环境后开始模型制作。禁水叁天后,A组经舌下静脉注射复方泛影葡胺8ml/Kg,B组则注射等量生理盐水,然后给予自然饮水至试验结束,A、B两组分别于注射对比剂后12小时、24小时处死动物。分别于试验前、禁水叁天后、注射对比剂后3小时、6小时、12小时、24小时(B组)行肾脏超声检查,观察肾脏形态结构变化。并测量左侧肾脏长径、宽径和厚径以及左侧肾动脉直径、收缩期峰值血流速度(PSV)、舒张期峰值血流速度(EDV)、收缩/舒张期血流速度比值(S/D)、阻力指数(RI)、左肾血流量积分指数(VTI)容量及心率。于实验前、禁水叁天后、术后12小时(A组)、24小时(B组)采血测量血肌酐水平。分别于术后12小时(A组)、24小时(B组)处死大鼠,取肾脏进行光镜和透射电镜检查。结果:试验前、禁水叁天后两组肾脏大小无显着差别,术后3小时、6小时、12小时和24小时实验组的肾脏体积逐渐增大,回声均匀减低,但未见集合系统分离现象,此种表现在6-12小时最为明显,到术后24小时仍未恢复正常。肾动脉直径两组之间无显着差异。但收缩期峰值血流速度(PSV)、舒张期峰值血流速度(EDV)、收缩/舒张期血流速度比值(S/D)、左肾血流量积分指数(VTI)容量在术后6小时最低,以后逐渐恢复,至术后24小时基本恢复到术前水平;阻力指数(RI)术后逐渐升高,在术后6小时最低,到术后24小时恢复到术前水平,禁水叁天后心率显着增快,但术后心率无显着改变。禁水叁天后术后血清肌酐水平显着升高,以术后12小时为最高,至术后24小时随有明显恢复,当仍未恢复到术前水平。光镜检查发现使用对比剂后12小时肾髓质区可见片状肾小管结构消失,广泛充血、淤血,可见肾小管上皮细胞高度退变,并有较多的成纤维细胞增生及单核细胞浸润。24小时仍可见肾髓质区呈局灶性肾小管结构消失,充血、淤血,有少量成纤维细胞增生及数个单核细胞浸润,但均较12小时明显减轻。光镜下未见显着的肾小球病理学改变。电镜检查发现,使用对比剂后肾小管上皮细胞微绒毛脱落、稀疏,线粒体嵴合膜融合、消失,部分线粒体肿胀、破碎,质膜内褶消失,部分阻塞小管腔,基底膜水肿等改变。另外也可见肾小球毛细血管上皮细胞肿胀、吞噬现象,基底膜及组织间隙水肿,以术后12小时最明显。结论:结合脱水和对比剂静脉注射可造成的显着的急性肾功能损害,其肾脏组织形态学、血流动力学以及肾功能改变均符合人类对比剂肾病的特点。因此,本模型是研究人类对比剂肾病的理想模型。第五部分辛伐他汀联合山莨菪碱对大鼠急性对比剂肾损伤的保护作用目的:随着血管内使用对比剂日益增多,急性对比剂肾损伤发病率急剧增加,研究急性对比剂肾损伤的发生机制及预防措施,是当前心血管介入领域研究的焦点问题。他汀类药物具有独立于降脂作用以外的多重肾脏保护作用,山莨菪碱也具有抗休克、改善组织微循环灌注、抗自由基等的良好作用。但是,目前尚没有关于山莨菪碱对冠脉介入治疗后急性对比剂肾损伤的防治作用的研究,也缺乏关于他汀类药物和山莨菪碱联合使用对使用对比剂后肾脏保护方面的研究。本研究利用大鼠急性对比剂肾损伤动物模型,研究辛伐他汀、山莨菪碱及其联合使用对急性对比剂肾损伤的保护作用,并探讨其可能机制。方法:健康SD大鼠48只,随机分为对照组(C,n=12只)、山莨菪碱组(A,n=12只)、辛伐他汀组(S,n=12只)、辛伐他汀联合山莨菪碱组(A+S,n=12只)。四组再分别随机分为12小时组和24小时组,每组各6只。辛伐他汀组及联合治疗组大鼠给予辛伐他汀灌胃(0.1mg/100g)。对照组和山莨菪碱组则以等量生理盐水灌饲,连续7天。