任君萍[1]2001年在《噬菌体表达短肽模拟日本脑炎病毒糖蛋白的研究》文中进行了进一步梳理日本脑炎病毒（JEV）引起的流行性乙型脑炎（乙脑）是一种严重的急性中枢神经系统传染病，主要在东南亚等地区流行，采用疫苗进行预防接种是控制该病流行的有效措施。但是国内外使用的乙脑疫苗尚不理想，最早采用的鼠脑灭活疫苗引起的并发症较多，且需多剂接种；目前使用的减毒乙脑疫苗虽克服了前者的缺点，但毒力逆转的可能性却不能排除，所以乙脑新型疫苗的研制势在必行。JEV囊膜糖蛋白E是诱导特异保护性免疫的主要结构蛋白，因而成为乙脑亚单位疫苗的首选组分。近年来乙脑亚单位疫苗和基因工程疫苗的研究取得了一些有益的进展，但对JEV抗原表位的认识还不十分清楚，也影响了乙脑新型疫苗的研制。 噬菌体随机肽库技术是近年来新兴的一个探索受体与配体相互作用位点、寻求高亲合力生物活性配体分子、探测未知蛋白空间结构表位的有力工具，在疫苗研究、药物设计以及疾病诊断等方面均显示出广阔的应用前景。噬菌体随机肽库含有的大量不同序列多肽可作为靶抗原表位的模拟肽，为确定抗原表位序列，提供了一种新的研究方法。用靶抗原的mAb筛库得到的特异性多肽，可鉴定mAb的结合位点，或作为病毒保护性抗原， 第四军医大学硕士学位论文一为研究病毒关键抗原表位的结构和功能，以至设计新型疫苗奠定基础。 本研究选用 2株抗 JW E蛋白的保护性 mAb 2H4、2F2分别淘筛噬菌体随机15肽库，对获得的2种噬茵体表达短肽的抗原性与免疫原性进行了鉴定。筛选到的2种噬菌体表达短肽mZH4（RQDPQWPYANSTIAR）和mZFZ（HTPQWSPSQYRPSL）经鉴定能分别与 InAb 2H4、2F2特异结合，并且这种结合可被 JEV天然抗原所抑制；将 mZH4、mZFZ与 JEV E蛋白进行同源性分析后，得到的两段一致序列ST XAXAR、PXXSPS可能分别为mAb 2H4、2F2识别的模拟表位；呈现mZH4 和mZFZ 白噬菌体分别免疫了小鼠，观察到小鼠分别产生了抗mZH4和 mZFZ的持异性抗体；抗JEV天然抗原的小鼠血清也能与噬菌体表达短肽mZH4、mZFZ特异结合。 综上所述，通过多种鉴定说明噬菌体表达短肽mZH4和mZFZ能够摸拟 JEV E蛋白的部分杭原性，并且具有一定的免疫原性，这些结果加深了对 JEV E蛋白表位的认识，为进一步研究乙脑新型疫苗提供了有益的线索。
任君萍, 马文煜, 杨乔欣, 丁天兵, 黎志东[2]2002年在《噬菌体表达短肽模拟乙脑病毒糖蛋白的研究》文中指出为研究日本脑炎病毒 (JEV )E蛋白模拟肽 ,将抗JEVE蛋白的mAb 2H4淘筛噬菌体 15肽库。经夹心ELISA、竞争ELISA鉴定后 ,随机挑取 10个阳性克隆 ,测序并与JEVE蛋白同源比较。将阳性噬菌体免疫小鼠 ,检测血清中特异性抗体。ELISA结果显示筛选到的噬菌体能特异地与mAb 2H4结合 ,并且这种结合可被JEV天然抗原所竞争抑制。 10个阳性克隆的氨基酸序列相同 :—RQDPQWPYANSTIAR— ,同源分析得到的序列STXAR可能为mAb 2H4识别的模拟表位。阳性噬菌体表达的 15肽能够刺激小鼠产生特异性抗体。该噬菌体表达短肽模拟JEVE蛋白的部分抗原性。
