郭伟正[1]2000年在《固相包被用二抗的研制》文中研究说明采用杂交瘤技术，获得了四株抗兔IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株（其中RG48G_8一株为针对兔IgG Fc片段的单抗）。 采用亲和层析法纯化驴抗羊IgG抗体及驴抗兔IgG抗体，并将纯化的二抗应用于固相包被管的制备。确定了包被条件：以0.1mol·L~(-1) PH4.8柠檬酸缓冲液作为包被缓冲液，包被抗体浓度：驴抗羊二抗为10μg/ml,驴抗兔二抗为 20μg/ml。建立了孕酮及 T_3的固相试管放射免疫分析方法。其中，T_3固相试管放免分析法的灵敏度0.15ng/ml，批内变异系数3.5％～13.0％，批间变异系数9.1％～11.2％，回收率103％～134％，该方法与T_3固相微球放免分析法的血样测定值相关系数为0.786。孕酮固相试管放免分析法的灵敏度0.17ng/ml，批内变异系数 2.2％～9.4％，回收率88.1％～119％，该方法与孕酮固相微球放分析法的血样测定值相关系数为0.943。
李兴霞[2]2006年在《乐果酶联免疫试剂盒的研制》文中指出农药残留是危害食品安全的重要原因，其中有机磷农药是目前使用最广的一类农药，约占农药总使用量的70％，因此，对有机磷农药的检测是食品安全检测的重要内容。乐果是一种中等毒性的有机磷杀虫剂，但其在体内的氧化产物——氧乐果的毒性是乐果毒性的数十倍。目前用来检测乐果的方法主要是气相色谱(GC)和高效液相色谱(HPLC)，这些方法前处理步骤复杂，费时费力、设备昂贵，需要专业人员操作，适宜实验室操检测，不适宜大量样品和现场快速检测。 酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked immunoassay，ELISA)方法快速、灵敏、选择性好，适宜痕量物质的检测，同时还具有检测成本低，操作简便，安全可靠等优点。所以研制乐果的酶联免疫试剂盒具有重要的实际意义。本研究旨在解决检测乐果残留的试剂盒中的关键技术和科学问题。 根据乐果分子结构的特点及生物学特性，首先合成了乐果的半抗原，然后将半抗原与载体蛋白牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联合成乐果的免疫原和包被抗原。 用合成的乐果免疫原免疫小鼠后获得乐果的多克隆抗体，用间接ELISA测定抗体的效价为1：256000，亲和常数为3.84×10~(10)，酶标抗体的效价是1：4000。除了氧化乐果以外，它与其他主要的有机磷农药的交叉反应率都很低。通过直接和间接ELISA检测，确定乐果试剂盒的最佳包被介质是0.05mol／L，pH9.6的碳酸盐缓冲液、最佳包被温度和包被时间是4℃、12h，包被原、抗体和酶标二抗的最佳工作浓度分别0.8μg／mL、1：32000和1：4000，检测限为0.01mg／L，实验的回收率为95.61％，并且与GC有很好的符合率，符合率为99.46％。试剂盒的批内和批间变异系数均低于7.72％。这表明试剂盒有很好的稳定性。
王国霞[3]2006年在《多菌灵酶联免疫分析技术研究》文中提出鉴于我国有机磷和氨基甲酸酯农药的大量应用,蔬果中农药残留超标不容忽视。为了满足我国农产品现场和快速检测的需要,选取应用广泛、具有广谱杀虫效果和具有代表性的氨基甲酸酯类农药—多菌灵作为研究对象,根据酶联免疫分析的原理,试图建立快速、低成本、适宜于现场检测的多菌灵残留的酶联免疫快速检测技术,为进一步研制ELISA试剂盒及其工艺流程定型提供基础,也将为蔬果中农药残留的快速、现场检测和监控提供技术支撑。 多菌灵,通用名carbendazim,分子式:C_9H_9N_3O_2,化学名称O-甲基-N-2-苯并咪唑氨基甲酸酯(Methyl 3H-benzoimidazol-2-ylaminoformate),与苯菌灵等具有相似的特异结构—苯并咪唑,与托布津、甲基托布津的代谢物结构相同。