于给药的第四天开始禁水,连续叁天后,静脉注射对比剂(0.8ml/100g),然后给予自然饮水。于注射对比剂前15分钟,山莨菪碱组和联合治疗组分别给予山莨菪碱100ug/100g腹腔注射,对照组和辛伐他汀组则给予等量生理盐水腹腔注射。山莨菪碱组和联合治疗组于注射对比剂后4小时内每小时腹腔注射山莨菪碱100ug/100g一次,至第4-12小时每4小时重复腹腔注射山莨菪碱100ug/100g,而对照组和辛伐他汀组则于相应时间腹腔注射等量生理盐水。别于试验前、禁水叁天后、注射对比剂后3小时、6小时分别行肾脏超声检查,观察肾脏形态结构变化。并测量左侧肾脏长径、宽径和厚径以及左侧肾动脉直径、收缩期峰值血流速度(PSV)、舒张期峰值血流速度(EDV)、阻力指数(RI)、左肾血流量积分指数(VTI)容量及心率。分别于试验前、禁水叁天后、注射对比剂后12(12小时组)、24小时(24小时组)取血测定血肌酐、高敏C反应蛋白水平。于术后第12小时和24小时处死动物,分离左侧肾脏,做光镜和电镜检查。并取肾脏组织测定抗氧化指标超氧化物岐化酶、丙二醛、一氧化氮合成酶、一氧化氮、谷胱苷肽氧化酶水平。结果:注射对比剂后6小时起对照组肾脏的各径线均显着增大,而联合治疗组的肾脏各径线则均无显着变化。山莨菪碱组和辛伐他汀组则部分肾脏径线出现显着增大。对照组皮质髓质回声较3小时均匀减低,山莨菪碱组和辛伐他汀组回声仅有轻微减低,而联合治疗组则未见明显回声减低表现,各组均未见集合系统分离现象。术后3小时,联合治疗组的收缩期峰值血流速度(PSV)、舒张期峰值血流速度(EDV)、左肾血流量积分指数(VTI)均显着高于其它各组同期水平,并且不低于甚至高于术前水平。而对照组上述指标则显着低于其它各组,并且低于术前水平。山莨菪碱组和辛伐他汀组则无显着差别。在术后6小时,联合治疗组的收缩期峰值血流速度(PSV)、舒张期峰值血流速度(EDV)、左肾血流量积分指数(VTI)仍然显着高于其它各组同期水平,并且均比3小时显着增高。对照组上述指标则仍显着低于其它各组,并未恢复到术前水平,甚至进一步减低。而辛伐他汀组显着高于山莨菪碱组。术前S/D联合治疗组显着低于其它叁组,对照组显着高于其它叁组,辛伐他汀组和山莨菪碱组无显着差别。术后3、6小时,在继续保持这种差异的同时,S/D总体趋于恢复到基线水平,但联合治疗组在术后6小时已经和基线时无显着差别,而对照组仍显着高于基线水平。在术后3、6小时,联合治疗组的阻力指数显着低于对照组,而辛伐他汀组和山莨菪碱组则无显着差别。禁水叁天后心率显着增快(284±25次/分),但术后3小时和6小时山莨菪碱组和联合治疗组的心率均显着高于对照组和辛伐他汀组,辛伐他汀组3、6小时无差别,而山莨菪碱组6小时的心率高于3小时。血清肌酐水平在禁水叁天后、术后12小时及24小时显着升高,以术后12小时为最高,至术后24小时虽有明显恢复,但只有联合治疗组和辛伐他汀组恢复到术前水平,而山莨菪碱组和对照组均未恢复到术前水平,其中对照组恢复最慢。从肌酐升高的水平来看,术后12小时对照组最高,而联合治疗组最低,山莨菪碱组和辛伐他汀组位列第二和第叁,四组均有显着性差异。使用对比剂后12小时光镜观察发现:对照组在肾髓质区可见片状肾小管结构消失,广泛充血、淤血,可见多个高度退变的肾小管样上皮细胞残留,有较多的成纤维细胞增生及单核细胞浸润。山莨菪碱组肾髓质区可见局灶性区域肾小管结构消失,广泛充血、淤血,有数个散在的肾小管上皮残留,并可见少量成纤维细胞增生及数个单核细胞浸润。辛伐他汀组肾髓质区可见局灶性区域肾小管结构消失,广泛充血、淤血,可见少量成纤维细胞增生及数个单核细胞浸润。