任君萍, 马文煜, 杨乔欣, 肖毅, 丁天兵[3]2001年在《日本脑炎病毒糖蛋白模拟短肽的筛选和基因定位》文中研究表明目的 寻找 JEV m Ab 2 F2识别的抗原表位 ,为 JEV小分子多肽疫苗合理设计提供依据 .方法 链亲和素包被塑料平皿 ,加入生物素标记 2 F2与噬菌体随机 15肽库 ,再洗脱 ,扩大培养进行叁轮淘筛 ,经夹心 EL ISA、竞争 EL ISA鉴定后 ,挑取 10个阳性克隆 ,DNA测序 ,与 JEV E蛋白同源分析 .结果 筛选到的噬菌体能特异地与 2 F2结合 ,并且这种结合可被天然抗原所抑制 . 10个克隆的氨基酸序列相同 :-HTPQWSPSQYRPSL R- ,同源分析在 JEV E蛋白 2 2 4～ 2 2 9aa得到一个同源性较高的序列 :PXXSPS.结论 PXXSPS可能为 JEV E蛋白的一个模拟表位 .
罗斌[4]2013年在《细胞因子信号抑制物-3在脂肪酸β氧化中的作用》文中进行了进一步梳理肥胖症问题越来越受到世界关注,同时它还伴随发生心血管疾病和脂质代谢失常等疾病。通常肥胖患者血液内都呈现高水平leptin, leptin的抵抗是造成肥胖症的关键诱因之一,而细胞内多余的SOCS3又是造成leptin抵抗的主要原因。细胞负反馈调控因子SOCS蛋白参与细胞内各种信号通路的调控,SOCS1-SOCS7以及CIS这八个蛋白组成了SOCS3家族。通过对它们氨基酸序列比对发现：它们均包含一个SH2结构域和一个C端较保守的SOCS-box功能区域,这两个功能性结构域对SOCS家族成员十分重要,它们是SOCS蛋白调控细胞内各种信号通路的主要功能区域。SOCS3是一个重要的负反馈调节蛋白,它参与IL-6、leptin、促红细胞生成素和胰岛素等信号途径的调控。SOCS3蛋白能够通过自身的SH2结构与JAK家族的酪氨酸激酶结合直接抑制其酶活性或者SOCS3结合信号分子将其带入蛋白酶降解途径,从而抑制细胞内的信号通路。leptin是一个脂肪组织分泌的细胞因子,其功能是维持体内能量平衡和降低食物摄取量,它通过血脑屏障与位于下丘脑的受(体瘦素受体,简称OB-R)结合,引起STAT1和STAT3活化。磷酸化的STAT3能够诱导SOCS3基因表达。通常肥胖症患者血液中的leptin含量高,能长时间持续的刺激OB-R使得细胞内SOCS3过表达。SOCS3作为leptin信号通路负反馈机制,过剩的SOCS3和JAK结合直接抑制酶的活性,并且将JAK信号分子带入蛋白酶降解途径。SOCS3的基因敲除小鼠用高脂饲料喂养后,其体重和脂肪含量减轻,因此,SOCS3可能在能量代谢和脂肪酸氧化中扮演重要角色。然而,SOCS3调控目标蛋白的机制还研究得不够透彻。为了进一步研究SOCS3蛋白抑制细胞因子信号转导的机制和其潜在的肥胖症治疗功能,我们以表达纯化的HIS-SOCS3为诱饵蛋白利用噬菌体展示技术从人肝的cDNA文库中筛选能与其相互作用的短肽。通过对筛选出来的一条短肽的序列RGGVVTSNPLGF分析,我们发现该短肽序列与编码VLCAD蛋白C末端644-655位的12个氨基酸序列相同,暗示SOCS3与VLCAD艮可能具有相互作用。为了证明这一点,我们用酵母双杂交系统构建了两个表达质粒pGBKT7-SOCS3和pGADT7-VLCAD,共转化酵母菌AH109,我们发现,重组菌落能够在-Trp-Leu-His的平板上生长,β半乳糖苷酶显色实验阳性。实验结果充分证明SOCS3蛋白能与VLCAD蛋白相互作用。我们首次发现了超长链乙酰辅酶A (VLCAD)是一个重要的SOCS3结合蛋白。乙酰辅酶A脱氢酶属于线粒体中的黄素酶,具有催化脂肪酸β氧化起始反应的活性。细胞中存在四种不同乙酰辅酶A脱氢酶：短链乙酰辅酶脱氢酶(SCAD),中链乙酰辅酶脱氢酶(MCAD),长链乙酰辅酶脱氢酶(LCAD)和超长链乙酰辅酶脱氢酶(VLCAD)位于462位的GLU被认为是酶的重要活性中心。其中以VLCAD活性最强。通过氨基酸序列比较发现,这四种乙酰辅酶A脱氢酶的C-端都含有加长的25KD尾巴。