杨晓军1 邢瑞彬2 田晓玲3 杨国锋1 吕东敏1
（1.河北青龙满族自治县中医院急诊科 066500）
（2.河北青龙满族自治县中医院内科 066500）
（3.河北青龙满族自治县中医院脑病科 066500）
【摘 要】目的：分析不同程度脑梗死患者外周血CD4+CD25+T细胞（Treg 细胞）与Treg 细胞来源的IL-10阳性细胞及TGF-β1阳性细胞水平变化。方法：选择2013年10月～2015年2月诊断为急性脑梗死患者120例， 依据入院后24h内神经功能缺损程度评分（NIHSS评分）将患者分为轻度组、中度组与重度组各40例，取短暂性脑缺血发作患者20例作为对照组。采用流式细胞术检测发病后24h患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞以及Treg细胞来源的IL-10阳性细胞以及TGF-β1阳性细胞占淋巴细胞的百分比，比较不同分组患者中上述指标变化。结果：发病后,对照组、轻度组、中度组、重度组患者Treg [（15.91±2.59）% 比(16.03±3.21）% 比(24.72±3.06）% 比(38.45±5.02）%，F=,3.051，P=0.005]，血清中IL-10阳性细胞占淋巴细胞的比例 [（1.62±0.13）% 比(1.65±0.14）% 比(1.96±0.11）% 比(2.28±0.15）%、F=3.654，P=0.005]，血清中TGF-β1阳性细胞占淋巴细胞的比例 [（0.53±0.19）% 比(0.59±0.22)% 比(0.96±0.17)% 比(1.31±0.24)%、F=3.632，P=0.003)。随着病情程度的加重，血清中CD4+CD25+Treg细胞以及Treg细胞来源的IL-10阳性细胞以及TGF-β1阳性细胞的百分比水平逐渐升高。4组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。结论：急性脑梗死患者存在细胞免疫抑制。随着脑梗死病情程度的加重，反应细胞免疫抑制水平的Treg 细胞与Treg 细胞分泌的IL-10阳性细胞及TGF-β1阳性细胞水平存在明显差异。
【关键词】急性；脑梗死；CD4+CD25+T细胞；IL-10；TGF-β1
【中图分类号】R743.33 【文献标识码】B 【文章编号】1003-5028（2015）8-0665-02
急性脑梗死是一个复杂的病理生理反应过程。研究表明[1]免疫应答与动脉粥样硬化之间存在密切关系，免疫激活引发炎性反应参与粥样硬化发展过程。动物实验[2]结果发现脑梗死大鼠机体免疫T细胞处于免疫抑制，当阻断交感神经后，机体免疫抑制逆转，揭示免疫炎性反应可能参与了急性脑梗死发病后的病理修复过程。那么，在不同程度脑梗死患者中，机体免疫状态与炎性水平是否存在变化，尚存在疑问。课题研究目的试分析不同程度脑梗死患者外周血CD4+CD25+T细胞（Treg 细胞）与Treg 细胞来源的IL-10阳性细胞及TGF-β1阳性细胞水平变化。
1 资料与方法
1.1 研究对象：选择2013年10月～2015年2月河北省青龙满族自治县中医院诊断为急性脑梗死患者120例。男，65例，女55例，年龄（65.92±4.27）岁。患高血压病史87例，糖尿病病史63例，高脂血症52例。急性脑梗死诊断标准：① 符合中国急性缺血性脑卒中诊治指南（2010版）；② 入组患者均经过颅脑CT/MRI影像学诊断证实；③ 发病后24内入院。病例排除标准：⑴ 出血性脑卒中、恶性肿瘤、慢性疾病终末期者；⑵ 发病前3个月内有激素服用史，服用免疫抑制剂或调节剂患者。短暂性脑缺血发作诊断标准符合中国缺血性脑卒中和短暂性脑缺血发作二级预防指南2010版[3]。 本研究得到医院伦理委员会批准，所有治疗获得患者或者家属的知情同意，签署知情同意书。
1.2 研究方法
1.2.1 分组方法：入组患者依据入院后24h内神经功能缺损程度评分（美国国立卫生研究院卒中量表评分，NIHSS评分）将患者分为轻度组、中度组与重度组各40例，取短暂性脑缺血发作患者20例作为对照组。4组患者年龄、性别、基础病史（危险因素）、体重指数等基础资料差异无统计学意义（P＞0.05）。
1.2.2 指标及方法：采用流式细胞术检测发病后24h患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞以及Treg细胞来源的IL-10阳性细胞以及TGF-β1阳性细胞的百分比，比较不同分组患者中上述指标变化。CD4+CD25+Treg细胞检测采用单克隆抗体包括CD3-FITC、CD4-PE、CD8-PE等。同型检测荧光抗体20ul与抗凝全血混匀，加溶血剂、FLOW COUNT 100UL混匀，按四色方案上机检测。胞内细胞因子IL-10以及TGF-β1检测细胞培养使用肝素抗凝血加1640培养液混匀，PMA25ng/mL,ionomycin做刺激剂，加monensin4uL阻止细胞因子分泌细胞外培养后上机检测。胞内因子染色按照说明书分步骤操作进行。
1.3 统计学分析：采用Graphad prism5统计软件进行数据分析，计量资料用（ ±s）表示，多组比较采用F检验，两组间指标比较采用q检验，P＜0.05差异有统计学意义。
2 结果
