梁荣才[1]2003年在《超氧化物歧化酶明胶微球的制备与表面化学修饰研究》文中研究指明超氧化物歧化酶(SOD)是重要的氧自由基清除剂，可以用于治疗和预防与自由基损伤有关的一些疾病。目前，SOD在临床应用上主要以注射方式给药，而口服给药方式研究较少。本工作将SOD制成微球，以提高SOD稳定性和口服相对生物利用度，且在微球制备条件方面作了进一步研究。 以连苯叁酚自氧化法作为SOD的活力分析方法，并对该方法的精密度，回收率及线性范围进行了考察。结果表明，该方法可行。 从理化性质的角度，考察了不同高分子材料对SOD活力的影响，结果表明天然高分子材料更有助于保持SOD的活力。 本工作采用乳化凝聚法制备明胶微球。对制备条件先进行了单因素考察，然后利用正交设计进行了优选。最佳制备条件为：水相油相体积比为3：40，温度为60℃，时间为5min，转速为400rpm；所得微球载药量为23200u／g，包封率为88％，粒径分布集中在25～75um。 本工作考察了海藻酸钠的流变性，与明胶的相容性，以及与明胶的界面张力，并测定了壳聚糖的脱乙酰度和分子量。在此基础上制备了明胶海藻酸钠复合微粒及表面修饰的明胶微球，对它们的各种性质，包括含药量，稳定性，释放性及表面性质进行了研究。 在药效学方面，首先考察了SOD抗小鼠耳肿胀作用的量效关系，然后考察了SOD溶液和不同形式微球抗炎作用的时效关系。结果表明，几种微球均可显着延长SOD抗炎作用的时间。
李文章[2]2007年在《硅烷偶联剂修饰的Fe_3O_4磁性纳米材料制备及其作为基因载体的研究》文中进行了进一步梳理近年来，基因治疗在替代功能障碍基因和肿瘤治疗方面具有潜在的应用前景，因而备受关注。基因治疗的关键问题之一在于开发安全、高效的基因转染体系。在转基因载体的研究发展过程中，一个明显的趋势是采用非病毒基因载体，其目的在于降低人体正常细胞致病的风险。纳米技术的发展，为解决基因转移载体问题提供了新的思路。体积微小、具有超顺磁性的四氧化叁铁磁性纳米颗粒，有望成为理想的基因载体材料。本研究以2-吡咯烷酮和乙酰丙酮铁为原料，采用高温有机分解法合成超顺磁性纳米Fe_3O_4，利用γ—氨丙基三乙氧基硅烷修饰颗粒Fe_3O_4纳米颗粒，制备Fe_3O_4／氨基硅烷纳米复合颗粒。进一步进行Fe_3O_4／氨基硅烷纳米复合颗粒对DNA的结合和保护实验，并以绿色荧光蛋白EGFP-C2基因作为靶基因，Fe_3O_4／氨基硅烷作为基因载体，进行体外转染实验。主要结论如下：(1)高温有机分解法制备得到Fe_3O_4粒子具备粒径小、粒径分布范围窄(10±2 nm)、比饱和磁化强度和超顺磁性等优良性能。在制备过程中，反应气氛、反应时间、反应物比例对Fe_3O_4的性能都有不同程度的影响，其中反应时间影响最大。最佳反应条件：反应回流时间30min，2-吡咯烷酮和乙酰丙酮铁比例为10：1(ml／mmol)。(2)采用γ-氨丙基叁乙氧基硅烷为修饰剂，有效的改善磁性Fe_3O_4纳米粒子表面的疏水环境，成功制备出稳定性好、单分散的磁性Fe_3O_4／氨基硅烷复合纳米粒子。当氨基硅烷用量与四氧化叁铁纳米粒的摩尔比为4：1时，微球的稳定性、分散性和磁性效果达到最佳；红外结果显示，经表面改性后，氨基作为功能性基团成功的负载到磁性Fe_3O_4纳米粒子表面，增强了微球的生物兼容性，可进一步修饰酶、抗体、DNA等活性物质。(3)实验证明，经氨基硅烷修饰后的Fe_3O_4纳米颗粒能够有效的结合DNA，并能够保护DNA，使其不被DNase-Ⅰ核酸酶和血清所消化降解；当二者的质量比为1：2时，Fe_3O_4纳米颗粒微球结合DNA的效率最高，可达到90％以上；修饰后的Fe_3O_4纳米颗粒对细胞基本没有生物毒性，细胞的存活率为95％左右；转染报告基因EGFP-C2正常人肝细胞HL7702和人纤维肉瘤细胞HT1080，转染效率分别为63.2％和60％，高于脂质体的转染效率(30％)，是较为理想的基因转运载体。
蒋春晓[3]2013年在《单分散St/AA聚合物微球的制备及其自组装的研究》文中进行了进一步梳理光子晶体作为一种新型的材料始于20世纪80年代末期。光子晶体主要是指具有光子带隙特征的周期性排列的电介质结构或者光子带隙(PBG)结构。这里的光子带隙主要是指这种有序周期性的结构中不能通过某一频率范围内的波。结构决定性质,性质决定应用,因此光子晶体也具有较为广泛的应用。例如发光二极管、光子晶体光纤以及激光发射器等。因此,关于光子晶体的制备方法也被研究的越来越多,主要包括物理方法和化学方法。物理方法有精密机械加工法和逐层加工法；化学方法有自组装有序法和OPAL方法。在这几种方法中,由于自组装法比较简单易行,因此被广为研究。本论文也是围绕如何用自组装法制备高质量的胶体晶体而展开了以下工作。第一部分：制备单分散的聚苯乙烯/丙烯酸(St/AA)聚合物纳米微球。考虑到无皂乳液制备的产品较干净且单分散性和稳定性也较好,因此本实验以苯乙烯为主单体,丙烯酸为功能性单体,利用无皂乳液聚合法制备了St/AA聚合物纳米微球,并分别探讨单体苯乙烯和丙烯酸的比例、引发剂、温度对聚合物微球粒径的影响。另外还通过实验室特有的JS94系列微电泳仪来探究聚合物微球表面电性质以及聚合物微球的表面电位随pH值的变化趋势。第二部分：St/AA聚合物微球的自组装。分别采用玻片滴加法、拉膜法以及云母片滴膜法将无皂乳液制备的聚合物微球进行自组装。