当棕榈酸乙酰A作为酶的底物时,VLCAD的活性比LCAD高10倍。目前对这条25KD的特殊序列的功能还不了解。进一步,我们还通过体外GST pull-down实验和体内免疫共沉淀实验,验证了SOCS3蛋白与VLCAD蛋白的相互作用。为了深入研究这种相互作用的功能区,我们又将VLCADC端含有220个氨基酸的extra-peptide构建至真核表达载体pCMV-HA上,转染至小鼠巨噬细胞RAW264.7,用LPS刺激细胞,刺激时间依次为1h,2h,4h和8h,细胞裂解后Western blot检测蛋白的表达情况。我们发现,由于LPS的刺激诱导了SOCS3蛋白的表达,同时,相应的减少了VLCAD的表达,这意味着VLCAD的C端部分能够被SOCS3蛋白降解。其降解机制估计是由于SOCS3蛋白能够结合VLCADC端25KD的尾巴,并且将其带入到蛋白酶体降解途径。为了证明SOCS3蛋白参与VLCAD的降解而带来的减肥功效,我们合成了VLCADC末端的12个氨基酸短肽,将其从腹腔注射至昆明小鼠体内,每叁天加强注射一次并称量小鼠体重,24天后我们观察到注射PBS的空白对照小鼠体重增加最为显着,注射随机十肽的对照小鼠体重增加次之,而注射VLCAD特异性12短肽的小鼠体重增加最为缓慢。同时我们还检测小鼠血液中的总甘油叁脂(TG)和总胆固醇(TC)含量作为减肥的重要生理指标,我们发现注射VLCAD特异性12短肽小鼠的TG和TC含量比对照小鼠显着降低,具有一定的减肥作用。减肥功能的机制可能是由于合成的特异性12短肽在小鼠体内竞争性结合了SOCS3蛋白,从而释放更多的VLCAD酶分子,VLCAD是脂肪酸β氧化反应第一步的限速酶,因此加快了体内更多脂肪酸的代谢速度。而降低了老鼠的体重。综合以上结果,我们的研究首次证明了SOCS3蛋白与超长链乙酰辅酶A相互结合,结合的功能区是VLCAD-C末端12氨基酸。随着SOCS3与VLCAD-C末端25KD尾巴的结合而将VLCAD带入泛素化降解途径,影响VLCAD的正常功能而降低机体脂肪酸代谢。这可能是解释为什么肥胖症患者脂肪酸代谢缓慢的重要原因之一。我们认为,SOCS3是脂肪β氧化反应代谢重要负调控因子和治疗肥胖症潜在的药物作用位点。合成的VLCAD-C末端12氨基酸短肽也有可能成为治疗肥胖症的重要靶标药物。
陈娜莎[5]2009年在《乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位的结构分析》文中研究表明乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE )是由黄病毒科黄病毒属成员日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus ,JEV)引起的一种严重危害人畜健康的虫媒病毒性疾病。囊膜糖蛋白E是JEV的主要结构蛋白,在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。本研究参照SA14-14-2序列,对实验室已鉴定出的6个抗原表位(E1、E11、E19、E33、E39、E49)分别从羧基端(C端)和氨基端(N端)进行逐个氨基酸的缩短,设计一系列短肽和与之对应的寡核苷酸链,退火后插入表达载体pGEX-6p-1,与GST进行融合表达,用JEV阳性血清进行Western blot分析,确定出六个抗原表位的核心序列: E1(~7GNRDFIEG~(14))、E11(~(72)EKRADSS~(89))、E19(~(150)ENHGNYS~(156))、E33(~(259)EGGLHHA~(265))、E39(~(310)FAKNPVD~(316))和E49(~(385)VGRGDK~(390))。