2.1 外周血CD4+CD25+T细胞（Treg 细胞）与Treg 细胞来源的IL-10及TGF-β1水平：发病后,随着病情程度的加重，对照组、轻度组、中度组、重度组患者血清中CD4+CD25+Treg细胞以及Treg细胞来源的IL-10阳性细胞以及TGF-β1阳性细胞的百分比水平逐渐升高，4组之间差异有统计学意义（P＜0.05）见图1。其中，对照组与轻度组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。中度组与重度组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）见表1。
3 讨论
对于缺血性脑损伤的机制目前存在多种学说[4,5]，如既往研究较为广泛的自由基损伤、细胞内钙离子超载、酸中毒学说等。近年来，免疫炎性反应学说受到越来越多的研究[6]。脑缺血发生后，激活白细胞发生迁移、聚集，伴有中性粒细胞与单核/巨嗜细胞浸润，释放炎性细胞因子如白介素、肿瘤坏死因子、转化生长因子等，造成血管通透性增加，血脑屏障破坏，脑组织肿胀加重。白介素家族是由单核细胞产生的免疫活性因子，可作用于白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞等，发挥多种生物效应，参与机体的免疫应答、炎性调节等作用。脑缺血损伤初期，炎性细胞因子分泌增加。IL-10是由CD4+辅助性T细胞分泌的细胞因子，具有多种抑制作用。在动脉粥样硬化早期即有表达，IL-10可下调单核细胞趋化蛋白-1表达，减少单核细胞积聚，对动脉斑块的形成和发展具有重要延缓作用。有研究表明[7]IL-10具有调节细胞间粘附分子表达，起到抑制脑缺血后炎症反应和免疫损伤作用。动物实验表明[26]脑梗死后注射IL-10可以明显缩小梗死体积。
转化生长因子（transforming growth factor,TGF）超家族是一组能够调节生长和分化的多肽生长因子包括TGF-β1、活化素等三大类[8]。其中TGF-β1是一种多功能细胞因子，全身组织细胞均可合成TGF-β1并表达相应抗体。中枢神经系统神经元、星形胶质细胞和小胶质细胞均可分泌表达TGF-β1，在正常生理情况下，TGF-β1呈低水平表达。在缺血缺氧情况下，TGF-β1可高表达。TGF-β1能保护神经元，调节炎症反应、拮抗神经毒性作用。也有研究表明[9]TGF-β1作为一种重要的内源性免疫抑制细胞因子，具有抑制促炎细胞因子的功能，而起到保护作用，同时TGF-β1也是免疫细胞内的关键调节因子，可通过细胞内信号通路直接参与调节性T细胞（Treg）以及促炎症辅助T细胞17（Th17）等表达，从而调节免疫细胞的生成、分化以及促炎和抗炎功能的发挥。
既往研究[10]表明缺血性脑卒中发生后，机体免疫系统的改变主要表现为炎症与免疫应答的变化，包括单核巨噬细胞功能的降低与淋巴细胞数目的减少。也有研究表明[11]卒中后机体免疫功能的改变主要表现为机体细胞免疫应答的抑制，表现为以CD4+CD25+T细胞比例的失调，由此引发的的分泌细胞因子数量变化。卒中后机体的免疫功能的改变有可能为卒中后相关性感染研究提供理论依据。临床实际工作中发现对于重症急性脑梗死患者，临床合并肺部感染及泌尿系感染几率明显增加，而在轻中度脑卒中患者卒中相关性感染较少发生。课题依据神经功能缺损程度将患者分组，试就不同程度的脑卒中患者机体细胞免疫功能的改变展开初步分析。
研究结果发现缺血性脑卒中发病后，随着病情程度的加重，对照组、轻度组、中度组、重度组患者血清中CD4+CD25+Treg细胞以及Treg细胞来源的IL-10阳性细胞以及TGF-β1阳性细胞的百分比水平逐渐升高，4组之间差异有统计学意义（P＜0.05）。其中，对照组与轻度组比较，差异无统计学意义（P＞0.05），中度组与重度组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。既往实验证实[12]卒中后免疫抑制有助于神经组织的保护，避免机体免疫系统对神经组织的攻击损伤，但过度的免疫抑制也可能造成机体抵抗力下降，继发感染发生率增加。急性脑缺血发生后，免疫反应不仅局限在脑组织局部中，而且外周血、脾脏、骨髓等其他免疫淋巴器官也产生相应的变化。国外研究针对中枢神经损伤提出了免疫抑制的理念[13]，指出中枢神经系统损伤后，患者存在肺部感染及泌尿系感染几率增加的情况可能与患者机体内存在的免疫调节失衡，免疫抑制耐受现象有关。
课题结果表明急性脑梗死患者存在细胞免疫抑制。随着脑梗死病情程度的加重，其反应细胞免疫抑制水平的Treg 细胞与Treg 细胞分泌的IL-10及TGF-β1水平存在明显差异。课题研究结果有助解释卒中相关性感染的发生机制。对于脑卒中患者给予免疫调节疗法是否有助于脑卒中预后的改善，尚待课题进一步研究。
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论文作者:杨晓军1,邢瑞彬2,田晓玲3,杨国锋1,吕东敏1
论文发表刊物:《河南中医》2015年8月
论文发表时间:2016/6/1
标签：细胞论文; 免疫论文; 患者论文; 阳性论文; 细胞因子论文; 机体论文; 抑制论文; 《河南中医》2015年8月论文;