（1.中国医科大学；2.中国医科大学科学实验中心一部；辽宁沈阳110122）
摘要：阿片受体广泛分布于神经系统中,主要有四种亚型，包括μ、δ、κ三类经典的阿片受体及及ζ受体，既阿片生长因子受体（OGFr）。人们对阿片受体的研究已有20余年的历史。阿片受体属于G蛋白偶联受体，其与其衍生物在神经系统中具有很强的镇痛作用，并广泛参与各种生理以及病理活动。近年来，阿片受体的抗肿瘤效应逐渐被发现并得到关注。本文总结了近5年国内外对阿片受体在抗肿瘤方面的研究成果，同时提供了癌症治疗研究新方向。
关键词：阿片受体、抗肿瘤、癌症、最新进展
LATEST ADVANCE OF OPIOID RECEPTORS ON CANCER TREATMENT
Liu Zhuo-nan, MENG Jing-juan.
ABSTRACT: Opioid receptor is widely distributed in the nervous system. There are mainly four types of opioid receptors including the classicμ-,κ-,δ-opioid receptors andζopioid receptors which is also known as opioid growing factor receptor(OGFr). Study of opioid receptors has more than 20 years of history. Opioid receptors are G protein coupled receptors. They and their derivatives in the nervous system have a strong analgesic action and widely are involved in various physiological and pathological events. In recent years, effect of opioid receptor on antitumor has been found and get attention gradually. This article summarizes a domestic and overseas research results on antitumor effectiveness of opioid receptors in the recent years and also provides a new research direction of cancer treatment.
KEYWORDS: opioid receptor, antitumor, cancer , latest advance
1 前言
早在公元前300年【1】，阿片作为安慰剂在宗教仪式上以口服或注射的方式使用。1806年，吗啡被成功提取。人们在对吗啡作用机制的研究过程中发现了3种具有共同结构的内源肽，这些内源太广泛分布于神经系统，在调节内分泌、心血管、胃肠和免疫功能方面起着重要作用。1973年，通过使用阿片拮抗剂3H-纳洛酮（[3H] naloxone）和3H-羟戊甲吗啡（[3H] etorphine）作用于大鼠脑部，阿片受体被人们发现[2,3].1976年，Martin等【4,5】利用吗啡、ketocyclazocine和消旋化合物SKF-10,047的效应发现了三种阿片受体并分别命名为μ、κ、σ原型。这些药物产生的依赖性可被同组内药物所抑制，但戒断症状可通过组外化合物的使用得到加强。由于SKF-10,047相关的综合征不能被普通阿片拮抗剂纳洛酮所阻断，后来σ型不再被视为阿片受体。之后，Kosterlitz小组又发现了δ型受体。μ、κ、δ受体是三种经典的阿片受体,它们均属于G蛋白偶联受体家族，由370-400个氨基酸组成【6,7】，具有7个疏水的跨膜区域，由一个细胞外氨基端区域和一个细胞内羧基端尾区连接【8】。
1992年，Evans和Kieffer利用小鼠成神经细胞瘤NG108-15x大鼠神经胶质细胞制备cDNA以及瞬时表达载体构建cDNA文库成功克隆了小鼠δ受体的基因【9,10】。1993年，Wang等和Chen等分别报道采用δ阿片受体保守区核苷酸序列为探针，通过杂交筛选的方法，从大鼠cDNA文库中克隆出μ阿片受体的cDNA，继而克隆了μ阿片受体[11,12]。同年，Yasuda在生长抑素受体亚型杂交筛选过程中偶然掌握了κ受体cDNA克隆的分离和功能鉴定[13]。
三种经典的阿片受体广泛而不均匀地分布于脑内。这些受体分布在痛觉传导区以及与情绪和行为有关的区域，集中分布在导水管周围灰质、内侧脑丘、杏仁核和脊髓胶质区。阿片受体主要通过与G蛋白偶联的腺苷酸环化酶cAMP系统介导阿片肽的作用。脑啡肽、强啡肽、阿尔法内啡肽等通过与阿片受体结合抑制抑制腺苷酸环化酶，使突触后膜神经细胞内cAMP生成减少，从而产生突触后抑制作用，进而发挥信号转导与神经调节作用。μ和δ受体通常通过增加K+通道开放引起神经元超极化和动作电位生成抑制作用，而κ型受体的活化导致Ca2+通道开放抑制。