其中, E19抗原表位( ~(150)ENHGNYS~(156))完全包含于报道的线性中和表位(~(149)SENHGNYSAQVGASQ~(163)),因此推测E19抗原表位为具有中和活性的表位。黄病毒属(Flavivirus)是黄病毒科(Flaviviridae)的最大家族,分为8个血清学亚群,包括70多种具有血清交叉反应特性的不同病毒,如:流行性乙型脑炎、登革热病毒(Dengue fever virus,DV)、西尼罗病毒(West Nile virus, WNV)和昆津病毒(Kunjin virus,KUNV)。这些病毒均能引起发热、脑炎等相似的临床症状,但目前却没有成熟的鉴别诊断方法。本实验把E1、E10、E11、E19、E33、E39和E49七个抗原表位的核心序列与24条乙型脑炎不同病毒株和12条黄病毒属病毒不同代表株的同源序列用生物信息学软件进行了比较和分析,共设计47条突变短肽,进行GST融合表达后用免疫印迹的方法,初步确定了E1、E10、E19和E33四个抗原表位具有鉴别诊断乙型脑炎病毒与部分其他黄病毒属病毒感染的意义。本研究将为进一步分析E蛋白结构和功能、新型表位肽疫苗的研制以及建立乙型脑炎临床鉴别诊断方法奠定分子生物学基础。
刘霄卉[6]2011年在《JSRV表面蛋白抗原表位的筛选及检测试剂盒的制备》文中研究说明研究背景:绵羊肺腺癌(ovine pulmonary adenocarcinoma, OPA)是由β-反转录病毒属绵羊肺腺瘤病病毒(jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV)引起的一种传染性肺脏肿瘤性疾病,世界动物卫生组织将其列为B类传染病。目前国内对该病的诊断主要依靠常规病理学方法检测,严重障碍了我国对OPA的防控。主要目的:建立快速特异的实验室及适用于基层的诊断方法,为临床及基层检测诊断提供技术支持,为进一步分析表面蛋白( surface protein,SU)蛋白的功能、疫苗设计及对JSRV的生物学特性研究提供素材。研究方法:以获得的叁株抗JSRV-SU蛋白的单克隆细胞分泌的McAb为一抗,应用噬菌体展示结合肽探针扫描技术,鉴定叁株单抗所识别的线性表位;并应用非竞争性ELISA法测定叁株单抗的功能性亲和常数;以阳性标准病料与健康阴性羊肺组织为样本,以纯化的多抗和单克隆抗体为基本检测试剂,建立双抗体夹心ELISA检测方法;针对外源性JSRV U3区设计特异性引物,建立JSRV的环介导等温扩增(Loop-mediatedisothennalamplification ,LAMP)检测方法,并以700ng健康羊基因组DNA为背景进行敏感性和特异性试验;通过基因克隆技术对JSRVenv及绵羊ras基因进行序列测定;运用基因重组方法构建JSRVenv重组真核表达质粒,并通过脂质体转染建立稳定表达细胞系。研究结果:1.叁株单抗3B3、3D6、1D6的亲和常数分别为5.06×10~9 L/mol﹑5.82×10~9 L/mol﹑ 2.91×10~9 L/mol ;且其所对应的抗原表位分别为W~(156)APEGTPD~(163),F~(71)SYQSQHPHCI~(81),D98EKTGKR~(104);2.首次基于JSRV-SU蛋白的单抗建立了夹心ELISA法,并建立了阴性与阳性的判定标准(当P/N≥2.21时判为阳性;当P/N<1.85时判为阴性;当2.21>P/N≥1.85时判为可疑);3.