其中玻片滴加法通过测定透射光率分别讨论了浓度、温度、粒径对自组装效果的影响,结果显示：随着粒径的逐渐增大,透射光率的衰减程度最大位置逐渐发生红移,当固含量为0.6%、温度为50-70。C时组装效果最佳。拉膜法讨论了分散液的厚度以及制样力度对组装结果的影响,结果表明：当滑过样品次数不同时,可以制得不同层数的膜结构,而改变制样的力度和速度时会得到不同结构的自组装图。而云母片滴膜法主要是经过理论计算得到了最佳稀释浓度。第叁部分：尝试构筑金属纳米材料的二次结构。以拉膜法得到的有序结构图为基底,构筑新颖的金属二次结构。其中以银为金属材料,分别采用原位化学还原金属前驱体法以及先将金属离子负载在基底上的后还原法制备金属纳米颗粒,尝试在聚合物有序的基底上构筑新颖的金属纳米材料二次结构。本论文通过研制单分散St/AA聚合物微球,控制聚合物微球的自组装条件来制备高度有序排列结构,并探索如何在此有序结构上构筑新颖的金属纳米材料二次结构,这对制备纳米材料的特殊结构具有创新意义。
施丽丽[4]2013年在《甘草酸修饰羧甲基壳聚糖纳米粒提高抗肿瘤药物对肝细胞癌的靶向性和疗效》文中认为肝癌、肝炎等肝脏疾病是严重威胁人类健康的常见病和多发病,常规剂型的药物经静脉注射、口服或局部注射后,药物非特异性分布于全身,毒副作用较大。靶向给药系统通过载体可将药物选择性递送至肝脏的病变部位,可降低对正常组织和全身的毒副作用,减少给药剂量和给药次数,提高药物功效。其中两亲性聚合物纳米粒作为给药载体,可提高难溶性药物的溶解性和稳定性、延长血液循环时间、改善药物体内分布,并具有良好的缓控释效果。聚合物纳米粒表面经特异性配体(GL)修饰,可实现药物对肝癌细胞的主动靶向。据此,设计并研究新型肝靶向性聚合物纳米粒-甘草酸(GL)修饰羧甲基壳聚糖纳米粒(CMCNP-GL),以紫杉醇(PTX)为抗肿瘤模型药物制备载药纳米粒,研究PTX/CMCNP-GL的理化性质、载药与释药、体外细胞摄取与体内组织分布、体外细胞增殖抑制与体内抑瘤率,考察不同GL取代度对PTX/CMCNP-GL体内外肝癌细胞靶向性及抗肿瘤效果的影响,并通过体内外试验初步评价CMCNP-GL载体的安全性。1CMCNP-GL的制备与表征以O-羧甲基壳聚糖(O-CMC)为亲水主链,甲基丙烯酸甲酯(MMA)为疏水单体,在APS引发剂作用下,通过自由基聚合法制得具有核壳结构的羧甲基壳聚糖纳米粒(CMCNP)。高碘酸钠氧化甘草酸制备GL醛,经氨醛缩合与硼氢化钠还原反应将GL醛接枝至CMCNP表面游离氨基,制得CMCNP-GL。改变投料比合成不同GL取代度的CMCNP-GL1、MCNP-GL2和CMCNP-GL4、 FTIR、1HNMR、DSC表征CMCNP-GL的结构,TEM观察纳米粒形态,分别测定GL取代度、接触角、粒径和Zeta电势,并研究CMCNP-GL在不同条件下的稳定性。结果表明CMCNP-GL1、CMCNP-GL2和CMCNP-GL4中的GL取代度分别为2.4%、6.9%和9.6%;CMCNP-GL为大小均一的球形粒子,平均水合动力学粒径为100～250nm,生理条件下荷恒定负电(--30mV)。随GL取代度的增大,粒径先增加后减小,Zeta电势无明显改变,纳米粒表面亲水性逐渐增强。CMCNP-GL具有良好的冻干和贮存稳定性,不同的pH、离子强度及生理条件下理化性质均保持稳定。2载紫杉醇CMCNP-GL的制备、表征及体外释药特性以PTX为模型药物,研究CMCNP-GL作为难溶性抗肿瘤药物载体的特点。超声法制备不同GL取代度的PTX/CMCNP-GL,测定其平均水合动力学粒径为110～205nm,生理条件下Zeta电势约为-30mV,与相对应的空白纳米粒粒径与Zeta电势基本相同。不同GL取代度的CMCNP-GL载药量与包封率均随GL取代度的增加而增大,对PTX的包封率均高于69.0%,最高可达81.5%；载药量均高于13.0%,最高可达15.1%。PTX/CMCNP-GL的体外释放表现为先突释后缓释的释放行为,PTX释放速率随GL取代度的增加而减慢,均显着低于PTX/CMCNP,表明GL表面修饰可增强CMCNP对PTX的缓释能力。不同GL取代度的PTX/CMCNP-GL在各时间点的累积释放百分率无显着性差异。3载紫杉醇CMCNP-GL的体内外靶向性制备罗丹明B (RhB)荧光标记纳米粒RhB-CMCNP和不同GL取代度的RhB-CMCNP-GL,以肝癌细胞SMMC-7721与正常肝细胞L02为细胞模型,研究纳米粒的细胞黏附、细胞摄取、摄取机制与亚细胞定位。CMCNP-GL在二种细胞的黏附率和摄取率均显着高于CMCNP,不同GL取代度的CMCNP-GL在肝癌细胞的黏附率和摄取率均显着高于正常肝细胞,不同GL取代度的CMCNP-GL之间无显着性差异。游离GL分子可与肝细胞表面GL特异性结合位点相互作用,竞争性抑制CMCNP-GL的摄取,对CMCNP的摄取无影响,该抑制作用在肝癌细胞中比正常细胞显着。CMCNP-GL2主要经小窝蛋白及网格蛋白介导的内吞途径入胞,摄取过程具有能量依赖性,且与细胞的骨架重构有关。GL修饰对CMCNP的内吞途径无显着影响,入胞后主要聚集在细胞核周围的胞质中。以H-22肝癌荷瘤小鼠为模型,分别考察空白纳米粒与载药纳米粒经静脉注射后的体内分布,评价纳米粒的靶向性。