1975，Hughes【14】报道了内源性类阿片肽后，人们开始逐渐认识到其生长调节作用。蛋氨酸脑啡肽（methionine5-enkephalin, Met5-enk）作为一种内源性类阿片肽，通过ζ受体发挥其对生长的强效抑制作用，前者被命名为阿片生长因子（opioid growth factor, OGF）及阿片生长因子受体（opioid growth factor receptor, OGFr）。OGFr基因位于染色体22q13.3，长度至少为9kb，包括7个外显子和6个均具有规则的GT-内含子-AG结构的内含。人的OGFr cDNA其开放阅读框编码一种由697个氨基酸组成的蛋白质，即OGFr蛋白。OGF与OGFRr可建立连接并相互作用形成OGF-OGFr轴【15】，其已被发现在人和动物的很多正常细胞、组织以及肿瘤组织中存在，这意味着OGF-OGFr轴不仅可能在机体的生长发育中扮演着重要角色，而且与肿瘤形成、进展也有着密切联系。
2 肿瘤细胞存在阿片受体
2.1 阿片受体在肝癌中的研究进展
2013年，JIN LU【16】等通过western blotting发现肝癌HepG2细胞和BEL7402细胞中μ阿片受体（MOR）mRNA及蛋白质表达水平较高。同时，免疫组化实验结果显示肝癌组织中MOR的表达水平明显高于正常肝组织。
LU等利用μ阿片受体 siRNA和阴性对照寡核苷酸转染HepG2细胞并在不同条件下观察μ阿片受体mRNA和蛋白质的表达。结果表明MOR siRNA转染能有效沉默μ阿片受体基因表达而影响μ阿片受体的表达。用不同浓度的纳洛酮及不同浓度的μ阿片受体siRNA处理肝癌HepG2细胞并分别在第24、48、72小时用MTT法进行活细胞检测，发现HepG2细胞的A490值与纳洛酮和μ阿片受体 siRNA的浓度呈负相关。同时，利用Hoechst 33342染色法及流式细胞仪观察肝癌细胞的凋亡情况。结果显示，Hoechst 33342后，经μ阿片受体 siRNA和纳洛酮处理的HepG2细胞染色质浓缩明显，亮度明显高于对照组，且两组细胞凋亡率分别为18.36%和22，99%，远高于对照组6.6%（p<0.05）。此外，利用流式细胞仪发现，经纳洛酮与μ阿片受体 siRNA处理，停滞在G0/G1期的HepG2细胞数明显增加。以上实验结果表明，μ阿片受体下调可以通过促进细胞凋亡和阻断细胞周期进展以抑制人肝癌细胞生长,同时，动物实验证明μ阿片受体下调可以明显抑制小鼠体内的肿瘤进展。
为了探究μ阿片受体下调抑制人肝癌细胞生长的分子机制，LU等分别利用RT-PCR和western blotting检测MKK7 mRNA与MKK7蛋白表达及其磷酸化水平，发现下调μ阿片受体会导致MKK7磷酸化表达水平升高；利用RNA干扰抑制MKK7表达,肝癌细胞的A490-nm值显著上升，此时，JNK及其磷酸化水平大幅度下降。实验结果表明，μ阿片受体下调可提高磷酸化MKK7表达水平以激活JNK通路从而抑制肝癌细胞生长。
同年，BO TANG等【17】发现经δ阿片受体 siRNA转染或经纳曲吲哚（DOR抑制剂）处理的HepG2和Hep3B细胞的OD570值显著下降，确认下调δ阿片受体有效抑制肝癌细胞的增殖；利用Hoechst 33342染色法和 Annexin V-FITC/PI双染色法及流式细胞仪证明了δ阿片受体下调可促进肝癌细胞凋亡与阻断细胞周期从而抑制肝癌细胞生长。
为研究δ阿片受体下调对HCC细胞侵袭与转移的影响，TANG等对被siRNA转染前后的通过人工基膜的肝癌细胞的细胞数进行比较，发现δ阿片受体下调减少了通过基膜的肝癌细胞，抑制了肝癌细胞的侵袭转移能力。同时，划痕实验也证明了这一点。
同年，KAIQI JIA【18】等通过流式细胞仪及对肝癌细胞线粒体、细胞膜上细胞色素c水平与线粒体膜电位的分析，发现H2O2通过线粒体通路诱导干细胞凋亡。为研究激活δ阿片受体对人肝癌细胞凋亡的影响，JIA等用1um DADLE（H2O2专一激动剂）处理肝癌细胞。Annexin V-FITC/PI双染色法及流式细胞仪结果显示经200mM H2O2处理12小时后实验组细胞凋亡率较对照组明显升高，同时，与仅用H2O2处理的细胞相比，经DADLE诱导δ阿片受体激活的肝癌细胞的凋亡率显著下降。另外，经观察，H2O2处理后的细胞中Caspase-3与Caspase-8表达水平迅速提高，而在δ阿片受体激活后则明显下调，且δ阿片受体这种保护效果受纳洛酮的抑制。以上结果意味着δ阿片受体可有效抑制H2O2所诱导的人肝细胞凋亡。
JIA等对肝癌细胞PKC与ERK的磷酸化水平进行检测。他们发现随着δ阿片受体的激活，人肝癌细胞细胞质中PKC与ERK的磷酸化水平大大提高。早期的研究【19】报道了δ阿片受体激活对肝癌细胞的抑制，然而新的实验则发现无论δ阿片受体激活状态如何，PKC通路与ERK通路可提高细胞凋亡率且抑制细胞增殖。以上发现表示，δ阿片受体通过PKC/ERK通路抑制H2O2所诱导的肝细胞凋亡。
2.2 阿片受体在胰腺癌中的研究进展
阿片生长因子作为一种内源性类阿片肽可以通过与其受体（OGFr）形成连接来延迟细胞周期的G1/S期从而调节胰腺癌的进展，并上调细胞周期素依赖性激酶来抑制DNA合成【20】。