联合治疗组肾髓质区可见点状肾小管结构紊乱,有极少量成纤维细胞和数个单核细胞浸润,轻度充血。术后24小时,对照组仍可见肾髓质区呈局灶性肾小管结构消失,充血、淤血,可见有少量成纤维细胞增生及数个单核细胞浸润,山莨菪碱组也可发现上述改变,但均较12小时时明显减轻,而辛伐他汀组和联合治疗组的肾脏结构基本恢复正常。光镜下12小时和24小时均未见显着的肾小球病理学改变。电镜检查发现,使用对比剂后肾小管上皮细胞微绒毛脱落、稀疏,线粒体嵴合膜融合、消失,部分线粒体肿胀、破碎,质膜内褶消失,部分阻塞小管腔,并有基底膜及组织间隙水肿等改变,另外也可见肾小球毛细血管上皮细胞肿胀、吞噬现象,基底膜及组织间隙水肿,以术后12小时最明显。四组比较以对照组最明显,而联合治疗组最轻。四组动物的高敏C反应蛋白(hs-CRP)术前则显着增高,但联合治疗组和辛伐他汀组显着低于其它两组。术后12小时,hs-CRP水平达到最高水平,四组之间均有显着差别,其中联合治疗组最低,对照组最高,辛伐他汀组低于山莨菪碱组。至术后24小时,四组的hs-CRP水平均比12小时显着降低,但仍均显着高于术前水平。其中仍以联合治疗组最低,对照组最高,辛伐他汀组显着低于山莨菪碱组。术后12小时,四组的SOD水平均显着降低,其中对照组SOD降低最显着,而联合治疗组最高,山莨菪碱组和辛伐他汀组无显着差别,但均显着高于对照组。术后24小时,对照组和山莨菪碱组的SOD水平进一步显着降低,而辛伐他汀组和联合治疗组则显着回升,其中联合治疗组已经恢复到基础水平。术后12小时四组MDA水平均显着增高,其中对照组最高,联合治疗组最低,虽然山莨菪碱组和辛伐他汀组显着低于对照组,但辛伐他汀组显着低于山莨菪碱组。术后24小时的MDA水平在四组均显着降低,其中联合治疗组的MDA水平已经接近术前水平,而其它叁组仍显着高于术前水平。术后12小时,GSH-Px水平以对照组为最低,联合治疗组最高,山莨菪碱组和辛伐他汀组均显着高于对照组,辛伐他汀组高于山莨菪碱组。术后24小时,四组的GSH-Px水平较12小时均显着回升,其中联合治疗组已经恢复到术前水平,而其它叁组仍低于术前水平。术后12小时,对照组和山莨菪碱组的NOS水平显着降低,而辛伐他汀组则无显着改变,而联合治疗组则显着升高。术后24小时,对照组的NOS水平进一步降低,山莨菪碱组无显着差别,而辛伐他汀组和联合治疗组则进一步升高,其中联合治疗组升高最明显,后二者均显着高于基础水平。术后12小时,iNOS水平显着增高(P<0.01),其中以对照组最高,显着高于其它叁组(P<0.05),而山莨菪碱组、辛伐他汀组和联合治疗组无显着差别。术后24小时,仍以对照组为最高,联合治疗组最低,山莨菪碱组和辛伐他汀组无显着差别。和12小时比较,术后24小时iNOS水平在对照组、山莨菪碱组和辛伐他汀组均无显着差别,但联合治疗组的iNOS水平则显着低于术后12小时。在对照组,术后12小时NO水平较低,24小时有轻微但显着上升;山莨菪碱组12小时NO较高,但术后24小时的显着降低;辛伐他汀组术后12小时的NO含量比较高,术后24小时则继续上升;联合治疗组在术后12小时的NO最高,虽在术后24小时有所下降,但仍呈显着升高状态。结论:山莨菪碱和辛伐他汀的联合治疗可有效预防对比剂急性肾损伤的发生,其可能机制涉及改善肾脏的血流动力学、抗炎、抗氧化等。