结果表明PTX/CMCNP-GL2可显着减缓PTX在血液中的清除速率,改善PTX的体内分布,聚集于肝脏和肿瘤,显着降低PTX的心脏和肾脏毒性；PTX/CMCNP-GL2对肝癌组织的靶向性显着高于未修饰的PTX/CMCNP和PTX注射液。空白载体与载药纳米粒的体内分布趋势一致。4载紫杉醇CMCNP-GL的体内外抗肿瘤功效及安全性以SMMC-7721细胞为肝癌细胞模型研究PTX/CMCNP抑制肿瘤细胞增殖或诱导细胞凋亡的能力；以H-22肝癌荷瘤小鼠为模型,考察载药纳米粒的体内抗肿瘤功效,比较不同GL取代度对载药CMCNP体内外作用功效的影响。结果表明PTX/CMCNP-GL可显着抑制肝癌细胞SMMC-7721的体外增殖,72h的IC50为2.7～3.2mg·ML-1,显着低于PTX注射液(13.5mg·mL-1)和PTX/CMCNP (8.1mg-mL-1).不同GL取代度的PTX/CMCNP-GL之间无显着性差异。PTX可诱导一定程度的肝癌细胞凋亡,24h的凋亡率均为1020%,CMCNP纳米载体及其GL表面修饰对PTX引起细胞凋亡的机制和效果无显着影响。静脉注射PTX/CMCNP-GL可有效抑制H-22荷瘤小鼠的肿瘤生长,延长肿瘤倍增时间。PTX/CMCNP-GL的抑瘤效果最佳,平均抑瘤率为87.4%,分别约为PTX注射液和PTX/CMCNP的2.5和1.6倍,表明PTX经CMCNP包载后,抗肿瘤效果显着增强,不同GL取代度PTX/CMCNP-GL的抗肿瘤效果无显着差异。考察CMCNP-GL空白载体的细胞毒性、血液相容性、急性毒性和亚急性毒性,从细胞、组织和动物整体水平初步评价CMCNP-GL的安全性。FDA/PI双染色、LDH、中性红、蛋白质含量测定试验结果表明正常肝细胞L02和肝癌细胞SMMC-7721与不同GL取代度CMCNP-GL (5mg·mL-1)短时间(6h或24h)作用后,胞外LDH释放量、胞内中性红摄入量、蛋白质含量均无显着变化,细胞活力无显着影响；MTT试验结果表明二种细胞与CMCNP-GL (5mg·mL-1)较长时程(72h)共培养后,细胞增殖率无显着影响,CMCNP-GL细胞毒性低。CMCNP-GL溶血率低于5%,血浆复钙时间较长,动态凝血率低于硅化玻璃,具有一定的抗凝血效果,血液相容性良好。CMCNP-GL小鼠尾静脉给药最大耐受剂量为1800mg·kg-1;亚急性毒性试验中连续15天静脉注射给予CMCNP-GL2(1800mgkg-1),小鼠体重增长正常,血液学指标和肝功能指标ALT/AST/ALP正常,主要器官重量正常,组织切片中未见炎症、坏死、水肿等病理现象,表明CMCNP-GL2静脉注射安全性好,不引起肝损伤和全身毒性。
伍晖[5]2009年在《电纺丝纳米纤维的制备、组装与性能》文中研究说明本论文以电纺丝为平台,制备了多种功能无机、金属、高分子材料的一维纳米结构,研究了纳米结构的定向组装和物理性质,并探索了这些纳米结构在传感、微电子器件、仿生表面等方面的应用,取得了一些有意义的结果：陶瓷纳米纤维将电纺丝技术与溶胶-凝胶工艺结合,制备得到多种功能氧化物陶瓷纳米纤维。重点研究了电纺丝ZnO纳米纤维的光学、电学性能,制备成功单根ZnO纳米纤维沟道场效应晶体管(FET)器件和纳米纤维p-n异质结二极管器件。研究了电纺丝TiO2纳米纤维的力学性能。发现TiO2纳米纤维在室温下表现出异乎寻常的柔韧性。在电镜中对单根纳米纤维原位操纵弯曲试验,发现多晶TiO2纳米纤维表现出超弹性。针对这种特殊的力学性能,我们提出了应力诱导相变理论,并用多种手段证实我们的理论。将电纺丝技术的外延进一步扩大,首次获得了Ⅲ族氮化物纳米纤维。电纺丝合成的GaN纳米纤维能够方便的形成取向阵列,在此基础上我们制备了GaN纳米纤维沟道FET器件。GaN纳米纤维表现出很好的光敏特性。金属纳米纤维基于电纺丝,创新性的获得了多种金属一维纳米结构。获得了具有高导电率的Ag基金属纳米纤维和金属Fe、Co、Ni单质纳米纤维。研究了磁性金属纳米纤维及其阵列的室温和低温磁学性能。利用电纺丝纤维为模板成功得到尺寸均一,具有极高长径比的Cu、Ni等金属纳米管。使用去合金化方法对Cu-Ni合金纳米管进行处理得到表面具有纳米多孔结构的多孔Cu纳米管。多孔Cu纳米管具有非常高的SERS活性,有望发展成为一种新型高灵敏度SERS基底。高分子纳米纤维通过对电纺丝装置的设计和改进,获得了多种仿生结构的纳米纤维阵列,成功的模拟了荷叶表面、稻叶表面、羽毛表面和水黾的微观结构和表面特性,实现了多种特殊浸润性。
崔黎明[6]2010年在《新型壳聚糖衍生物多功能给药载体的生物相容性》文中提出壳聚糖是自然界唯一的碱性多糖,生物相容且生物可降解；结构中含大量游离氨基和羟基,可经化学改性和功能修饰改善其理化性质和生物学性质。壳聚糖及其衍生物已被广泛用于新型给药载体。但外源材料与机体接触可能引起毒性、炎症或免疫反应,为保证作为给药载体的安全使用需评价其生物相容性。制备可作为多功能给药载体的亚油酸/聚苹果酸双接枝壳聚糖(LMC)、壳聚糖季胺盐(TMC)和PEG化壳聚糖季胺盐(PEG-TMC),研究其生物相容性。1LMC纳米粒的生物相容性研究LMC纳米粒的润湿性、血液相容性、细胞毒性、基因毒性、静脉注射和腹腔注射急性毒性,从整体动物、组织、细胞和分子层面评价LMC纳米粒的安全性；气相色谱-质谱法(GC-MS)测定LMC纳米粒中的有机溶剂残留量,以保证LMC纳米粒生物相容性的准确评价。