吕山花[1]2002年在《抗草甘膦转基因大豆PCR检测方法的建立与应用》文中进行了进一步梳理转基因作物及食品的检测是食品标识和法律实施所必需的。本研究以抗草甘膦转基因大豆为实验材料，进行检测方法研究。目的是为制定转基因大豆及豆粕的检测规程提供依据，为我国转基因产品管理制度的建立与实施提供可行的检测方法。 主要的研究结果如下： 1．建立了一套大豆种子、叶片检测抗草甘膦转外源基因CaMV35S启动子、NOS终止子和目的基因CP4-EPSPS的PCR检测方法，并通过Southern杂交进一步证实了PCR检测结果的可靠性。 2．根据大豆凝集素基因设计引物，做内置检测标准。成功的优化了一套快速、准确、灵敏、可靠的抗草甘膦转基因大豆PCR检测方法。适用于对进口的大豆及大豆粗加工产品豆粕的检测。 3．确定双重水和非转基因大豆种子混合稀释最低检测限分别为0.01％和0.05％。 4．利用建立的检测方法，对转基因情况未知的进口大豆种子和豆粕共6个样品进行检测，其中5个样品检测出具有CaMV35S启动子、NOS终止子、CP4-EPSPS基因成分，而在国内非转基因大豆中未检测出上述成分。 5．将建立的检测方法应用于抗草甘膦转基因大豆京引D-1×非转基因大豆豫豆12杂交F_2群体(共30株)检测，大田施药对草甘膦为抗性的植株，PCR检测为阳性，而敏感株，PCR检测为阴性，符合率为100％。 6．应用优化的检测方法对京引D-1×豫豆12F_5代群体进行检测，结果表明，CaMV35S启动子、NOS终止子和CP4-EPSPS基因叁种元件的PCR检测结果一致，PCR检测和大田施药检测符合率为93.0％。这进一步说明了检测方法的可靠性。表型鉴定结果表明，抗性基因与种脐颜色无连锁关系。
吕山花, 常汝镇, 陶波, 李向华, 栾凤侠[2]2003年在《抗草甘膦转基因大豆PCR检测方法的建立与应用》文中研究表明应用PCR检测方法 ,以大豆凝集素 (lectin)基因为内置标准 ,检测了抗草甘膦转基因大豆中的外源CaMV35S启动子、NOS终止子和CP4 EPSPS成分 ,并通过Southern杂交进一步证实了PCR检测结果的可靠性 ,建立了基于PCR的抗草甘膦转基因大豆检测方法 ,最低检测限度为 0 .0 5 %。用此方法检测转基因情况未知 ,分别来自欧盟、美国、阿根廷、未知国别的进口大豆及未知国别的进口豆粕 ,除从欧盟进口的大豆无CaMV35S启动子、NOS终止子、CP4 EPSPS基因成分外 ,其余样品均含有上述成分 ;而从国内非转基因大豆中未检出上述成分。用此方法检测抗草甘膦大豆京引D1×豫豆 12的F2 和F2∶5群体植株 ,PCR检测结果与大田施药 (草甘膦有效成分 1.0kg·ha-1)检测结果一致率分别达 10 0 %和 93.0 %。
张文志[3]2015年在《日常豆制品中抗草甘膦大豆转基因成分的Realtime-PCR检测方法的建立和应用》文中研究表明本论文以大豆及其加工产品为对象,建立了用于快速检测豆制品中转基因大豆成份——抗草甘膦基因EPSPS及其表达元件的Realtime-PCR检测法,并对市场上常见豆制品进行检测分析。该方法的建立,可为食品监管机构有效的管理转基因产品提供理论和实验依据和参考。聚乙烯吡咯烷酮(PVP)浓度对大豆基因组DNA提取的影响:对来自叁个地区的大豆样本进行了分析,并对其中看家基因Lectin基因进行PCR反应和凝胶电泳分析,结果显示,0.1%以上PVP能有效的提高大豆基因组DNA提取质量,凝胶电泳分析结果中能够明显看到目标基因所在位置,条带清晰。酱油中抗草甘膦转基因大豆成分检测方法的建立:建立了利用RT-PCR反应(SybGreen法)对酱油中提取出的基因组DNA进行检测的方法,通过对提取出的基因组DNA进行RT-PCR检测分析显示,在以转基因豆粕为原料的酱油所提取出的基因组DNA中能够检测到CaMv35s启动子和Nos终止子调控元件,而外源基因EPSPS基因降解较严重,熔解曲线分析表明,RTPCR对转基因的检测获得了很好的特异性。