张竞之[8]2009年在《黄芪多糖、丹皮酚对高血压病血瘀证内皮细胞损伤模型TLR4、NF-κB表达的影响》文中研究表明目的通过TLR-NF-κB信号转导通路,探讨高血压病血瘀证的形成机理,黄芪多糖、丹皮酚治疗高血压病血瘀证的作用机制,验证高血压病血瘀证细胞模型。方法1.对高血压病血瘀证的研究:(1).10%的高血压病血瘀证患者血清干预人脐静脉内皮细胞(HUVEC-C)24h,建立血瘀证细胞模型(血瘀证组),非血瘀证组、健康组、空白对照组分别用同等浓度的高血压病非血瘀证患者血清、健康人血清和不含血清培养基干预相同时间。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞的活性,倒置相差显微镜观察细胞形态。(2).不同浓度的黄芪多糖、丹皮酚干预10%的高血压病血瘀证患者血清损伤HUVEC-C 24h,MTT法检测细胞的活性,倒置相差显微镜观察细胞形态。(3).实时荧光定量(PCR)法测血瘀证组,非血瘀证组、健康组细胞果蝇样受体(TLR4)mRNA的表达。(4).不同浓度的黄芪多糖、丹皮酚干预脂多糖(LPS)诱导HUVEC-C TLR4表达(24h)及核转录因子(NF-κB)活化(2h)。PCR法测TLR4 mRNA及NF-κBmRNA的表达,免疫印迹(Western-blot)技术测TLR4蛋白及NF-κB蛋白的表达。NF-κB的活化均用IκBα的降解反映。2.对高血压病不同病情分级的研究:(1).高血压病1级组、2级组、3级组、健康组HUVEC-C分别用10%的高血压病1级患者血清、2级患者血清、3级患者血清、健康人血清干预24h,MTT法检测细胞的活性,倒置相差显微镜观察细胞形态。(2).PCR法检测高血压病1级组、2级组、3级组、健康组细胞TLR4 mRNA的表达。结果1.血清作用24h后,细胞活性按健康组(0.3697±0.0548)、非血瘀证组(0.3196±0.0479)、血瘀证组(0.2120±0.0317)、空白组(0.1853±0.0129)的顺序降低,组间差异显着(P<0.01或P<0.001);血瘀证组细胞逐渐收缩变形,细胞间隙增大,胞浆内有暗色颗粒。2.黄芪多糖、丹皮酚可减轻高血压病血瘀证患者血清对细胞形态变化的影响;细胞活性呈剂量依赖性增强,APS各组的OD值为:健康组(0.4419+±0.0216)、血瘀证组(0.2243±0.0298)、小剂量组(0.2340±0.0376)、中剂量组(0.2656±0.0233)、大剂量组(0.3487±0.0469),组间比较差异显着(P<0.01或P<0.001);Pae各组的OD值为:健康组(0.5290±0.0946)、血瘀证组(0.2888±0.0319)、小剂量组(0.3227±0.0371)、中剂量组(0.3732±0.0736)、大剂量组(0.4510±0.0909),组间差异显着(P<0.01或P<0.001)。3.血清作用24h后,TLR4 mRNA的表达按健康组(5.4160×10~(-4)±0.2488×10~(-4))、非血瘀证组(6.4692×10~(-4)±0.0956×10~(-4))、血瘀证组(8.2598×10~(-4)±0.2685×10~(-4))的顺序逐渐增高,组间差异显着(P<0.01)。4.