在国内首次基于内外源性病毒长末端重复序列( long terminal repeat ,LTR)的差异建立了LAMP诊断方法,所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用60min即可得到其特有的阶梯状条带,而且对内源性JSRV的扩增结果为阴性,该方法对JSRV前病毒DNA的最小检测限为10拷贝,灵敏性高于一步PCR方法。LAMP和特异性PCR及套式PCR方法检测临床样品的符合率分别为92 %和100%;4.通过基因克隆技术对JSRVenv及绵羊ras基因进行序列测定,结果发现,本研究克隆的pMD-exJSRVenv1属于Ⅱ型exJSRV;而pMD-exJSRVenv2属于Ⅰ型exJSRV;在exJSRV氨基酸序列中存在“YXXM”基序;绵羊ras基因与已知其他物种的该段基因作比对差异率较小,基本保守,且与牛的ras基因同源性最高;5.成功构建了含有env及tm基因的重组真核表达质粒pcDNA3.1-env及pcDNA3.1-TM-HA,并建立了稳定表达JSRV囊膜蛋白(Env)及其TM亚基的HepG2细胞系。结论:本研究建立了特异性检测JSRV的夹心ELISA法和LAMP法,对于我国养羊业的健康发展,具有重要的实用价值,对研究OPA防制措施等均有重要意义。另外,JSRV env基因的克隆和表达及对绵羊ras基因的序列分析,对于丰富JSRV的分子发病机理以及为进一步研究该蛋白与JSRV诱导OPA发病关系搭建了重要的实验平台。
闫丽萍[7]2007年在《流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2株全基因组序列分析及E蛋白抗原表位鉴定》文中研究说明流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis，JE)是由黄病毒科黄病毒属的乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)引起的一种以蚊虫为媒介传播的人和动物共患的病毒性疾病，对人类危害巨大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一，对猪可引起繁殖障碍，给养猪业造成巨大的经济损失。猪是JEV的中间宿主，带毒猪是本病的主要传染源。因此，控制猪的JE不仅对养猪业而且对人类健康都具有十分重要的意义。本研究首先根据已发表的JEV SA14-14-2株基因序列设计合成了4对引物，通过RT-PCR从乙脑病毒SA14-14-2株经BHK21细胞传至第20代的毒株SA14-14-2-B20中扩增得到了覆盖乙脑病毒基因组全长的4个cDNA片段，将所得片段克隆至pMD18-T载体上，经测序和拼接后，获得了JEV基因组全序列(SA14-14-2-B20)。序列分析表明，该JEV基因组全长10 977bp，含有1个大的开放阅读框架，编码1个由3 432个氨基酸残基组成的聚合蛋白，其5’非编码区和3’菲编码区分别由95和583个碱基组成。将此全序列与SA14源病毒株核苷酸、氨基酸进行比较，同源性均在99％以上，突变位点分散于各个区域，而且发现SA14-14-2-B20一些位点和SA(A)及野毒株SA14核苷酸、氨基酸序列相同而与疫苗株SA14-14-2不同，推测这些区域可能与减毒没有关系。发现SA14-14-2-B20在3’非编码区第10 701位插入一个碱基G。比较了31株JEV全序列的3’非编码区，结果提示10701位碱基G插入区域可能是JEV易变位点。将SA14-14-2-B20序列与GenBank发表的31株JEV全序列进行同源性分析，以进一步了解JEV之间的遗传进化关系。