早期一系列临床前期实验及Ⅰ期临床试验表明OGF有被运用于晚期胰腺癌治疗中的可能，为更进一步的临床试验提供了理论支持。在Ⅱ期开放性临床试验中【21】，对24名化疗失败的胰腺癌晚期病人每周注射250μg/kg的OFG，运用X线断层摄影术测量肿瘤体积，同时对病人的生存时间及生活质量进行比较。分别在实验组病人开始注射OGF后的第4周和第8周进行血样检验，并与对照组进行比较。实验结果表明，接受了OGF注射的病人的中位生存期相对于对照组延长了两倍。同时，在注射了OGF并存活超过八周的的胰腺癌病人中，62%的病人的肿瘤体积开始趋于稳定或缩小。注射OGF后第4周和第8周的时候，血浆中脑啡肽浓度极大提高，最高接近55pg/ml（对照组为8pg/ml）。另外，并未发现血化学中所出现的副作用，证明了OGF的安全及无毒性。根据接收OGF治疗的病人及其护理人员的反馈，OGF注射并未造成应激或疼痛。
异槲皮苷是红旱莲中的一种提取物，具有显著的抗肿瘤作用，可有效抑制胰腺癌细胞的增殖。为探究其机理，CHEN【22】等利用不同剂量的异槲皮苷处理BxPC-3和AsPC-1细胞，并于48小时后通过RT-PCR和western blot分别检测μ、δ、κ阿片受体的mRNA和蛋白质的表达水平。最初，观察到δ阿片受体在胰腺癌细胞中表达，μ、κ阿片受体则不然。当癌细胞经过治疗量的异槲皮苷，δ阿片受体的基因与蛋白质表达水平与对照组相比明显下降。然而，当加入被激活的δ阿片受体后，异槲皮苷对肿瘤细胞增殖的抑制作用大大减弱。以上实验结果表明，异槲皮苷可通过下调δ阿片受体以抑制胰腺癌细胞的增殖。
2.3 阿片受体在肺癌中的研究进展
2011年，Mathew等【23】发现在非小细胞肺癌病人肺组织标本以及非小细胞肺癌细胞系中μ阿片受体（μ阿片受体）表达增长了5到10倍。其次，μ阿片受体激动剂吗啡与DAMGO大大促进离体lewis肺癌细胞的增殖；使用MNTX沉默μ阿片受体基因表达后Lewis肺癌细胞的浸润与增生速度下降50%-80%。在裸鼠体内，μ阿片受体被沉默使裸鼠肺癌组织大小至少减少一半，并且抑制了65%裸鼠肺癌组织的转移。
2014年，Singleton等【24】收集34个肺癌患者的肺癌组织以及癌旁正常肺组织标本，发现与癌旁正常肺组织比较，肺癌组织中的μ阿片受体明显处于高表达状态。
同年，Frances E. Lennon等【25】分别用不同浓度的DAMGO、吗啡、芬太尼、EGF和IGF处理人H358 NSCLC细胞后，利用细胞功能测定、免疫印迹、免疫共沉淀等方法测定细胞中siRNA、shRNA、化学抑制剂及过量表达载体。
期刊文章分类查询,尽在期刊图书馆实验结果显示，活化μ阿片受体对H358 NSCLC细胞增殖、迁移及间质化得促进作用与P13K信号通路的激活有关。
相关实验均证明，μ阿片受体的活化及过表达可显著促进肺癌细胞的增殖与转移能力。然而，Kuzumaki N【26】发现κ阿片受体（KOR）的活化可通过激活磷酸化糖原合成酶激酶3β（p-GSK3β）抑制非小细胞肺癌的增值能力。
2.4 阿片受体在乳腺癌中的研究进展
Zagon等于2013年、2014年报道，阿片受体存在于许多乳腺癌细胞株中，可通过调控细胞周期与调控P21基因表达抑制乳腺癌细胞的增生能力【27,28】。
早在1996年，Hatzoglou等【29】阿片受体受阿片受体激活剂激活后抑制T47D乳腺癌细胞的增生，然而μ阿片受体吗啡的抑制作用途径却与μ阿片受体的激活无关。2014年，Afsharimani等【30】将小鼠分为吗啡静脉注射组与盐静脉注射组，发现吗啡可以明显抑制肿瘤的增生和迁移，可降低MMP-9/TIMP-1比率。
A118G是μ阿片受体基因中的一个突变位点，其变异不仅可引起病人对μ阿片受体阿片类药物的药效出现个体差异，而且对乳腺癌患者也有影响。2012年，Bortsov等【31】研究报道，G等位基因可以降低美国乳腺癌患者的死亡率，且阿片类药物可增加乳腺癌患者的生存率。然而，Cieslinska等【32】G等位基因可减少乳腺癌患者的死亡率。
3. 总结与展望
综上所述，阿片受体在抗肿瘤方面起着重要角色，阿片受体基因表达水平对癌细胞的生长、增殖、侵袭与转移起着显著的调控作用，其机制与沉默癌细胞基因表达、阻断细胞周期及促进癌细胞凋亡有关，这为癌症的治疗提供了一个新的方向，同时对癌症诊断也有一定临床意义，但仍然需要更深入的理论研究及临床实验证明以阿片受体为切入点的癌症治疗的可靠性与安全性，另外，阿片受体在各类癌症中所扮演角色及作用机制的差差异及共性需更进一步大量系统性的研究。
【1】Brownstein MJ. A brief history of opiates, opioid peptides, and opioid peptides , and opioid receptors[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993,90:5391
【2】Pert CB, Snyder SH. Properties of opiate-receptor binding in rat brain [J]. Proc Natl Acad Sci. USA 1973;70:2243–7.