黄芪多糖、丹皮酚可呈剂量依赖性减少LPS诱导的TLR4 mRNA高表达,各组值分别为,健康组(5.4160×10~(-4)±0.2488×10~(-4))、血瘀证组(8.2598×10~(-4)±0.2685×10~(-4))、LPS诱导组(97.3569×10~(-4)±0.9599×10~(-4))、APS小剂量组(33.4288×10~(-4)±0.8112×10~(-4))、APS中剂量组(13.5707×10~(-4)±0.6434×10~(-4))、APS大剂量组(7.2484×10~(-4)±0.0566×10~(-4))、Pae小剂量组(10.7065×10~(-4)±0.6657×10~(-4))、Pae中剂量组(7.1994×10~(-4)±0.0939×10~(-4))、Pae大剂量组(6.4403×10~(-4)±0.1271×10~(-4));黄芪多糖、丹皮酚可呈剂量依赖性抑制LPS诱导的IκBαmRNA的降解,各组值分别为,健康组(0.4536±0.0164)、LPS诱导组(0.0665±0.0007)、APS小剂量组(0.0873±0.0007)、APS中剂量组(0.1333±0.0005)、APS大剂量组(0.1371±0.0004)、Pae小剂量组(0.0973±0.0003)、Pae中剂量组(O.1357±0.0016)、Pae大剂量组(0.1425±0.0012)。5.黄芪多糖、丹皮酚可抑制LPS诱导的TLR4蛋白高表达和IκBα蛋白的降解。6.血清作用24h后,细胞活性按健康组(0.4609±0.0382)、高血压病1级组(0.4241±0.0270)、2级组(0.3330±0.0249)、3级组(0.2116±0.0222)的顺序降低,健康组高于高血压病1级组,但差异不显着(P>0.05),与其它各组差异显着(P<0.01);2级组、3级组细胞逐渐收缩变形,细胞间隙增大,胞浆内有暗色颗粒。7.血清作用24h后,TLR4 mRNA的表达按健康组(5.4160×10~(-4)±0.2488×10~(-4))、高血压病2级组(5.9333×10~(-4)±0.3431×10~(-4))、1级组(8.0697×10~(-4)±0.1249×10~(-4))、3级组(8.1314×10~(-4)±0.0702×10~(-4))的顺序逐渐增加,健康组低于1级组和3级组,差异显着(P<0.01);健康组低于2级组,但差异不显着(P>0.05)。结论1.血瘀证内皮细胞损伤模型符合中医发病因素,体现“病”“证”结合特点,又易于复制,有较高的可重复性。2.APS、Pae可减轻高血压病患者血清对内皮细胞的损伤,增强细胞活性和维持细胞形态结构。3.TLR-NF-κB信号途径介导的炎症反应和免疫紊乱可能是高血压病血瘀证形成的机制之一。4.APS、Pae通过降低TLR4表达,抑制IκBα降解起抗炎调节免疫的作用,这可能是其活血化瘀作用的机理之一。5.APS、Pae可通过降低TLR4的表达,抑制IκBα的降解,抗炎、调节免疫,起保护内皮细胞的作用。6.TLR-NF-κB信号途径介导了高血压病的炎症反应和免疫紊乱,这可能是高血压病的发病机制之一。
高若愚[9]2012年在《抵挡汤对糖尿病大鼠ICAM-1、VCAM-1表达影响的实验研究》文中提出目的：通过STZ诱导建立糖尿病大鼠模型,观察不同时间段给予抵挡汤干预对糖尿病大鼠一般情况及下肢血管和肾脏ICAM-1和VCAM-1表达的影响,探讨抵挡汤对糖尿病慢性并发症影响作用的可能机制。方法：利用链脲佐菌素(STZ)尾静脉注射,配合高脂饲料饮食制备糖尿病大鼠模型,将大鼠分为正常对照组、模型对照组、抵挡汤晚期组、抵挡汤中期组、抵挡汤早期组、辛伐他汀组、罗格列酮组。观察抵挡汤对糖尿病大鼠生长状态、体重、血糖、血胰岛素的影响,HE染色后观察大鼠股动脉和肾脏形态学改变,免疫组化染色观察ICAM-1和VCAM-1蛋白的表达,探讨抵挡汤对糖尿病大鼠在下肢血管病变和肾脏病变中的可能影响机制。结果：成功建立了STZ诱导糖尿病大鼠模型。