王大虎[1]2011年在《端粒酶和PinX1基因在食管癌中的表达及生物学意义》文中研究表明目的:食管癌(esophageal carcinoma, EC)是全世界最常见的消化道恶性肿瘤之一,我国的食管癌发病率较高,河北省磁县更是食管癌的高发区,严重影响着人们的生活质量和生命健康。端粒、端粒酶在肿瘤细胞的永生化和演进中扮演重要角色。端粒酶的激活可以导致细胞无限制地增殖和肿瘤的发生。端粒(telomere)作为分子钟控制着人类细胞的复制与衰老,与细胞的寿命密切相关。正常细胞每次分裂,端粒DNA长度会缩短55～200 bp,经历多次分裂后缩短至其下限时,细胞最终凋亡或死亡。端粒酶(telomerase)是一种以自身RNA为模板的逆转录酶,其核心组分之一端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase , hTERT)是端粒酶发挥活化作用的重要途径,它的表达调控在端粒酶活性调节中起关键作用,是细胞呈现端粒酶活性的决定因素。已有大量研究发现,在恶性肿瘤的发生中存在有端粒DNA长度的缩短,并且端粒酶的激活维持了大多数组织的端粒长度,抵消了细胞分裂导致的端粒DNA消耗。说明端粒缩短在恶性肿瘤的演变中起重要作用。已有大量研究表明,人体正常细胞除少量细胞如精原细胞、胚胎细胞、干细胞外,大多数细胞的端粒酶几乎都是无活性的,而与之相反在绝大多数恶性肿瘤中端粒酶活性高表达,表达率高达90%以上。因此端粒酶的活化可能是恶性肿瘤发生发展的多种基因改变中起到了至关重要的作用,并且可以作为最具普遍性和特异性的肿瘤分子标记物,在肿瘤的诊断和治疗中具有重要的地位。而抑制端粒酶的活性,将有可能阻止肿瘤细胞恶性增殖,这种特性使端粒酶成为当今肿瘤诊治研究的热点。本实验利用了多项实验方法检测端粒DNA长度、端粒酶hTERT蛋白含量及细胞内DNA含量在食管癌高发区现场人食管癌、异型增生及正常食管的表达,探讨与食管癌发生及生物学行为的关系,试图为食管癌的早期诊断提供客观参考指标,并为揭示食管癌的发生、发展的机制提供理论依据。采用端粒重复序列扩增反应(TRAP)-ELISA和TRAP -银染法半定量技术,检测食管癌及异型增生组织中端粒酶活性的表达,探讨端粒酶活性与食管癌发生发展及其与临床病理因素的关系。PinX1基因作为端粒酶的内源性抑制基因,近年来被认为是一种潜在的抑癌基因,其表达可能与多种肿瘤的发生发展有关。有实验证实在胃癌、大肠癌及白血病患者中PinX1表达明显下降,端粒酶活性增强。但是也有研究显示PinX1在肝癌细胞中的表达与正常组织无显着差异,而与之相应的是此类肿瘤中大部分端粒酶活性也增强。目前PinX1基因在肿瘤细胞中的作用和对端粒酶活性的调控及在细胞癌变中的机制尚不十分清楚。有关PinX1基因在食管癌中的研究国内外也鲜有报道。PinX1基因的作用越来越引起人们的重视,但到目前为止,PinX1基因在食管癌中生物学意义、作用机理国内外的报道很少,并且没有适合研究PinX1基因的食管癌细胞模型。由于基因转染已经成为治疗肿瘤等基因表达异常的有效手段,那么,通过外源性过表达PinX1基因能否抑制食管癌细胞的增殖?是否可以抑制端粒酶活性?本实验中利用多项技术,应用细胞模型研究PinX1在人食管癌、异型增生组织及正常食管组织中的表达,探讨PinX1与食管癌发生发展及与食管癌临床分期、病理分型及预后的相关性,并分析与端粒酶活性表达的相关性。研究转染PinX1基因前后细胞增殖凋亡等的变化,初步了解该基因对食管癌细胞的生物学影响。同时我们应用TRAP-ELISA和TRAP-银染法检测转染前后Eca109细胞端粒酶活性的变化,进一步探讨PinX1基因与端粒酶的关系。方法:1端粒DNA长度及端粒酶hTERT在食管癌高发区人群中的表达及生物学意义收集采集自河北省磁县食管癌高发区现场的咬检组织1000例,所有患者未接受过化疗和放疗。从中选取130例,根据病情分为3组,第1组为正常食管组织36例,第2组为异型增生组织50例,第3组为食管鳞癌组织44例。