RT定量PCR相对于传统PCR,具有快速、高通量、高选择性、高灵敏度的优势,在转基因食品的检测领域具有很大的潜力。市场上常见豆制品中抗草甘膦转基因大豆成分的检测:以自农贸市场的散装豆制品和来自超市中的袋装豆制品共28种为检测对象,利用RTPCR反应对其中抗草甘膦转基因大豆成分进行了检测。结果发现,11种袋装豆干类产品中有2种检测到抗草甘膦转基因大豆CaMv35s启动子、Nos终止子和EPSPS基因,1种检测到抗草甘膦转基因大豆CaMv35s启动子和Nos终止子。17种散装豆制品中只有1种检测到CaMv35s启动子、Nos终止子和EPSPS基因。28种样品中,在标签中明确标注原料为非转基因大豆的产品都未检测出抗草甘膦转基因大豆成分,未标注是否含转基因大豆原料的产品中部分检测出4种含抗草甘膦转基因大豆成分。
王小花[4]2009年在《食品中抗草甘膦转基因大豆实时PCR检测方法的建立与应用》文中研究指明目的:运用PCR技术建立食品中抗草甘膦大豆转基因成分的定性筛选方法和定量检测方法。并通过研究改进大豆油中DNA的提取方法探索建立大豆油转基因成分的定性检测方法。方法:以转基因大豆标准品和苏州各超级市场出售的样品为材料,通过对大豆内源基因lectin、35S启动子基因和目的基因CP4-EPSPS设计引物,进行普通PCR反应,建立加工食品中大豆转基因成分的定性筛选方法;以CP4-EPSPS为靶基因建立了食品中抗草甘膦大豆转基因成分SYBR Green实时PCR定量检测系统,在灵敏度和回收率等方面与Taqman探针实时定量PCR进行比较验证其可行性;对转基因大豆油精炼加工过程的四道重要工艺进行采样,用四种不同的方法提取样品DNA,用Taqman探针PCR检测其中的lectin基因和35S启动子基因,筛选出最佳大豆油DNA提取方法。结果:1.建立的35S定性PCR筛选转基因食品的方法的检出低限为0.5ng,在20个含大豆成分的样品中筛选出2个样品含有转基因成分,其中一种样品被证实含有抗草甘膦大豆。2.建立的食品中抗草甘膦大豆转基因成分SYBR Green实时定量PCR方法检出限为5pg、平均回收率为106%、平均相对偏差为6%,与Taqman探针定量PCR相比灵敏度更高,回收率和相对偏差相似。3.建立的改良CTAB法可以提取的毛油、中和油和脱色油DNA,此基础上建立的转基因大豆油Taqman探针PCR方法可以扩增出这些样品中lectin基因和35S启动子的特异性片段,得出定性检测结果。结论:建立的食品中抗草甘膦大豆转基因成分SYBR Green实时定量PCR方法具有敏感、准确、特异等优点,可用于相关检测中。本实验建立的改良CTAB法提取DNA和Taqman探针PCR检测大豆油转基因成分的方法适合于毛油、中和油和脱色油等样品的检测,为转基因大豆油的监管提供了有效的技术支持。
朱琳峰, 彭焕, 黄文坤, 张东升, 孔令安[5]2015年在《抗草甘膦转基因大豆Cp4-epsps基因快速简便的LAMP检测方法》文中研究指明针对抗草甘膦转基因大豆的外源基因Cp4-epsps,建立了一种基于环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的抗草甘膦转基因大豆的检测体系,其扩增产物既可利用常规琼脂糖凝胶电泳检测,还可通过SYBR Green I染色进行快速检测。LAMP检测体系中dNTPs浓度为0.8 mmol/L、Mg2+浓度为3mmol/L、反应时间为45min时扩增效果最佳,其检测灵敏度为5μg/L,比常规PCR灵敏100倍。田间实际检测结果表明,LAMP检测结果和PCR检测结果完全一致,准确率为100%。本研究所建立的抗草甘膦转基因大豆LAMP检测方法具有简便快速、特异性强、灵敏度高等特征,是一种能够用于抗草甘膦转基因大豆检测、田间基因漂移监测和环境安全研究的有力工具。