作为两亲性壳聚糖衍生物,LMC在水中可自组装形成纳米粒。LMC纳米粒接触角(47.7±4.4°)较壳聚糖(66.8±2.7°)低,表明接枝长链聚苹果酸(PMLA)至壳聚糖骨架可提高LMC纳米粒的亲水性。LMC纳米粒不溶血,且动态凝血和血浆复钙试验结果表明LMC纳米粒具有一定的抗凝血作用,血液相容性好。二乙酸荧光素/碘化丙啶(FDA/PI)双染色、乳酸脱氢酶(LDH)、中性红、蛋白质含量和MTT试验结果表明中国仓鼠卵巢细胞(CHO)和人肝癌细胞(SMMC-7721)与LMC纳米粒(0.05-2 mg/mL)接触后,胞外LDH释放量、胞内中性红摄入量、蛋白质含量、细胞增殖率和细胞活力均无显着变化,LMC纳米粒细胞毒性低。丙二醛和还原型/氧化型谷胱甘肽含量测定结果表明LMC纳米粒可引起细胞轻微氧化应激损伤。细胞凋亡、彗星试验和小鼠骨髓微核试验结果表明LMC纳米粒不引起CHO和SMMC-7721细胞DNA损伤、早期凋亡,不引起小鼠原代肝脏、肾脏、脾脏细胞和淋巴细胞DNA链断裂及骨髓嗜多染红细胞微核率上升,基因毒性低。小鼠静脉注射或腹腔注射LMC纳米粒单次给药最大耐受剂量分别为500 mg/kg和1250 mg/kgo LMC纳米粒和壳聚糖分别经溶菌酶降解84 d,LMC纳米粒降解速率较壳聚糖低,降解产物无细胞毒性。LMC纳米粒中苯、氯仿和甲苯的残留量分别为0.284、0.069和0.091 ppm,符合限量规定。2壳聚糖季胺盐和PEG化壳聚糖季胺盐的生物相容性季胺化修饰壳聚糖制备不同季胺化度的二种壳聚糖季胺盐(TMCl、TMC2),分子量分别为2 kDa和5 kDa的PEG修饰TMC2制备PEG化壳聚糖季胺盐(PEG2K-TMC、PEG5K-TMC),表征理化性质；研究季胺化度和PEG分子量对壳聚糖季胺盐的血液相容性、细胞毒性、小肠组织相容性、蛋白质吸附作用、抗氧化作用和体外降解的影响。元素分析结果表明TMC1和TMC2的氨基取代度分别为23.7%和49.5%。X射线衍射(XRD)和差示扫描量热(DSC)分析结果表明季胺化和PEG修饰改变壳聚糖的晶体结构和热力学性质。TMC和PEG-TMC的接触角均小于壳聚糖,表明季胺化和PEG修饰可提高壳聚糖亲水性。TMC1和TMC2 (5 mg/mL)的溶血率高于5%,可引起红细胞凝聚；PEG2K-TMC和PEG5K-TMC的溶血率低于5%,抗凝血作用优于TMC2,血液相容性好。MTT试验结果表明TMC和PEG-TMC对CHO和SMMC-7721细胞毒性具浓度依赖性,PEG修饰可显着降低TMC的细胞毒性。大鼠小肠上皮细胞LDH释放量随壳聚糖季胺化度提高而增加,PEG修饰可显着降低LDH释放,PEG5K-TMC不引起小肠上皮细胞的生化损伤。TMC对牛血清白蛋白(BSA)的吸附随季胺化度提高而增大,PEG修饰可显着降低TMC对BSA的吸附,且PEG-TMC对BSA的吸附随PEG分子量增加而减小。TMC和PEG-TMC的抗氧化作用具浓度依赖性；羟基自由基清除作用随壳聚糖季胺化度和PEG分子量增加而增强；PEG修饰可显着降低TMC的还原力和大鼠肝匀浆脂质过氧化抑制作用。TMC和PEG-TMC的溶菌酶降解产物均无细胞毒性。
王海滨[7]2008年在《高糖诱导内皮祖细胞凋亡的内质网应激途径及其在糖尿病冠脉病变中的作用》文中认为研究背景内皮祖细胞是1997年发现的在成人体内能分化为内皮细胞的前体细胞,存在于骨髓及外周血中。内皮祖细胞主要参与内皮细胞修复即血管的再内皮化以及参与血管新生,由此近年来内皮祖细胞在血管病变中的作用越来越受到重视。糖尿病血管病变的重要发病机制是内皮细胞功能受损及凋亡。血管内皮层完整性遭到破坏,炎性细胞浸润至内皮下层促进动脉粥样硬化的发生发展,因此内皮功能受损被视为糖尿病血管病变的始动因素。正常状态下,受损的内皮由周边内皮及循环中的内皮祖细胞分化为内皮来修复,保持内皮层的完整性,一旦内皮祖细胞受损,内皮损害和修复之间的平衡被打破,内皮层的完整性遭到破坏,由此发生动脉粥样病变,因此内皮祖细胞在糖尿病血管病变中具有重要作用。已有研究证实糖尿病时循环内皮祖细胞数量和功能均受损害,而循环内皮祖细胞来源于骨髓,由此我们推测糖尿病时骨髓内皮祖细胞可能也受损。我们已知内质网应激介导的β细胞凋亡是糖尿病发病的重要机制,由此我们推测内质网应激可能介导内皮祖细胞的凋亡参与糖尿病血管病变的发病。迄今尚无观察糖尿病对骨髓内皮祖细胞的凋亡有无影响及其机制的研究,本研究的目的旨在:目的1.建立糖尿病大鼠模型。2.研究大鼠骨髓内皮祖细胞体外分离、诱导、培养及鉴定的方法。3.检测糖尿病大鼠和正常大鼠骨髓内皮祖细胞凋亡率,明确糖尿病时骨髓内皮祖细胞是否受损。4.检测糖尿病大鼠和正常大鼠骨髓内皮祖细胞内质网应激标志物GRP78及内质网应激特异性凋亡因子—caspase-12活性,以了解内质网应激是否参与介导糖尿病时骨髓内皮祖细胞的凋亡。方法1.糖尿病(diabetes mellitus,DM)大鼠模型的制备雄性Wistar大鼠27只,随机分为2组:对照组12只,DM组15只。标准大鼠饲料喂养1周后,禁食12h,DM组大鼠给以腹腔内注射链脲佐菌素(STZ)65mg/kg,对照组大鼠注射等量柠檬酸钠/柠檬酸缓冲液。糖尿病大鼠成模标准为:连续2次空腹血糖＞16.7mmol/L。