经病理组织学诊断,50例异型增生食管粘膜组织中,22例为轻度增生组织,28例为重度增生组织;44例食管鳞状细胞癌中,20例为高分化鳞癌、11例为中分化鳞癌,13例为低分化鳞癌,25例侵及纤维膜及周围软组织,19例未侵及纤维膜;20例为淋巴结转移,24例为无淋巴结转移。采用流式细胞术方法(flow cytometry, FCM)和免疫组织化学方法(immunohistochemistry, IHC)检测测端粒DNA长度、端粒酶hTERT蛋白含量及细胞内DNA含量在食管癌高发区现场人食管癌、异型增生及正常食管的表达,分析与食管癌发生及与临床病理特征的关系。2食管癌中的端粒酶活性和PinX1的表达及其生物学意义收集食管鳞状细胞癌手术切除标本130例,每例标本分别取癌组织、癌旁组织(距癌边缘2-5cm)及手术切缘正常食管粘膜(距癌边缘5cm以上)。从中选取50例食管鳞状细胞癌、异型增生及正常食管粘膜组织。经病理组织学诊断,50例食管鳞状细胞癌,39例为高中分化鳞癌,11例为低分化鳞癌,34例侵及纤维膜,16例未达到纤维膜,17例淋巴结转移,33例未转移。采用逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、流式细胞术方法(flow cytometry, FCM)、TRAP-ELISA和TRAP-银染法检测食管癌组织、异型增生、正常粘膜组织中端粒酶活性和PinX1基因和蛋白的表达,分析端粒酶活性和PinX1表达与食管癌临床病理特征的关系。3基因转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响利用分子生物学技术构建pCDNA3.1(+)-PinX1重组质粒。采用脂质体转染方法将pCDNA3.1(+)-PinX1重组质粒转染Eca109细胞,同时也设置空载体pCDNA3.1转染组。转染72小时后用G418进行稳定转染细胞的筛选,筛选出来的阳性细胞分别命名为Eca109/PinX1、Eca109/pCDNA3.1细胞。应用激光共聚焦方法测定转染效率,MTS方法检测过表达PinX1对Eca109/ PinX1、Eca109/pCDNA3.1、Eca109细胞生长抑制作用。FCM方法检测细胞生长周期和细胞凋亡。RT-PCR、FCM、Western-blot方法检测Eca109/PinX1、Eca109/pCDNA3.1、Eca109细胞中PinX1基因及蛋白的表达,TRAP-ELISA和TRAP-银染法检测端粒酶活性在细胞中表达。结果:1端粒DNA长度及端粒酶hTERT在食管癌高发区人群中的表达及生物学意义FCM检测端粒长度结果显示,端粒DNA长度在食管癌组织中表达量与正常食管组织相比明显缩短,在食管正常组织、异型增生组织、癌组织的表达量呈现逐渐降低趋势(P<0.01);端粒DNA长度在食管轻度增生、重度增生之间呈逐渐降低趋势,重度增生组与轻度增生组相比明显缩短(P<0.01),轻度增生组与正常组比较无显着性差异(P>0.05)。随着细胞学分级增高,端粒DNA长度Q-FISH值逐渐降低,端粒DNA长度与细胞学分级呈负相关(r=-0.79, P <0.01)。FCM检测端粒酶hTERT基因蛋白含量,在癌、重度增生、轻度增生和正常食管的FI值分别为1.84±0.21、1.39±0.24、1.13±0.19和0.87±0.18,癌组hTERT含量高于重度增生组(P <0.01)、重度增生组高于轻度增生组(P<0.01),轻度增生组与正常组相比无显着性差别。随着细胞学分级增高, hTERT的FI值随之升高, hTERT蛋白含量与细胞学分级呈正相关关系(r=0.83, P<0.01)。根据FI值>1.0为阳性表达的判断标准,轻度增生组、重度增生组和癌组hTERT蛋白阳性表达率分别为68.18%、92.86%和95.45%,重度增生组和癌组的表达率都高于轻度增生组(P<0.01)。