胡汉桥, 李信申, 邢姗姗, 何红[6]2007年在《抗草甘膦转基因大豆PCR检测及问题探讨》文中认为转基因植物的检测具有重要的意义。用抗草甘膦转基因大豆中的外源CaMV35S启动子、CP4 EPSPS和巢式PCR引物,应用PCR方法,从中扩增出预期大小的DNA片段。将扩增产物回收后测序,经同源性分析扩增产物为CaMV35S启动子和CP4 EPSPS的一部分序列。与常规PCR相比,巢式PCR在检测转基因大豆中具有更高的特异性。讨论了PCR检测过程中假阴性和假阳性的原因。
张锐, 邢姗姗, 胡汉桥[7]2007年在《抗草甘膦转基因大豆PCR的检测》文中研究说明目的:建立快速、有效的鉴别转基因作物与非转基因作物及其产品的检测方法体系。方法:用抗草甘膦转基因大豆中的外源CaMV35S启动子和CP4-EPSPS基因引物,应用PCR方法,从中扩增出预期大小的DNA片段,将扩增产物回收后测序。结果:经同源性分析,扩增产物为CaMV35S启动子和CP4-EPSPS基因的一部分序列。结论:初步建立了转基因大豆的检测方法,同时讨论了PCR检测过程中假阴性和假阳性的原因。
朱琳峰[8]2014年在《应用LAMP检测北方根结线虫和转CP4-EPSPS基因抗草甘膦大豆》文中指出环介导等温扩增技术自2000年报道以来,吸引了不同领域研究者们的广泛关注。LAMP技术在等温条件下,通过四条引物特异性识别靶基因的六个区域,使得LAMP扩增的特异性、灵敏度非常高。反应不需要借助任何专业设备以及繁琐的程序,可视化检测手段的应用使得LAMP检测结果清晰明确,目前已经广泛应用于人畜病原物、食品安全和环境卫生的检测中。根结线虫是一类非常重要的植物病原线虫,广泛分布世界各地,寄主范围十分广泛,造成作物的大规模减产。其中南方根结线虫(M. incognita)、爪哇根结线虫(M. javanica)、花生根结线虫(M. arenaria)和北方根结线虫(M. hapla)是四种最重要的根结线虫,在我国分布最为广泛。北方根结线虫在我国是花生根结线虫病的主要病原物,每年造成严重的减产,建立一套快速准确的检测方法,对防治北方根结线虫病具有重要的意义。本研究以环介导等温扩增法对植物罹病组织中的北方根结线虫进行检测。其中,北方根结线虫LAMP特异性引物是根据北方根结线虫与其他根结线虫ITS差异进行设计。北方根结线虫LAMP检测技术的最低检测限达到1/200000头线虫,灵敏度是常规PCR的100倍,这使得该方法可以直接从植物组织中检测北方根结线虫。同时,北方根结线虫LAMP检测具有高度的特异性,可以将北方根结线虫与其他近缘种线虫区分出来。该检测精确、简便、低成本,LAMP反应产物滴加SYBR Green Ⅰ核酸染料后可以用肉眼直接观察判断,也可以用LFD试纸进行直观判断,适宜在田间应用。抗草甘膦转基因大豆是目前全球种植范围最广的转基因作物,有超过1000种品种正在种植。中国虽然没有批准转基因大豆的商业化种植,但是,作为全球最大的大豆进口国,转基因大豆不可避免的经常流入国内市场。而近年来随着新闻广泛宣传,公众越来越关心转基因食品的安全问题,建立一套可靠、严谨而又简便的检测技术势在必行。本研究将LAMP技术应用到抗草甘膦转基因大豆的检测中。针对转基因大豆的外源基因CP4-EPSPS设计了六条特异性引物。并对LAMP反应条件进行优化,优化结果如下：扩增时间45min,6mmol/L的dNTPs和3mmol/L的Mg2+,反应体系25μL。反应产物添加SBRY Green Ⅰ染色后可以直接肉眼观察。LAMP法检测抗草甘膦转基因大豆的灵敏度是常规PCR的100倍。与常规PCR相比,抗草甘膦大豆LAMP检测法更加快速、方便和精确。因此,该法可以作为抗草甘膦大豆检测的一个有力的工具并且可以直接应用于基因漂移的田间监测。
