吴乾1 王福花2（通讯作者）
（1山西省肿瘤医院中医科 030013）
（2山西省肿瘤医院 分子生物室 山西 太原 030013）
【摘要】目的：探讨采用蛋白质组学技术筛选不同中医证型胃癌相关蛋白的应用效果。方法：选取本院收治的胃癌患者32例，依据不同中医证型分为实证组17例与虚证组15例，分别对两组患者血清进行蛋白提取与分离，采用蛋白组学技术筛选其相关蛋白，并分析蛋白组学技术在中医证型中的应用价值。结果：不同中医证型患者的血清蛋白质双向电泳图表现具有明显差异，虚证患者的血清电泳检测出（1408±14）个蛋白位点，实证患者血清电泳检测出（1407±12）个蛋白位点，且焦磷酸酶1、犯醌蛋白1、谷胱甘肽S转移酶与热休克蛋白90β在虚证患者中的表达显著强于实证患者。结论：采用蛋白质组学技术对胃癌患者其中医辨证分型具有良好的指导作用，对临床中医治疗具有确切价值。
【关键词】胃癌；中医证型；蛋白质组学技术
【中图分类号】R242 【文献标识码】B 【文章编号】2095-1752（2015）31-0324-02
【Abstract】Objective Using proteomics technology to screen related proteins of different TCM syndrome type of gastric cancer. Methods 36 gastric cancer patients were enrolled in this study. Their patterns of TCM syndrome were diagnosed, 19 deficiency patterns of TCM syndrome and 17 excess patterns of TCM syndrome respectively. We screen its related proteins using proteomics technology and analyze the application in different TCM syndrome type. Results There is significant differeration with serum protein two-dimensional electrophoresis figure in patients of different TCM syndrome types. It detect 1408±14 and 1407±12 protein loci in deficiency syndrome and excess patterns patients of with electrophoresis, respectively. Deficiency syndrome patients have stronger expression lever than excess syndrome patients in focal phosphatase 1,quinone protein 1,glutathione S transferase and heat shock protein 90. Conclusion There was reliable screening effect to distinguish different patterns of TCM syndrome in gastric cancer by using proteomics technology. It can play a guiding role to TCM treatment.
【Key Words 】 Gastric cancer; Pattern of TCM syndrome; Proteomics technology
胃癌是影响人类生命安全的最主要恶性肿瘤之一，目前我国胃癌致死人数约占全部恶性肿瘤死亡人数的23%[1]。最近几年，临床针对该疾病患者采用中医药治疗的关注程度获得了显著提升，在多种方面均存在较好的改善效果。但常规的辨证分型仅依靠中医医师的临床经验来完成，缺乏客观的分型依据。蛋白质组学主要通过对细胞与基因进行有序观察来表现蛋白质的不同特性[2]，本次研究中采用该种技术分析不同证型患者的血清蛋白质，通过蛋白质质谱变化来探讨在中医证型筛选中的应用价值，现报道如下。
1.资料与方法
1.1 一般资料
选取本院收治的32例胃癌患者，依据其不同证型分为实证组17例与虚证组15例。实证组中包括淤毒内阻者7例，肝胃不和者6例，痰湿凝结者4例，男性9例，女性8例，平均年龄（53.1±12.3）岁；虚证组中包括脾胃虚寒者5例，胃热伤阴者4例，气血双亏组6例，男性8例，女性7例，平均年龄（53.9±11.8）岁。所有病例均无合并其他器官、免疫系统与血液系统的严重病变，且均符合我国中西医结合研究会对胃癌疾病的中医分型标准。
1.2 方法
1.2.1试剂
选用北京索来宝公司提供的尿素、考马斯亮蓝G-250、RPMI1640、蛋白定量试剂盒、DMEM、青链霉素溶液、碘乙酰胺、（NH4）2SO4、AP、TEMED与固相pH梯度胶条；NOVON公司提供的甘氨酸与Tris碱；Amresco公司提供丙烯酰胺、甲叉双丙酰胺、硫脲与溴酚蓝；美国USB公司提供CHAPS与DTT。
1.2.2仪器设备