未达成模标准者剔除。DM组大鼠血糖升高后,饲以高脂高糖饮食,对照组则给予标准饮食喂养。2.大鼠骨髓源内皮祖细胞的培养、鉴定。2.1大鼠骨髓内皮祖细胞的培养大鼠拉颈处死后无菌状态下分离股骨胫骨,将骨髓细胞以无菌PBS液完全冲洗至离心管,应用大鼠淋巴细胞分离液(LTS-1083)以密度梯度离心法(2 000rpm,30 min)分离单个核细胞。洗涤后以含20%胎牛血清的M199培养液重悬,接种于培养瓶中,37℃、5%CO_2条件下培养。细胞培养24 h(早期贴壁)后收集未贴壁细胞离心后以选择性培养基(M199培养基加入20%胎牛血清,100μg/mL链霉素,100U/ml青霉素,40 ng/mL大鼠血管内皮生长因子(VEGF,Peprotech,USA),2 ng/mL人成纤维细胞生长因子(FGF,Peprotech,USA),10 ng/mL人表皮细胞生长因子(EGF,Peprotech,USA)以及10U/mL肝素)重悬计数,1×10~6/mL转入包被0.1%明胶(Sigma,USA)的24孔板和培养瓶中二次贴壁,4天后换液,培养至第7天鉴定。2.2大鼠骨髓EPCs的鉴定细胞在含DiI-ac-LDL(2.4μg/mL)的培养液中37℃避光孵育1h,然后以2%的多聚甲醛固定10min,PBS液漂洗后再加FITC-UEA-1(10μg/mL)避光孵育1h。PBS液漂洗后在荧光显微镜下观察,显示红色荧光的为ac-LDL阳性细胞,显示绿色荧光的为UEA-1阳性细胞,显示双荧光阳性(黄色)的细胞被认为是EPCs。3.流式细胞仪检测大鼠骨髓源内皮祖细胞凋亡率ANEXIN V/PI凋亡检测试剂盒流式细胞仪检测凋亡。4.RT-PCR检测GRP78、CASPASE-12基因表达结果1.大鼠基本情况及血糖检测实验过程中,对照组大鼠精神状态良好,体重增加明显,反应敏捷,毛色白而光泽。DM组大鼠出现多食、多饮、多尿和消瘦等症状,体重增加迟缓,精神萎靡,皮毛无光泽,部分出现烂尾、白内障等。最终共23只完成实验,其中对照组12只,DM组11只。注射STZ之前,对照组与DM组血糖无明显差异(P＞0.05)。注射STZ 1周后,DM组血糖明显高于对照组(P＜0.01),并持续至实验末。2.大鼠骨髓源内皮祖细胞培养、鉴定早期贴壁细胞呈毛发样生长,多为骨髓基质细胞。二次贴壁的细胞大多在3天左右伸展成梭形或纺锤形。7～10天增殖速度加快可见内皮细胞特异性条索状结构。2周左右细胞可达80～90%融合,大部分细胞呈多角形。80%以上细胞可同时吸收DiI-ac-LDL结合FITC-UEA-1即鉴定为内皮祖细胞。3.流式细胞仪检测大鼠骨髓源内皮祖细胞凋亡率DM大鼠骨髓源内皮祖细胞凋亡率明显高于对照组(20.3±4.64%vs.11.2±2.85,P＜0.05)。4.RT-PCR检测GRP78、CASPASE-12 mRNA表达1)GRP78mRNA表达:DM组内皮祖细胞GRP78mRNA表达均较对照组明显增高(0.64±0.07%vs.0.43±0.05%,P＜0.05)。2)CASPASE-12 mRNA表达:DM组内皮祖细胞CASPASE-12 mRNA表达均较对照组明显增高(0.56±0.09%vs.0.36±0.04,P＜0.05)。结论1)糖尿病大鼠骨髓源内皮祖细胞凋亡率明显增加。2)DM大鼠骨髓源内皮祖细胞GRP78及CASPASE-12 mRNA表达增加,提示内质网应激参与介导糖尿病大鼠骨髓源内皮祖细胞凋亡,可能在糖尿病血管病变的发生发展中起重要作用。研究背景内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)是内质网功能紊乱时出现错误折迭与未折迭蛋白在腔内聚集以及Ca~(2+)平衡紊乱的状态,对决定应激细胞的结局如抵抗、适应、损伤或凋亡有重要作用。一定程度的内质网应激因能激活保护机制例如分子伴侣表达而有细胞保护作用,应激过强时,保护机制不能与损伤抗衡,内质网应激可通过caspase-12独立地介导细胞凋亡。内质网应激使caspase-12活化,继而激活下游caspase,导致细胞凋亡,内质网应激反应性细胞凋亡是不同于死亡受体介导或经线粒体介导的一种新的细胞凋亡途径,caspase-12作为凋亡起始因子发挥了关键作用。有研究已证实内质网应激介导的凋亡参与胰岛β细胞的凋亡,是糖尿病发病的重要机制。内皮祖细胞在糖尿病血管病变中有重要作用,研究表明糖尿病时循环内皮祖细胞数量及功能均受损,我们在体内实验也发现其在糖尿病大鼠骨髓中凋亡率明显增加,同时内皮祖细胞内质网应激激活,结合内皮祖细胞具有内皮细胞修复以及参与血管新生的作用,我们推测内皮祖细胞凋亡增加很可能在以动脉粥样硬化为重要特征的糖尿病血管病变中发挥重要作用。那么内质网应激介导的凋亡是否参与了高糖诱导的大鼠骨髓源内皮祖细胞的凋亡呢?本工作拟通过高糖刺激体外培养的大鼠骨髓源内皮祖细胞,观察高糖对其凋亡的影响及内质网应激特异凋亡因子caspase-12是否参与介导其凋亡,以期为糖尿病血管病变的预防和治疗提供新的机制和靶点。目的1.观察高糖培养对大鼠骨髓EPCs凋亡的影响。2.观察高糖培养是否激活大鼠骨髓EPCs内质网应激反应。3.观察CASPASE-12介导的内质网应激途径是否在高糖诱导的大鼠骨髓EPCs凋亡过程中发挥重要作用。方法1.