朱元招[9]2004年在《抗草甘膦大豆转基因PCR检测及其饲用安全研究》文中指出本论文研究了RR抗草甘膦转基因大豆、豆粕及其饲料产品中外源基因的PCR检测技术以及系统评价其饲喂动物的安全性。 建立大豆及其饲料产品中转基因成分的定性和定量PCR检测方法。以CTAB和GMO试剂盒两种方法提取基因组DNA。用常规定性PCR对外源基因盒结构中的不同基因进行筛选或特异性扩增，对产物进行回收和酶切鉴定，最低检测下限为0.1％；在巢式PCR方法中，对大豆模板DNA的检测下限可达到pg级水平；利用建立的双引物PCR技术同时检测内源和外源基因，检出来自美国、阿根廷的大豆及饲料为转基因阳性产品，取得良好效果。另外，建立了双链DNA SYBR Green Ⅰ结合染料实时荧光定量PCR技术，绘制lec和CaMV35s基因定量扩增标准曲线方程，R~2值分别达到0.9997和0.9992；对已知转基因含量的大豆标准品及大豆模拟样品进行定量，实测值与实际值相对偏差在5～11％范围之间。上述PCR方法适用于RR大豆或饲料中转基因成分的定性与定量检测。 通过断奶仔猪生长试验、生长猪消化试验和大鼠亚慢性毒性试验，评价RR抗草甘膦转基因豆粕的饲用价值和安全性。RR大豆(粕)的常规概略养分、氨基酸组成、微量元素、脂肪酸组成及胰蛋白酶抑制因子等抗营养因子含量在正常范围值内，RR豆粕对断奶仔猪的生产性能和血生理生化无明显影响。生长猪回肠末端安装T型瘘管试验显示，RR转基因豆粕粗蛋白质、氨基酸的回肠表观消化率及回肠真消化率与常规豆粕相近；外源cp4 epsps基因在生长猪肝脏、肌肉、脾脏和胸腺组织中未被检出，在食糜和粪便中的检出率均仅为6.7％。在80只Sprague-Dawley大鼠13wks的亚慢性安全性试验中，饲喂60％常规非转基因或RR转基因豆粕日粮的大鼠生长与采食无显着性差异(P＞0.05)；饲喂90％高含量RR豆粕的大鼠血液学、血清生化和尿液参数在生理值范围内；试验期内无大鼠死亡，大体剖检和组织病理学检验并未发现体组织有病理学变化特征；另外，在大鼠咬肌组织未发现有外源或内源DNA残留。常规与RR抗草甘膦转基因大豆(粕)营养组成具有等价性，对断奶仔猪和生氏猪有相同的营养生物学效价，对大鼠的饲用安全具有实质等同性。
黄亚东, 白卫滨, 孙建霞, 柳忠玉, 赵文[10]2006年在《抗草甘膦转基因大豆加工品的PCR检测研究》文中认为以进口抗草甘膦转基因豆粕、豆粉和中国脱脂大豆为材料,利用设计的特殊引物,建立了PCR技术定性检测抗草甘膦转基因大豆加工品的方法,成功检测出进口抗草甘膦转基因豆粕和豆粉的内源参照基因Lectin、CaMV35S/CTPofEPSPS边界序列和NOS终止子,国产脱脂大豆仅检出内源参照基因Lectin,确定了此PCR技术检测抗草甘膦转基因大豆的灵敏度为0.1%,稳定性良好。
参考文献：
[1]. 抗草甘膦转基因大豆PCR检测方法的建立与应用[D]. 吕山花. 东北农业大学. 2002
[2]. 抗草甘膦转基因大豆PCR检测方法的建立与应用[J]. 吕山花, 常汝镇, 陶波, 李向华, 栾凤侠. 中国农业科学. 2003
[3]. 日常豆制品中抗草甘膦大豆转基因成分的Realtime-PCR检测方法的建立和应用[D]. 张文志. 北京工业大学. 2015
[4]. 食品中抗草甘膦转基因大豆实时PCR检测方法的建立与应用[D]. 王小花. 苏州大学. 2009
[5]. 抗草甘膦转基因大豆Cp4-epsps基因快速简便的LAMP检测方法[J]. 朱琳峰, 彭焕, 黄文坤, 张东升, 孔令安. 植物保护. 2015
[6]. 抗草甘膦转基因大豆PCR检测及问题探讨[J]. 胡汉桥, 李信申, 邢姗姗, 何红. 生物技术通报. 2007
[7]. 抗草甘膦转基因大豆PCR的检测[J]. 张锐, 邢姗姗, 胡汉桥. 生物技术通讯. 2007
[8]. 应用LAMP检测北方根结线虫和转CP4-EPSPS基因抗草甘膦大豆[D]. 朱琳峰. 中国农业科学院. 2014
[9]. 抗草甘膦大豆转基因PCR检测及其饲用安全研究[D]. 朱元招. 中国农业大学. 2004
[10]. 抗草甘膦转基因大豆加工品的PCR检测研究[J]. 黄亚东, 白卫滨, 孙建霞, 柳忠玉, 赵文. 食品研究与开发. 2006
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