选用GE Amersham Ettan IPGphor Ⅱ双向电泳仪，IPG phor IEF system电聚焦仪，BIO-RAD多功能酶标仪与图像扫描仪，Image Master 2D Elite系统分析软件等。
1.2.3检验方法
①标本处理：开展治疗前于空腹下对病患抽取5mL静脉血，采用常规方法对标本进行处理，检测蛋白浓度后将其放置于-80℃环境中保存。②双向凝胶电泳：抽取100μl蛋白提取物，添加硫脲2mol/L、CHAPS 2%、尿素7mol/L、DTT 100mmol/L及痕量溴酚蓝，将混合标本充分均匀，标本总量为320μL，再应用固相pH梯度胶条。依据BIO-RAD公司的指示说明完成具体操作电泳操作步骤。③银染与图像分析：完成电泳后将凝胶取出，应用乙酸与乙醇混合液进行1h固定，再行乙醇固定，固定后应用硝酸银染色。通过图像分析软件对凝胶进行扫描，获取蛋白斑点相关信息。④质谱鉴定：采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱法对两组所得目标蛋白质点进行质谱鉴定，选取凝胶中阳性斑点，应用硫代硫酸钠与铁氰化钾进行脱色处理，在获得的氰基基质中抽取1μL开展质谱分析并完成图谱采集[3]。⑤数据库检索：应用互联网搜索相关数据库，其物种来源设置为人类，质量为但同位素，肽片断质量的最大误差为0.2D，酶解片段不完全选择为1个。同期，应用蛋白数据库对实验所获取的氨基酸序列进行蛋白搜索，通过比较后将其评分最高者为最终蛋白质名称。
2.结果
不同中医证型患者的血清蛋白质双向电泳图详见图1-2，目测下依据颜色表现其蛋白位点具有显著差异。其中，虚证患者的血清电泳检测出（1408±14）个蛋白位点，实证患者血清电泳检测出（1407±12）个蛋白位点。依据不同证型患者的蛋白信息差异评估胃癌患者的焦磷酸酶1、乳酸脱氢酶等代谢类酶类；热休克蛋白70等分子伴侣；膜突蛋白、角蛋白7等细胞骨架蛋白；犯醌蛋白1、谷胱甘肽S转移酶等其他类蛋白均有较强表达，而焦磷酸酶1、犯醌蛋白1、谷胱甘肽S转移酶与热休克蛋白90β在虚证患者中的表达显著强于实证患者。
3.讨论
辨证分型在传统中医理论中占据核心位置，对相关治疗效果起到决定性作用。当前，针对恶性肿瘤疾病的证型划分依然缺乏指导性标准，进而在临床辨证分型与治疗期间均存在一定差异。蛋白质组学是当前新兴的临床技术，通过开展蛋白质芯片与质谱相关检测可准确收集标本中蛋白质类别，对恶性肿瘤靶向治疗与标志物选择具有重要意义[4-5]。本次研究主要采用蛋白质组学技术对不同中医证型患者开展相关检测，并通过其检验结果筛查不同病患的相关蛋白类别，以此提升胃癌患者中医辨证分型的可靠性与合理性。本研究实证与虚证患者通过临床蛋白质组学技术开展后，其血清蛋白质双向电泳图以目测颜色为依据观察存在显著差异。而虚证与实证患者的血清细胞电泳检测蛋白位点分别为（1408±14）个与（1407±12）个。通过后期质谱鉴定以及数据库检索发现所有患者中焦磷酸酶1、乳酸脱氢酶等代谢类酶类；热休克蛋白70等分子伴侣；膜突蛋白、角蛋白7等细胞骨架蛋白；犯醌蛋白1、谷胱甘肽S转移酶等其他类蛋白均有较强表达，但虚证患者的焦磷酸酶1、犯醌蛋白1、谷胱甘肽S转移酶与热休克蛋白90β表达水平更高。充分证实依靠蛋白质组学技术能够对不同中医证型胃癌患者相关蛋白进行有效筛选，依靠其蛋白表现差异对辨证分型有指导价值。
综上所述，针对肺癌患者采用蛋白质组学技术对其中医辨证分型具有良好的指导作用，通过质谱鉴定可有效表现各证型患者的特异性标志物，对临床中医治疗具有确切价值。
【参考文献】
[1]巴元明，王琳群.蛋白组学技术在中医证候学研究中的应用[J].湖北中医杂志，2013，35(11):33-35.
[2]李炜，刘炳亚，李建芳等.蛋白质组技术在胃癌相关标志物筛查中的应用[J].中华实验外科杂志，2006，23(10):1210-1212.
[3]Yan JX, Wait R, Berkelman T, et al. A modified silver staining protocol for visualization of proteins compatible with matrix-assisted laser desorption/ionization and electrospray ionization-mass spectrometry[J]. Electrophoresis,2000,17(21):3666-3672.
[4]Chan A,Chu K M,Lam C M,et a1.Soluble E-cadherin is a valid prognostic marker in gastric carcinoma[J]. GUT,2001,48(6):808-811.
[5]Seibert V,Ebert MP, Buschmann T.Advances in clinical cancer proteomics SELDI-TOF-MASS spectrometry and biomarker discovery[J].Brief Funct Genomic Proteomic,2005,19(4):16-26.
论文作者:吴乾, 王福花
论文发表刊物:《医药前沿》2015年11月第31期
论文发表时间:2016/4/29
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