大鼠骨髓内皮祖细胞(Bone Marrow-derived Endothelial Progenitor Cells,BM-EPCs)的培养、鉴定1.1骨髓EPCs的分离、培养6周龄雄性体重250—300克Wistar大鼠购自山东大学动物实验中心,拉颈处死后无菌条件下取出四肢长骨,将骨髓细胞以无菌PBS液完全冲洗至离心管用大鼠淋巴细胞分离液(LTS-1083)以密度梯度离心法(2 000 rpm,30 min)分离单个核细胞。洗涤后以含20%胎牛血清的M199培养液重悬,接种于培养瓶中,37℃、5%CO_2条件下培养。细胞培养24 h(早期贴壁)后收集未贴壁细胞离心后以选择性培养基(M199培养基加入20%胎牛血清,100μg/mL链霉素,100U/ml青霉素,40 ng/mL大鼠血管内皮生长因子(VEGF,Peprotech,USA),2 ng/mL人成纤维细胞生长因子(FGF,Peprotech,USA),10 ng/mL人表皮细胞生长因子(EGF,Peprotech,USA)以及10U/mL肝素)重悬计数,1×10~6/mL转入包被0.1%明胶(Sigma,USA)的24孔板和培养瓶中二次贴壁,4天后换液,培养至第7天鉴定。1.2 EPCs的鉴定细胞在含DiI-ac-LDL(2.4μg/mL)的培养液中37℃避光孵育1h,然后以2%的多聚甲醛固定10min,PBS液漂洗后再加FITC-UEA-1(10μg/mL)避光孵育1h。PBS液漂洗后在荧光显微镜下观察,显示红色荧光的为ac-LDL阳性细胞,显示绿色荧光的为UEA-1阳性细胞,显示双荧光阳性(黄色)的细胞被认为是EPCs。2.流式细胞仪测定不同浓度糖培养BM-EPCs凋亡率骨髓EPCs给予不同浓度高糖(5mmol/L、12.5mmol/L及25mmol/L)刺激24h,流式细胞仪检测细胞凋亡率3.Western-blot测定不同浓度糖培养骨髓EPCs GRP78、CASPASE-12、CASPASE-3蛋白表达改变4.流式细胞仪测定给予或未给予caspase-12抑制剂(Z-ATAD-FMK 5uM)预处理后高糖(25mmol/L)培养骨髓EPCs凋亡率5.Western-blot测定给予或未给予caspase-12抑制剂(Z-ATAD-FMK 5uM)预处理后高糖(25mmol/L)培养骨髓EPCs CSAPASE-12、CASPASE-3蛋白表达改变结果1.大鼠骨髓内皮祖细胞的培养、鉴定早期贴壁细胞呈毛发样生长,多为骨髓基质细胞。二次贴壁的细胞大多在3天左右伸展成梭形或纺锤形。7～10天增殖速度加快可见内皮细胞特异性条索状结构。2周左右细胞可达80～90%融合,大部分细胞呈多角形,可呈铺路石样排列。80%以上细胞可同时吸收DiI-ac-LDL结合FITC-UEA-1即鉴定为内皮祖细胞。2.高糖对骨髓EPCs凋亡的影响不同浓度糖(5mmol/L、12.5mmol/L及25mmol/L)孵育EPCs 24h,结果显示高糖呈浓度依赖性诱导EPCs凋亡(7.34±0.44%,11.59±1.22%,36.82±2.16%),与正常对照组(6.18±0.33%)比较差异均有统计学意义(P＜0.05),其中以糖浓度为25mmol/L时凋亡率最高。高渗对照25mmol/L甘露醇组凋亡率与对照组比较无显着性差异(5.95±0.81%vs.6.18±0.33%,P＞0.05)。3.高糖激活骨髓EPCs内质网应激不同浓度糖(5mmol/L、12.5mmol/L及25mmol/L)孵育EPCs 24h,westernblot法测定GRP78表达,结果显示高糖激活内质网应激特异蛋白GRP78表达,并呈浓度依赖性(127.33±9.71,152.33±7.09,183.33±4.51),与正常对照组(39±6.56)比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。4.高糖对CASPASE-12和CASPASE-3蛋白表达的影响不同浓度(5mmol/L、12.5mmol/L及25mmol/L)孵育EPCs 24h,western blot法测定CASPASE-12和CASPASE-3蛋白水平表达,结果显示高糖激活CASPASE-12和CASPASE-3,并呈浓度依赖性(cleaved-CASPASE-12:34.67±9.07,71.33±4.16,125.33±11.68;cleaved-CASPASE-3:64.67±7.37,131.67±9.02,165.33±5.69),与正常对照组比较差异有统计学意义(cleaved-CASPASE-12;cleaved-CASPASE-3均无表达,P＜0.01)。5.CASPASE-12抑制剂(Z-ATAD-FMK)对高糖诱导的骨髓EPCs凋亡的影响25mmol/L高糖培养组予5uM Z-ATAD-FMK预处理后,与未预处理组比较高糖诱导的凋亡率明显下降(17.91±0.94%vs.36.82±2.16%,P＜0.05),而对照组应用Z-ATAD-FMK预处理与未预处理组凋亡率无明显差异(5.62±0.92%vs.6.18±0.33%,P＞0.05);6.CASPASE-12抑制剂(Z-ATAD-FMK)对高糖诱导的骨髓EPCs CASPASE-12和CASPASE-3蛋白表达的影响与未加抑制剂预处理组比较高糖加预处理组CASPASE-12和CASPASE-3活性均被明显抑制(cleaved-CASPASE-12:0 vs.58±7.21,P＜0.01;cleaved-CASPASE-3:155±10.58 vs.185.33±12.01,P＜0.05)。