本研究设计了两条多菌灵半抗原的合成路线。其一,活化苯并咪唑环上的亚氨基,使之带上可以利用的羟基,合成半抗原—1—氧羰乙基丙酸—2—苯并咪唑氨基甲酸甲酯,多菌灵中的苯并咪唑环和氨基甲酸甲酯部分均被保留;其二,多菌灵原药在碱性条件下水解,生成2—氨基苯并咪唑氨基甲酸甲酯,再经琥珀酰化,得到半抗原—2—琥珀酰苯并咪唑。合成的两种半抗原经核磁共振和红外鉴定,证明合成成功。分别采用混合酸酐法、活性酯法使两种半抗原与蛋白质偶联制备了免疫原MBC-BSA和包被原MBC-OVA,偶联比均在3-35:1之间,符合小分子免疫的要求。经过免疫得到了抗血清,但是第一种免疫原的抗血清效价较低,不满足ELISA方法的要求。而第二种免疫原制备的多克隆抗体,效价在64000以上,同时除了与苯菌灵具有很高的交叉率、与噻苯达唑交叉率达到8%外,与托布津、甲基托布津等其它农药的交叉率均小于2%,符合ELISA分析技术建立对抗血清效价的要求,并用辛酸—硫酸铵盐析法对抗血清进行纯化。 本研究从包被条件与方法选择、抗体(抗血清)工作浓度优化和基质条件优化(盐浓度、pH值和样品溶剂)等方面初步得到间接ELISA分析的最佳工作条件,并在优化条件下建立多菌灵检测的间接ELISA法,抑制率与多菌灵的浓度对数值呈显著的线性关系,符合回归方程Y=11.832Ln(x)+57.366,回归系数R~2=0.9989~(**),测定范围0.05ng/L-15ng/L,最低检测限0.05ng/mL,在10%的甲醇提取中的添加回收率平均为109%,变异系数6.2—16%,初步鉴定满足多菌灵的实际检测需求。 采用多菌灵间接ELISA法对结构类似物进行交叉反应试验。当多菌灵对抗体抗原反应的抑制率为50%时,所需多菌灵的浓度为4.0ng/g,苯菌灵的浓度为4.0ng/g,噻苯达唑浓度为30ng/g,交叉反应率为8%,甲基托布津、托布津浓度均大于200ng/g,交叉反应率为小于2%,2—氨基苯并咪唑浓度大于500ng/g,交叉反应率小于0.8%。此法可以用于苯菌灵及其代谢物多菌灵的检测,但是如何区分苯菌灵和多菌灵残留尚需进一步研究。 以建立的ELISA检测方法对来自土壤和水中的添加样品进行回收实验,并与常规的HPLC分析进行比较实验,间接ELISA法测定土壤中多菌灵的添加回收率土壤中回收率为88.5—109%,变异系数4.06—8.65%,河水中的回收率为76.5—99.4%,变异系数3.21—5.85%,纯水中变异系数6.2—16%,平均回收率109%。 综合分析,所建立的多菌灵间接ELISA法,可适用于现场快速检测,成本和简便性等方面较传统的仪器分析具有明显的优势。
万亮[4]2008年在《三种真菌毒素蛋白质微阵列检测方法的初步研究以及抗四环素多克隆抗体的制备》文中提出1真菌毒素(Mycotoxin)是真菌产生的次级代谢产物,通常存在于霉变的谷物中,一旦通过食物链进入人体后,将可能造成致畸、致突变和致癌等严重危害,因此在全球食品安全问题中备受关注。目前,真菌毒素的检测一般采用高效液相色谱法(HPLC)或酶联免疫吸附法(ELISA),前者检测灵敏度高,但样品前处理烦琐、操作复杂、时间长,所需设备较昂贵;后者操作简便、快速,但每次只能完成一种真菌毒素的检测。因此,具有高通量优点的蛋白质微阵列技术将是真菌毒素多残留快速检测的发展趋势。本研究在前期已制备出玉米赤霉烯酮(Zearelenone,ZEN)、黄曲霉毒素B_1(Aflatoxin B_1,AFB_1)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol,DON)三种真菌毒素人工抗原及其相应单克隆抗体的基础上,采用间接竞争的检测原理,以荧光作为检测信号,对ZEN、AFB_1和DON蛋白质微阵列检测方法进行了初步研究。