本研究所获得的SA14-14-2-B20株全序列测定，一方面有助于揭示病毒的致病和减毒机理，另一方面也为减毒活疫苗生产的质量控制，主要为监控可能发生的回复突变提供分子基础。此外，病毒基因组全序列cDNA克隆的建立为进一步进行感染性克隆的研究奠定了基础。E蛋白是JEV的主要结构蛋白，在病毒的吸附、融合、血凝、细胞趋向性、病毒毒力和诱导保护性免疫反应中起重要作用。本试验通过PCR扩增EF1(1～291aa)、EF2(292～402aa)和EF3(403～500aa)3个片段，PCR产物分别定向克隆到表达载体pGEX-6p-1中，经诱导各融合蛋白均以包涵体的形式表达。兔抗SA14-14-2病毒血清的ELISA和Western blot结果均表明EF1和EF2片段1～402aa是E蛋白的免疫优势决定区。为对这一免疫优势区域进行抗原表位鉴定，设计一套52个部分重迭的短肽，这些短肽覆盖全部1～402aa片段。将每一个短肽基因序列分别合成一对寡核苷酸链，退火后插入表达载体pGEX-6p-1，与GST进行融合表达，多数表达的融合蛋白以可溶解的形式存在。用JEV阳性血清进行Western blot和ELISA扫描，鉴定出11个抗原表位，分别为E1(1～16 aa)、E10(73～88 aa)、E11(81～96 aa)、E19(145～160 aa)、E33(257～272aa)、E39(305～320 aa)、E45(353～368 aa)、E47(369～384 aa)、E48(377～392 aa)、E49(385～400aa)和E63(373～388 aa)。通过Western blot蛋白免疫印记对鉴定的抗原表位进行精细分析，最终确定为9个抗原表位：E1(1～16 aa)、E10-4(77～84 aa)、E11-2(83～94 aa)、E19(145～160 aa)、E33(257～272 aa)、E39-2(309～316 aa)、E45-3(359～362 aa)、E48-1(377～384 aa)、E49(385～400aa)。应用此9个融合蛋白对小鼠进行免疫，结果表明9个融合蛋白均能诱导小鼠产生针对短肽的特异性抗体。且通过中和试验鉴定出E10(73～88 aa)、E39(305～320 aa)为线性中和表位。其中表位E10与现有的报道区域重替，另一个中和表何E39为新确定的。将鉴定的表位合成多肽，混合包被ELISA板，证实可以用于检测猪血清。本研究对JEV SA14-14-2株E蛋白进行抗原表位的鉴定，将有助于进一步阐明E蛋白的结构与功能，将为建立以表位为基础的抗原抗体诊断方法和基于表位疫苗的设计研究提供重要的研究工作基础。
邓文蕾[8]2011年在《猪流行性乙型脑炎单克隆抗体的制备及对病毒蛋白EDIII表位的鉴定》文中研究表明猪流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE),简称乙脑,是由猪流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)引起的常见病毒性脑炎,对人的致死率高,约为25---40%,对猪的致死率不高,但引起造成怀孕母猪发生繁殖障碍是主要的经济损失,对作为畜牧业支柱产业的养猪业持续增产造成巨大的危害。近年来,乙脑的传染范围不断扩大,严重威胁公共安全和养殖业。而抗乙脑病毒的中和性单抗能够有效地降低病毒的致病能力,且具有较高的特异性和生物学活性,在病毒的诊断检测和治疗预防中有着良好的应用前景。