对照组预处理组与未预处理组cleaved-CASPASE-12、cleaved-CASPASE-3均无表达)。结论1)高糖培养可以浓度依赖性诱导大鼠骨髓EPCs凋亡。2)高糖可以激活大鼠骨髓EPCs内质网应激。3)CASPASE-12介导的内质网应激途径可能在高糖诱导的大鼠骨髓EPCs凋亡过程中发挥重要作用。研究背景2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)的发病率逐年升高,已成为威胁人类健康的常见疾病,糖尿病是冠心病的独立危险因素之一,近年来更加认为糖尿病是冠心病的等危症。T2DM常伴有多种心血管疾病的危险因素,易合并以动脉粥样硬化和血栓形成为特征的大血管病变,冠心病是引起T2DM患者死亡的主要原因,其中最为严重的是急性冠状动脉综合征(acute coronary syndroms,ACS)。近年的研究显示,动脉粥样硬化斑块破裂和血栓形成是ACS的主要发病机制,而斑块不稳定性是这些环节中的始动因素。急性冠脉综合征的发生与否取决于斑块的稳定程度,因此易损斑块的临床识别以及探索稳定斑块的方法具有十分重要的临床意义。由于存在血管重构,冠脉造影(coronary angiography,CAG)并不能真实地反映出冠脉病变程度—常低估冠脉病变。血管内超声(Intravascularultrosound,IVUS)能提供管腔、管壁横截面图像,能够分辨出斑块的大小、组成成分、分布以及观察斑块处血管的重构情况,在斑块稳定性、靶病变严重程度的评估等方面具有冠脉造影无法比拟的优势。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)是一类能增殖并分化为血管内皮细胞的前体细胞。对于调节内皮细胞凋亡/再生平衡及保持内皮层的完整性有着重要作用。另外EPCs还参与新生血管的生成,这对于缺血组织侧枝循环的形成至关重要。因此,EPCs在糖尿病冠脉病变的发生发展中有重要的作用。冠脉造影研究显示与不伴有糖尿病的冠心病患者相比糖尿病患者冠状动脉病变严重,病变范围广并且冠状动脉侧支血管形成能力明显下降,应用血管内超声评价糖尿病对冠脉病变影响的研究尚少见报道;以往研究表明糖尿病患者循环EPCs数量和功能均受影响,但此种改变与急性冠脉综合征靶病变斑块稳定性及病变程度有何关系尚不明了。由此构成本课题的设计思路和研究目的。本课题应用血管内超声技术分析急性冠脉综合征患者靶病变严重程度、斑块负荷与外周血EPCs数量的关系,研究糖尿病合并ACS时对外周血EPCs数量的影响以及与易损斑块特征的关系。目的1.应用血管内超声方法研究糖尿病合并急性冠脉综合征患者靶病变斑块特征。2.观察糖尿病合并急性冠脉综合征患者循环内皮祖细胞数量变化。3.研究糖尿病合并急性冠脉综合征患者循环内皮祖细胞数量变化与靶病变严重程度和斑块负荷有无相关性。方法1.研究对象选自2007年7月至2008年1月间在我院接受冠状动脉造影(CAG)检查确诊为急性冠脉综合征(ACS)40例患者。包括急性心肌梗死(AMI)16例和不稳定型心绞痛(UAP)24例。AMI的临床诊断为伴有心肌坏死的血清心肌标志物浓度的动态演变的持续性静息状态胸痛的临床病史。靶血管病变经心电图、CAG和超声心动室壁运动资料确定。根据是否患有糖尿病将患者分为两组:糖尿病组(n=20),非糖尿病组(n=20)。糖尿病诊断标准符合2005年ADA修订的诊断及分型标准,均为2型糖尿病。入院时收集患者的病史包括冠心病高危因素如高血压、高脂血症、吸烟史等临床资料。2.检查方法2.1冠状动脉造影检查所有患者按常规进行CAG检查,冠脉造影诊断标准按照美国Coronary Artery Surgery Study(CASS)研究:冠状动脉左主干狭窄≥50%,左前降支、左旋支及右冠状动脉狭窄≥70%为阳性。2.2血管内超声检查在常规冠状动脉血管造影结束后,采用标准的冠状动脉内介入导管操作技术进行IVUS检查,追加3000IU肝素,然后把0.014英寸的导丝送至靶血管,常规冠脉内注入200μg硝酸甘油。将IVUS导管沿导引钢丝越过靶病变,至靶病变远端1cm以上,利用自动回撤仪以0.5mm/s的速度自动匀速回撤至靶血管开口,所有获取的IVUS图像实时连续采集并存入硬盘,供以后脱机分析。2.3 IVUS图像的定量测量斑块形态由二位研究者采用盲法分别进行分析和处理。2.3.1 EEM-CSA:即血管外弹力膜的横断面积,手工描记外膜内边缘,由仪器自身的测量系统测得的。2.3.2 L-CSA(lumen-CSA):是指血管腔的横断面积,手工描记内膜的内边缘,由仪器自身的测量系统测得的。当斑块包绕探头时,推测管腔的大小等于探头的大小。2.3.3 P-CSA(plaque-CSA):经由外弹力膜面积减去血管管腔面积计算获得。2.3.4 PB(plaque burden):即斑块负荷,为斑块面积除以外弹力膜面积乘以100%,它不同于管腔狭窄率。