到实验12周时,与正常对照组比较,其他各组大鼠体重明显升高,说明高脂饲料饮食可明显增加大鼠体重,而有助于糖尿病大鼠模型的建立。与正常对照组比较,STZ诱导糖尿病造模各组大鼠血糖明显升高；与模型对照组比较,罗格列酮组大鼠血糖明显降低,而抵挡汤干预各组及辛伐他汀组大鼠血糖则无明显变化。与正常对照组比较,模型对照组大鼠血管和肾脏组织ICAM-1和VCAM-1表达增多,而与模型对照组比较,抵挡汤早期组、抵挡汤中期组、辛伐他汀组和罗格列酮组的大鼠免疫组化染色ICAM-1和VCAM-1表达减少,下肢血管及肾脏病理改变相对较轻。结论：本研究在建立STZ诱导糖尿病大鼠模型基础上,观察了中药抵挡汤对实验性糖尿病大鼠慢性并发症发生和发展的作用。发现抵挡汤一定时间段给药干预,可使糖尿病大鼠下肢血管和肾脏病理改变减轻,其病变发展得到延缓,尤其早期干预效果较好。这可能与抵挡汤降低ICAM-1和VCAM-1蛋白在组织表达,从而抑制糖尿病大鼠下肢血管病变和肾脏病变的炎症反应等机制有密切联系。
李然[10]2012年在《天津地区糖尿病肾病的易感基因研究》文中研究表明目的：糖尿病肾病是糖尿病重要的微血管病变,是糖尿病死亡的主要原因之一,也是导致终末期肾损害的重要原因。糖尿病肾病发病机制复杂,糖脂代谢紊乱、氧化应激、肾素血管紧张素系统、足细胞屏障功能、炎症反应、上皮细胞间叶细胞转化及细胞因子等均可影响肾脏病变。研究表明遗传因素在DN发病中发挥重要作用,从群体水平探讨DN的遗传易感性具有十分重要的意义。本研究选取与发病机制相关的9个基因16个SNPs位点进行基因分型,以此对糖尿病肾病发病进行关联分析,并探索基因型交互作用在糖尿病肾病发病中的作用。方法：收集1329名中国北方天津地区汉族2型糖尿病患者,样本分别来自天津医科大学总医院、天津医科大学代谢病医院、南开大学人民医院。收集患者的一般资料及临床生化指标,包括年龄、体重、血糖、血肌酐、白蛋白等。按是否伴发糖尿病肾病分为糖尿病肾病组(n=615)和非糖尿病肾病组(n=714),以糖尿病病程大于10年,无糖尿病肾病无糖尿病视网膜病变患者作为糖尿病肾病组的对照组(n=165)。采用高盐法(原平皓公司试剂盒)提取患者外周血白细胞基因组DNA,应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术,对1329例天津地区的2型糖尿病患者的9个基因16个SNP位点进行基因分型,应用SPSS16.0统计软件对样本进行描述流行病学分析和数据整理,然后应用PLINK软件做基因型-表型的关联分析及基因型交互作用分析。结果：①以糖尿病病程超过10年,无糖尿病肾病无糖尿病视网膜病变患者作为对照,TOX基因的rs1526167、rs17304270SNP与糖尿病肾病存在关联,特别是TOX基因的rs1526167SNP位点(P=0.001887)与糖尿病肾病存在显着关联。②与对照组相比,SMAD3基因的rs12102171SNP位点与糖尿病肾病发病相关联(P=0.04179)。③与对照组相比,CDKN2A/B基因的rs10811661位点与糖尿病肾病存在关联(P=0.03081)。④所测9个基因16个SNPs位点在糖尿病肾病发病中未见明显交互作用。结论：遗传因素在糖尿病肾病发生中起重要作用,TOX基因、SMAD3基因及CDKN2A/B基因的多态性与糖尿病肾病发病相关,LIMK2、SFI1、ACE、VEGFA、 SOD2、PDGFB基因所测位点与天津地区2型糖尿病肾病不相关。
参考文献：
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