本文用常规的杂交瘤制备技术获得了抗乙脑病毒(NJ2008株,GQ918133,以下实验中所用的乙脑病毒均为此株)的7株单抗,用BHK-21细胞培养后冻于-20℃,反复冻融叁次后经蔗糖密度梯度离心,将所获纯化病毒免疫BALB/c小鼠,4次免疫后取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,用ELISA法进行筛选,抗原即为免疫原,加强免疫时用EDHI,筛选时分别用EDIII和纯化的乙脑病毒筛选。最后获得七株能稳定分泌的杂交瘤细胞,分别命名为1H5F9、2D7E4、2B4B4、1H4、2E3、2B4、4D4,然后用常规方法免疫小鼠制备腹水,并测亚型后用Protein A纯化柱纯化。用ELISA、Western Blot、IFA、流式细胞术以及中和实验等方法鉴定7株单抗的生物学特性。结果显示1H5F9、2D7E4、2B4B4能识别BHK-21细胞的蛋白,1H4和2B4只识别EDⅢ而2E3和4D4两种都能识别,因此1H5F9、2D7E4、2B4B4由于只识别细胞而淘汰,2E3和4D4则在后续的实验作为对照。中和试验结果显示4株单抗都有一定的中和活性,且结果为：2B4>1H4～4D4>2E3。临床实例应用进一步证明用特异性和反应性最高的2B4能够检测出感染JEV的小鼠的脑脊液中JEV的存在及水平。根据单抗特性鉴定的结果,1H4和2B4能与JEV的EDⅢ和MEP都反应,且Western Blot显示表位是在同一个蛋白上,因此推断这2株单抗的识别位点是在EDⅢ和MEP共有序列上的。同时,本文用M13噬菌体展示肽库筛选单抗的表位,以进一步验证上述推断。MegAlign和Blast的结果显示,"HH-H"(E394-E397)是最有可能的结合位点。在此基础上,合成EDⅢ和MEP共有序列多肽,P1:TVN PFV A (E356-E362)和P2：EME PPF GDS YIV VGR GDK QIN HHW HKA (E373-E399)以及含噬菌体筛选出的位点的短肽NHH WHK A (E394-E398),用ELISA进一步验证,发现1H4与3条肽都反应,而2B4则只与P3反应,并且用P3作为抗原能够检测猪的乙脑阳性血清,说明E394HHE398有效诱导产生抗体,且E396-M很可能是决定中和活性的一个关键位点。空间构象和理化分析显示该位点在p折迭的末端,且B94HHWHE398富含亲水氨基酸,能够作为表位诱导机体免疫反应。因此,该位点对乙脑的进一步研究有着重要的意义,单抗1H4和2B4也有望应用于建立相应的检测方法和疫苗。
肖昌[9]2006年在《亨得拉和尼帕病毒结构蛋白的表达及抗原表位研究》文中提出为有效防治亨得拉病毒(Hendra virus HeV)和尼帕病毒(Nipah virus NiV)在我国的发生和流行,本研究首先利用原核表达系统成功地表达HeV N、NiV N基因以及NiV G一段主要抗原区基因GC,并证实了两种N蛋白的主要抗原区位于C末端约200aa区域。在杆状病毒表达系统中,实现对两种病毒的N基因的分泌性表达,通过免疫学方法证实了原核和杆状病毒表达系统所表达的重组蛋白均可以作为病毒血清抗体检测的候选抗原,提出了两种病毒血清抗体的IFA检测方法;以原核系统表达的两种病毒的N蛋白免疫小鼠,通过杆状病毒表达的两种病毒的N蛋白作为检测抗原,利用IFA技术成功地筛选到了叁株针对HeV N和两株针对NiV N的单克隆抗体,并对单抗的特性进行了鉴定,证实可用此法制备有鉴别诊断意义的单抗。在此基础上,利用随机12肽库技术对所制备的单抗所针对的抗原表位进行了初步研究,发现了NiV N蛋白上两个线性表位(15～23aa和443～451aa),以及两个HeV N蛋白上的模拟抗原表位。