结果如下:(1)ZEN、AFB_1和DON蛋白质微阵列单指标检测的研究采用正交实验分别确定了ZEN、AFB_1和DON人工抗原的最佳点阵浓度为40μg/mL、40μg/mL和20μg/mL,对人工抗原固定条件、封闭方式和二抗浓度进行了单因素优化,确定了4℃过夜固定、37℃20min封闭和2μg/mL羊抗鼠IgG-CY3二抗为三个单因素实验的最佳条件,进而以ZEN、AFB_1和DON标品分别进行间接竞争抑制实验,绘制了ZEN、AFB_1和DON蛋白质微阵列单指标检测的标准曲线,灵敏度(IC_(50))分别为2.1ng/mL、0.29ng/mL和86.8ng/mL,线性检测范围分别为0.5-10ng/mL、0.125-1.0ng/mL和50-400ng/mL。(2)同时检测ZEN、AFB_1和DON蛋白质微阵列的初步研究在研究结果(1)的基础上,进行了同时检测ZEN、AFB_1和DON蛋白质微阵列的初步研究,确定了羊抗鼠IgG-CY3二抗的最佳浓度为4μg/mL,以ZEN、AFB_1和DON标准品同时进行间接竞争抑制实验,绘制了同时检测ZEN、AFB_1和DON蛋白质微阵列的标准曲线,灵敏度(IC_(50))分别为1.3ng/mL、0.154ng/mL和70.4ng/mL,线性检测范围分别为0.75-6ng/mL、0.125-0.6ng/mL和25-200ng/mL,均满足我国规定的最高允许限量的检测要求。2四环素(Tetracycline,TC)是由链霉菌产生的一种碱性广谱抗生素,因价格低廉,抗菌效果较好,在畜禽类养殖业中广泛使用,不可避免将造成动物体内四环素的残留,即使残留量很小,但长期食用,对人体健康仍具有很大的潜在危害。因此,对四环素残留进行及时检测是预防和控制其危害的有效手段。本研究进行了抗四环素多克隆抗体的制备研究,旨在建立四环素的免疫学检测方法。结果如下:采用甲醛一步连接法(Mannich反应)分别制备了四环素偶联阳离子化牛血清白蛋白(TC-cBSA)人工抗原和四环素偶联卵清白蛋白(TC-OVA)人工抗原。经紫外图谱鉴定后,以TC-cBSA为免疫原对三只BALB/C雌性小鼠进行背部皮内免疫,经三次加强免疫后,以TC-OVA为检测抗原采用间接ELISA检测抗血清效价,并采用间接竞争ELISA检测抗血清特异性及交叉反应。竞争抑制曲线表明三只小鼠均产生了抗四环素的特异性抗体,其中2号小鼠抗血清效价最高,为1:32000,半量抑制浓度(IC_(50))为173.78ng/mL,该抗血清仅与土霉素存在44.7%的交叉反应率,与链霉素、氯霉素和阿莫西林的交叉反应率均小于＜0.01%。
康敏[5]2012年在《玉米中伏马菌素B_1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫学快速筛选方法研究》文中认为伏马菌素(Fumonisins, FBs)是主要由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)产生的有毒水溶性代谢产物,大多存在于玉米及玉米制品中。其中FB1是伏马菌素的主要组分,也是导致伏马菌素毒性作用的主要原因。FB1具有神经毒性、免疫系统毒性和致癌性等。脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol, DON)是主要由禾谷镰刀菌(F.graminearum)和黄色镰刀菌(F.culmorum)产生的化学结构和生物活性相似的有毒代谢产物,是一种单端孢霉烯族化合物,常污染玉米、小麦和大麦等谷物及其制品,具有免疫毒性、胚胎毒性和细胞毒性等。目前用于检测FB1和DON的方法主要有生物学鉴定法、理化检测法和免疫分析法等。其中免疫分析法具有灵敏度高、特异性好、样品前处理简单等优点,适合于大批量样品的现场快速检测。本实验在自制FB1-OVA、DON-BSA全抗原及抗FB1、DON单克隆抗体的基础上,分别建立了检测玉米中FB1和DON的直接竞争ELISA (Dc-ELISA)和同时检测玉米中FB1和DON的膜基质免疫分析法。