2.4循环内皮祖细胞培养、鉴定、计数2.4.1内皮祖细胞培养无菌采集外周血20mL,肝素抗凝,用PBS液等倍稀释血液。将稀释血液按1:2的比例置于人淋巴细胞分层液(LTS-1077)上以2 000 rpm离心30min。分离出单个核细胞后用5倍体积的PBS洗涤2次计数,调整细胞浓度以1×10~6/mL接种在包被0.1%明胶的24孔培养板。选择性M199培养基(含20%胎牛血清,青霉素100U/mL,链霉素100μg/mL,人血管内皮生长因子(VEGF)40 ng/mL,人成纤维细胞生长因子(FGF)2 ng/mL,人表皮生长因子(EGF)10 ng/mL,10U/mL肝素)诱导培养,4d后换液,继续培养至7d,PBS洗掉未贴壁细胞,贴壁细胞进行细胞鉴定。2.4.2内皮祖细胞鉴定内皮祖细胞可结合FITC标记的植物凝集素(FITC-UEA-1)并且能吸收DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白(DiI-ac-LDL),能结合两者的细胞可鉴定为内皮祖细胞。首先在37℃细胞与DiI-ac-LDL(2.4μg/ml)共同孵育1小时,然后用2%多聚甲醛固定10分钟,轻轻冲洗后与FITC-UEA-1(10μg/mL)共同孵育1小时,PBS冲洗后在倒置荧光显微镜下观察,双染阳性者为内皮祖细胞。2.4.3内皮祖细胞计数由两位研究者采用盲法分别计数双染细胞,每孔随机选取3个高倍镜视野计数,取平均值。结果靶病变分布情况:左前降支22例(55%),左回旋支8例(20%),右冠10例(25%)。血管内超声结果血管内超声分析示,糖尿病组管腔面积,外弹力膜面积,斑块面积和斑块负荷分别为3.3±1.6,14.3±3.0 and 11.1±2.7 mm~2,76.5%±11.7%;非糖尿病组管腔面积,外弹力膜面积,斑块面积和斑块负荷分别为4.9±2.2,13.8±3.4 and 9.0±2.6mm~2,66.2%±13.2%。与非糖尿病组比较糖尿病组斑块负荷明显增大。循环内皮祖细胞计数糖尿病组循环内皮祖细胞数量明显低于非糖尿病组(30.4±6.99 vs.51.7±11.1EPCs/×200 field,P＜0.05)。循环内皮祖细胞数量与斑块负荷的相关性糖尿病组循环内皮祖细胞数量与斑块负荷呈负相关(r=-0.427,P＜0.05)。结论1.糖尿病组病变部位的斑块面积和斑块负荷均大于非糖尿病组,管腔面积小于非糖尿病组;2.糖尿病组患者循环内皮祖细胞数量明显低于非糖尿病组;3.糖尿病组患者斑块负荷、靶病变严重程度与循环内皮祖细胞数量负相关,提示靶病变严重程度与循环内皮祖细胞数量相关;4.糖尿病急性冠脉综合征患者冠脉病变程度严重可能与内皮祖细胞减少导致的斑块迅速增长及血管内皮的再内皮化降低有关。
陈洪林[8]2011年在《壳聚糖接技聚已内酯/聚已内酯复合纤维支架的制备及其在组织工程中的潜在应用》文中提出本论文的目的是利用静电纺丝技术制备一种适合细胞生长和黏附的叁维支架材料。首先,在温和条件下一步合成氨基保留的壳聚糖接枝聚己内酯(CS-PCL)共聚物。对壳聚糖进行改性有叁个方面意义：其一,改性后使用普通溶剂体系就能制备带有壳聚糖链段的CS-PCL/PCL复合纤维支架材料,降低成本；其二,有利于提高复合纤维支架材料中CS-PCL共聚物与PCL之间的界面相容性,改善复合纤维支架的力学性质；其叁,将壳聚糖引入复合纤维支架可赋予其正的Zeta电位,有利于负膜电位的细胞的黏附。研究表明所制备的复合纤维支架具有高孔隙率和大孔径。随着CS-PCL组分含量的增加,CS-PCL/PCL复合纤维的平均直径和表面电位都得到提高。动态光散色;DLS)、X-射线光电子能谱(XPS)分析结果表明引进CS-PCL共聚物后,CS-PCL/PCL复合纤维支架表面出现氨基等活性基团,这是支架具有出正的Zeta电位和良好亲水性的主要原因。本文首先以小鼠成纤维细胞(L929)作为种子细胞来研究复合纤维支架对细胞生长的影响。分别采用MTS比色法和扫描电镜来检测细胞增殖能力和细胞形态,结果表明在复合支架表面上引入适量的氨基有利于提高支架的生物相容性。特别是具有适中表面正电位的CS-PCL/PCL(20/80)支架(ζ=3 mV)不仅最适合L929细胞增殖而且能很好地维持细胞正常形态。甲苯胺蓝染色试验进一步证明L929细胞在CS-PCL/PCL(20/80)支架上生长良好并且呈典型的两极梭形形态。以上实验结果表明CS-PCL/PCL(20/80)支架在皮肤组织工程中具有潜在的应用价值。同时,本文还进一步研究了小鼠视网膜祖细胞(mRPCs)在CS-PCL/PCL复合纤维支架上的生长情况。在复合支架上接种mRPCs细胞,并培养7天。荧光拍照和MTS试验都表明mRPCs在CS-PCL/PCL(20/80)支架上的增殖速度比在所制备的其它支架上的增殖速度都要快。扫描电镜照片和定量聚合酶链反应(qPCR)分析结果都表明：与PCL支架相比,CS-PCL/PCL(20/80)支架能够促进mRPCs细胞向视网膜神经细胞方向分化,这可能是由于CS-PCL/PCL(20/80)支架表面具有氨基等生物活性基团,有利于提高支架的生物相容性。因此CS-PCL/PCL(20/80)支架在视网膜组织工程中有很好的潜在应用价值。
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