陆慧君[10]2008年在《猪血凝性脑脊髓炎病毒的分离鉴定及其受体的筛选》文中提出猪血凝性脑脊髓炎病毒(Hemagglutinating encephalomyelitis virus, HEV)能引起仔猪呕吐、衰竭或明显的神经症状。1～3周龄的仔猪感染HEV后,死亡率通常高达20～100%。大量的血清学调查表明,HEV感染呈世界性分布,对养猪业发展已构成严重威胁。本研究对从吉林省5个地区采集的1117份猪血清进行猪血凝性脑脊髓炎HI抗体调查,结果发现其总体阳性率为52.4%,提示吉林省的猪群中普遍存在HEV感染。从长春地区九台市某猪场发病仔猪脑内分离获得1株病毒,经系统鉴定为血凝性脑脊髓炎病毒HEV-JT06;进而对该毒株的5个结构蛋白全长cDNA进行测序,序列分析结果表明,HEV-JT06与HEV-67N之间有较高的同源性;系统发育树分析表明HEV-JT06可能是从北美种系HEV-67N进化而来的。通过对HEV-JT06与GenBank中发表HEV的5个结构蛋白序列进行比对,发现HEV-JT06株5个结构蛋白序列发生多个氨基酸的独自变异,可能是HEV-67N传入我国后,在进化过程中所产生的。以HEV-JT06为基础,利用毕赤酵母表达系统成功实现了HEV S1重组蛋白的分泌性表达,以重组HEV S1蛋白代替全病毒进行VOPBA,获得一条与HEV S1蛋白特异结合的90kDa蛋白条带,推测该蛋白可能是在PK-15细胞膜表面的HEV受体。为了对HEV受体进行全面鉴定,本研究利用T7噬菌体展示系统构建了PK-15细胞的T7噬菌体展示文库,文库容量、重组率和文库滴度均达到理想要求。并用纯化的HEV进行文库筛选,最终获得一个与HEV结合的蛋白PKCP1,该蛋白编码121个氨基酸,与野猪mRNA同源性较高,该蛋白可能是HEV在PK-15细胞上受体蛋白的功能区。对PKCP1蛋白分析结果表明该蛋白是亲水性蛋白,具有免疫原性和良好的抗原性,其生物学活性有可能在细胞信号传导通路中接受多种信号的调控。该项研究对PK-15细胞上HEV受体的筛选为由受体介导的细胞感染机制的研究奠定基础。
参考文献：
[1]. 噬菌体表达短肽模拟日本脑炎病毒糖蛋白的研究[D]. 任君萍. 第四军医大学. 2001
[2]. 噬菌体表达短肽模拟乙脑病毒糖蛋白的研究[J]. 任君萍, 马文煜, 杨乔欣, 丁天兵, 黎志东. 上海免疫学杂志. 2002
[3]. 日本脑炎病毒糖蛋白模拟短肽的筛选和基因定位[J]. 任君萍, 马文煜, 杨乔欣, 肖毅, 丁天兵. 第四军医大学学报. 2001
[4]. 细胞因子信号抑制物-3在脂肪酸β氧化中的作用[D]. 罗斌. 武汉大学. 2013
[5]. 乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位的结构分析[D]. 陈娜莎. 中国农业科学院. 2009
[6]. JSRV表面蛋白抗原表位的筛选及检测试剂盒的制备[D]. 刘霄卉. 内蒙古农业大学. 2011
[7]. 流行性乙型脑炎病毒SA14-14-2株全基因组序列分析及E蛋白抗原表位鉴定[D]. 闫丽萍. 中国农业科学院. 2007
[8]. 猪流行性乙型脑炎单克隆抗体的制备及对病毒蛋白EDIII表位的鉴定[D]. 邓文蕾. 南京农业大学. 2011
[9]. 亨得拉和尼帕病毒结构蛋白的表达及抗原表位研究[D]. 肖昌. 吉林大学. 2006
[10]. 猪血凝性脑脊髓炎病毒的分离鉴定及其受体的筛选[D]. 陆慧君. 吉林大学. 2008
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