【3】Simon EJ, Hiller JM, Edelman I. Stereospecific binding of the potent narcotic analgesic （3H） Etorphine to rat-brain homogenate [J]. Proc Natl Acad Sci USA 1973;70:1947–9.
【4】Martin WR. The effect of morphine- and nalorphine-like drugs in the nondependent and morphine-dependent chronic spinal dog [J]. J Pharmacol Exp Ther, 1976,197:517.
【5】Gilbert PE, Martin WR. The effects of morphine- and nalorphine-like drugs in the nondependent, morphine-dependent and cyclazocine-dependent chronic spinal dog [J]. J Pharmacol Exp Ther, 1976,198:66.
【6】何晓龙，路长林. 阿片受体的分子生物学研究[J].生理科学进展,1995,26（4）: 341-343
【7】Chaturvedi K, Christoffers KH, Singh K, et al. Structure and regulation of opioid receptors [J]. Biopolymers 2000;55:334–46.
【8】Kuhar MJ, Pert CB, Snyder SH. Regional distribution of opiate receptor binding in monkey and human brain [J]. Nature 1973;245:447–50.
【9】Evans CJ, Ketith DE, Morrison H, et al. Cloning of a delta opioid receptor by functional expression [J]. Science, 1992; 258（5090）: 1952-1955
【10】Kieffer BL, Befort K, Gaveriaux-Ruff C, et al. The δ-opioid receptor: isolation of a cDNA by expression cloning and pharmacological characterization [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992; 89（24）: 12048-12052.
【11】Wang JB, Imai Y, Eppler CM, et al. μ Opiate receptor : cDNA cloning and expression [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993; 90（21）: 10230-10234
【12】Chen Y, Mestek A, Liu J, et al. Molecular cloning and functional expression of a μ-opioid receptor from rat brain [J]. Mol Pharmacol, 1993; 44（1）: 8-12
【13】Yasuda K, Raynor K, Kong H, et al. Cloning and functional comparison of κ and δ opioid receptors from mouse brain [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1993; 90（14）: 6736-6740
【14】Hughes J, Smith TW, Kosterlitz HW, et al. Identification of two related penta peptides from the brain with potent opiate agonist activity[J]. Nature, 1975, 258（5536）: 577-580.
【15】Zagon IS, Ruth TB, Mclauqhlin PJ. Nucleocytoplasmic distribution of opioid growth factor and its receptor in tongue epithelium[J]. Anat Rec A Discov Mol Cell Evol Cell Evol Biol, 2005, 282(1): 24-37.