本研究采用EDC法和CDI法分别制备FB1-OVA、DON-BSA全抗原,采用戊二醛一步法、戊二醛二步法、过碘酸钠法、三聚氰氯法、三聚氰氯快速法分别制备了不同质量投料比的抗FB1酶标抗体和抗DON酶标抗体。经效价和直接竞争ELISA测试后,比较得知以三聚氰氯快速法合成的抗FB1酶标抗体效价最高,可达1024000,IC50值最低,为3.0ng/mL,该合成方法最简单,此时合成该酶标抗体需要的抗FB1单克隆抗体与HRP的质量投料比为1：2,抗FB1酶标抗体克分子比为2.92,酶结合率为51%,标记率为0.84454；以戊二醛二步法合成的抗DON酶标抗体IC50值最低,为75.3ng/mL,该方法重复性最好,此时合成该酶标抗体需要的抗DON单克隆抗体与HRP的质量投料比为1：20,抗DON酶标抗体克分子比为2.69,酶结合率为3.345%,标记率为0.6935。利用抗FB1酶标抗体建立了检测玉米中FB1的直接竞争ELISA,经棋盘滴定确定,该方法的最佳FB1-OVA全抗原的包被浓度为1μg/mL,FB1酶标抗体(CC-1-FB1McAb-HRP)的工作浓度为1：32000,IC50=2.97ng/mL,检测范围为0.56～15.6ng/mL,批内、批间变异系数均小于10%,回收率在83.8-93.2%,与FB2的交叉反应率为16%,与其他常见真菌毒素(DON, AFB1, OTA, ZEN,T-2,HT-2)未见交叉反应。利用抗DON酶标抗体建立了检测玉米中DON的直接竞争ELISA,经棋盘滴定确定,该方法的最佳DON-BSA全抗原的包被浓度为1μg/mL,DON酶标抗体(GA-2-DON McAb-HRP)的工作浓度为1：16000。IC50=77.267ng/mL,检测范围为16.61-359.36ng/mL,批内变异系数小于10%,批间变异系数为16.66%,回收率在90.28-97.7%,与常见真菌毒素(AFB1,OTA, ZEN,T-2,HT-2,FB1,FB2)未见交叉反应。以直接竞争ELISA为反应原理,聚偏氟乙烯膜为载体,建立了一种简便、快速、高特异性、可同时检测玉米中FB1和DON的膜免疫直接竞争分析法。样品前处理简单,整个过程只需一步加样,15min内能目测判定结果,该方法获得的FB1、DON的检测限分别为2.5ng/mL、50ng/mL,使用有效期不少于180天,具有稳定性好、结果准确易于判定、经济实用等优点,非常适合于大批量样品的现场快速检测。采用自建的直接竞争ELISA和膜基质免疫分析法分别检测了市场上随机购买的35份玉米样本,检测结果与市售ELISA试剂盒和HPLC结果进行比较,经统计学分析无显著性差异,相关性良好。
路力生, 陈慰峰[6]1994年在《LFA-1在胸腺细胞活化信号传导中的功能研究》文中提出在ConA和固相抗CD_3单抗刺激系统中,应用抗LFA-1/ICAM-1单抗,研究其在胸腺细胞活化中的功能作用,结果证明,培养初期加入可溶性抗LFA-1可完全阻断ConA活化胸腺细胞增殖,对固相抗CD3单抗诱导的胸腺细胞活化也表现出相同的抑制效应,但对ConA刺激24h后的胸腺细胞应答以及IL-1+IL-2诱导的胸腺细胞增殖无影响。在可溶性抗LFA-1单抗的存在下,ConA诱导胸腺细胞合成IL-2和IL-6的能力显著下降,IL-2R的表达降低。此外,当用固相抗LFA-1和固相抗CD3或用二抗交联LFA-1和CD3刺激胸腺细胞时,抗LFA-1则具有明显地促增殖应答效应,单纯固相抗LFA-1刺激或交联LFA-1均无诱导活化作用,研究结果表明,LFA-1是未成熟胸腺细胞活化的重要辅助分子之一,它可参与TCR/CD3途径介导的早期活化信号的传导,并为胸腺细胞表达IL-2R 和产生IL-2可能提供复合刺激信号。