【16】Lu J, Liu Z, Zhao L, et al. In vivo and in vitro inhibition of human liver cancer progress by downregulating of the μ-opioid receptor and relevant mechanisms[ J ]. Oncology Reports, 2013, 30(4): 1731-1738
【17】Tang B，Li Y，Yuan S，et al． Upregulation of the delta opioid re-ceptor in liver cancer promotes liver cancer progression both in vitro and in vivo［J］． Int J Oncol，2013，43( 4) : 1281-1290．
【18】Jia K, Sun D, Ling S, et al. Activated δ-opioid receptors inhibit hydrogen peroxide-induced apoptosis in liver cancer cells through the PKC/ERK signaling pathway [J]. Mol Med Rep, 2014, 10(2): 839-847
【19】Tang B, Zhang Y, Liang R, Yuan P, Du J, Wang H and Wang L: Activation of the δ-opioid receptor inhibits serum deprivation-induced apoptosis of human liver cells via the activation of PKC and the mitochondrial pathway. Int J Mol Med. 28:1077–1085. 2011.
【20】Zagon IS, McLaughlin PJ. Opioid growth factor and the treatment of human pancreatic cancer: A review. World J Gastroenterol , 2014; 20(9): 2218-2223
【21】Smith JP, Bingaman SI, Mauger DT, Harvey HH, Demers LM, Zagon IS. Opioid growth factor improves clinical benefit and survival in patients with advanced pancreatic cancer. Open Access J Clin Trials 2010, 2010: 37-48.
【22】Chen Q, Li P, Xu Y, Li Y, Tang B. Isoquercitrin inhibits the progression of pancreatic cancer in vivo and in vitro by regulating opioid receptors and the mitogen-activated protein kinase signaling pathway[J]. Oncology Report, 2015, 33: 840-848.
【23】Mathew B，Lennon F E，Siegler J，et al. The novel role of the mu opioid receptor in lung cancer progression: a laboratory investigation[J]. Anesth Analg，2011，112(3):558-567.
【24】Singleton P A， Mirzapoiazova T， Hasina R， et al. Increased mu-opioid receptor expression in metastatic lung cancer[J]. Br J Anaesth，2014，113 Suppl 1:i103-i108.
【25】Lennon F E， Mirzapoiazova T， Mambetsariev B， et al. The Mu opioid receptor promotes opioid and growth factor-induced proliferation，migration and Epithelial Mesenchymal Transition (EMT) in human lung cancer[J]. PLoS One，2014， 9(3):e91577.
【26】Kuzumaki N，Suzuki A，Narita M，et al. Effect of kappa-opioid receptor agonist on the growth of non-small cell lung cancer (NSCLC) cells[J]. Br J Cancer，2012，106(6):1148-1152.
【27】Zagon IS, Porterfield NK, Mclaughlin PJ. Opioid growth factor - opioid growth factor receptor axis inhibits proliferation of triple negative breast CancerJ. Exp Biol Med (Maywood), 2013, 238 (6): 589-99.
【28】Mclaughlin PJ, Zagon IS. Novel treatment for triple-negative breast and ovarian Cancer: endogenous opioid suppression of women's cancersJ. Expert Rev Anticancer Ther, 2014, 14(3): 247-50.
【29】Hatzoglou A, Bakogeorgou E, Castanas E. The antiproliferative ef-fect of opioid receptor agonists on the T47D human breast Cancer cell line,is partially mediated through opioid receptorsJ. Eur J Pharmacol, 1996, 296(2): 199-207.
【30】Afsharimani B, Baran JA, Watanabe SA, et al. Morphine and breast tumor metastasis: the role of matrix-degrading enzymesJ. Clin Exp Metastasis, 2014, 31(2): 149-58.
【31】Bortsov AV, Millikan RC, Belfer IA, et al. mu-Opioid receptor gene a118G polymorphism predicts survival in patients with breast CancerJ. Anesthesiology, 2012, 116(4): 896-902.
【32】Cieslinska A, Sienkiewicz-Szlapka E, Kostyra E, et al. mu-Opioid receptor gene(OPRM1)polymorphism in patients with breast Cancer［J. Tumour Biol, 2015(11): 125-7.
论文作者:柳卓男,,孟静娟
论文发表刊物:《医师在线》2017年7月下第14期
论文发表时间:2017/11/1
标签：阿片论文; 受体论文; 细胞论文; 肝癌论文; 抑制论文; 肺癌论文; 吗啡论文; 《医师在线》2017年7月下第14期论文;