王晓峰[7]2005年在《成骨生长肽抗体的制备及其对NIH3T3细胞促增殖作用机理》文中进行了进一步梳理目的:成骨生长肽(OGP)是从损伤后再生的骨髓培养基质中分离纯化所得的一种具有14个氨基酸的小分子多肽。OGP广泛存在于哺乳动物的血清中,进化上高度保守,因此具有很好的同源性。研究发现OGP及其C端5肽可以促进造骨和造血作用。对体外培养的MC3T3E1成骨细胞、NIH3T3成纤维细胞和成骨性Rosl7/2细胞等均有促增殖和分化作用。但目前,OGP的细胞作用机理还不明确。为此,本实验采用中科院生化所人工合成的sOGP,设计poly-OGP制备OGP抗体,观察sOGP对NIH3T3细胞的促增殖作用,并利用制备抗体的免疫分析法及其他技术探讨OGP及其C端5肽对NIH3T3细胞的增殖作用机理。 方法:实验第一部分 Merrifield固相合成法合成寡肽。用Boc系统进行OGP的合成。HPLC、质谱分析鉴定其分子的均一性和准确性。制备多聚分支肽(Poly-OGP)和KLH-OGP。利用Poly-OGP及KLH-OGP作为抗原免疫新西兰兔制备抗血清。以抗血清利用放射免疫法(RIA法)及ELISA法测定sOGP浓度。 实验第二部分 将NIH3T3细胞以细胞浓度为5×10~4/ml,接种入96孔培养板,使用10%NCS-1640培养液,其中含不同浓度的sOGP或其sOGP(10-14)。48小时后以MTT法观察细胞增殖情况。将细胞浓度为5×10~4/ml的细胞培养液中的sOGP或sOGP(10-14)的浓度调整到10~(-11)mol/l,48小时后以细胞计数法,细胞周期检测观察细胞增殖情况,以RT-PCR法及ELISA法观察Ⅰ型胶原的变化。 实验第三部分采用流式细胞FITC荧光染色法,观察在增殖浓度sOGP及sOGP(10-14)作用下的NIH3T3细胞膜表面OGP的变化。观察在OGP抗血清作用下,sOGP及sOGP(10-14)的促细胞增殖作用的变化。观察在百日咳毒素(PTX),一种Gi抑制剂的作用下,OGP及OGP(10-14)的促细胞增殖作用,细胞膜OGP免疫荧光染色及细胞周期的变化。 结果:合成OGP经HPLC鉴定分子高度均一,纯度为99.28%,经质谱分析sOGP分子量为1523.5,与理论分子量1523.75相符。Poly-OGP的分子量平均为40KD左右。Poly-OGP可免疫动物得到可以测定的抗血清。 MTT法,细胞周期法,细胞计数法可以观察不同浓度sOGP及sOGP(10-14)
梁德媚, 张艳芳, 曾于洋, 王政, 吴聪明[8]2019年在《沙门氏杆菌快速检测方法研究进展》文中研究说明作为一种重要的人畜共患病病原,沙门氏杆菌不仅会影响畜牧业的发展,还会给人类健康带来严重危害,因此对沙门氏杆菌的检测是非常必要的。传统的检测方法耗时费力,为了保障食品安全和人类健康,发展沙门氏杆菌的快速检测方法受到世界各国的日益关注。文章综述了分子生物学方法、免疫学方法、代谢技术检测法、生物传感器和仪器分析技术等几类常见快速检测方法的研究进展,为沙门氏杆菌快速检测技术的开发和应用提供参考。
参考文献：
[1]. 固相包被用二抗的研制[D]. 郭伟正. 中国原子能科学研究院. 2000
[2]. 乐果酶联免疫试剂盒的研制[D]. 李兴霞. 沈阳农业大学. 2006
[3]. 多菌灵酶联免疫分析技术研究[D]. 王国霞. 中国农业科学院. 2006
[4]. 三种真菌毒素蛋白质微阵列检测方法的初步研究以及抗四环素多克隆抗体的制备[D]. 万亮. 南昌大学. 2008
[5]. 玉米中伏马菌素B_1和脱氧雪腐镰刀菌烯醇免疫学快速筛选方法研究[D]. 康敏. 南昌大学. 2012
[6]. LFA-1在胸腺细胞活化信号传导中的功能研究[J]. 路力生, 陈慰峰. 实验生物学报. 1994
[7]. 成骨生长肽抗体的制备及其对NIH3T3细胞促增殖作用机理[D]. 王晓峰. 复旦大学. 2005
[8]. 沙门氏杆菌快速检测方法研究进展[J]. 梁德媚, 张艳芳, 曾于洋, 王政, 吴聪明. 黑龙江畜牧兽医. 2019
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