FCM检测正常组、轻度增生组、重度增生组和癌组细胞DNA含量,DI值分别为1.03±0.34、1.06±0.28、1.17±0.25和1.54±0.37,正常组、轻度增生组和重度增生组的DI值呈上升趋势(P>0.05),癌组的DI值明显高于重度增生组。DI值与细胞学分级正相关(r=0.62, P<0.01);正常组、轻度增生组、重度增生组和癌组DNA异倍体率分别为11.11(4/36)、9.09(2/22)、28.57(8/28)和81.82(36/44),癌组异倍体率高于重度增生组(P<0.01),重度增生组高于轻度增生组(P<0.05);从正常组到癌组PI值分别为10.98±4.11、14.15±4.76、18.97±5.27和28.79±5.47,随着细胞学分级的升高,PI值增大,癌组显着高于重度增生组(P<0.01),重度增生组高于轻度增生组(P<0.05)。PI值与细胞学分级正相关(r=0.64, P<0.01)。130例食管样本的DI值与PI值高度正相关(r=0.76, P<0.01);端粒长度Q-FISH值与端粒酶hTERT蛋白FI值负相关(r=-7.49, P<0.01);端粒Q-FISH值与DI值负相关(r=-0.41, P<0.01)。IHC结果显示:端粒酶hTERT蛋白阳性颗粒呈棕黄色,阳性物质全部位于上皮细胞和癌细胞的核内。在异型增生组织,端粒酶hTERT蛋白的阳性表达部位主要集中在基底细胞层及其上方的细胞核内,随着食管黏膜上皮增生程度的加重,hTERT阳性细胞逐渐增多,阳性细胞带上移。正常食管粘膜组织中阳性表达率为11.1%(4/36),异型增生组织和癌组织hTERT蛋白阳性表达率分别为44.0%(22/50)和86.37%(38/44)。叁者阳性率比较,癌组织显着高于异型增生组织(P<0.01),异型增生组织高于正常上皮组织(P<0.01)。2食管癌中的端粒酶活性和PinX1的表达及其生物学意义端粒酶活性检查结果显示,在食管癌、异型增生和正常食管组织中,阳性表达率分别为84.0%、62.0%及6.0%,食管癌及异型增生组织与正常食管粘膜比较具有显着统计学差异(P<0.05)。端粒酶活性的平均A值分别为食管癌组织1.457±0.838、食管异型增生组织0.429±0.346和正常食管粘膜组织0.073±0.039。叁组间两两比较端粒酶活性的平均A值均存在高度显着统计学差异(P<0.05)。按正常食管粘膜组织、食管异型增生组织和食管鳞癌组织的序列,端粒酶阳性表达率和平均A值依次明显增高。食管癌组织中端粒酶阳性表达率与组织学分级和淋巴结转移无关,而端粒酶活性的平均A值与组织学分级和淋巴结转移有关;食管癌组织中端粒酶阳性表达率及端粒酶活性的平均A值与其他临床病例因素如年龄、性别和浸润深度等无关。RT-PCR及FCM检测PinX1结果显示,PinX1 mRNA及蛋白在食管癌组织中表达均显着低于食管正常粘膜(P <0.01),在食管正常粘膜、异型增生、癌组织之间呈现逐渐降低趋势(P <0.05)。食管癌组织中,PinX1 mRNA和蛋白与分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移密切相关(P <0.05),与性别和年龄无明显相关(P >0.05)。食管癌组织中端粒酶活性表达与PinX1蛋白表达呈负相关性(rs =-0.883,P=0.000)。3基因转染PinX1对食管癌Eca109细胞增殖和凋亡以及端粒酶活性的影响应用脂质体转染方法,将pCDNA3.1(+)-PinX1重组质粒及空载体pCDNA3.1成功转染入Eca109细胞中,并应用G418成功筛选出稳定转染细胞,转染pCDNA3.1- PinX1重组质粒与空载体pCDNA3.1的阳性克隆细胞分别记为Eca109/ PinX1、Eca109/pCDNA3.1细胞。MTS法测定增殖情况结果显示,转染PinX1基因后,Eca109细胞生长明显减慢(P<0.05);而Eca109细胞与仅转染入空载体的Eca109细胞生长比较,两者无明显差异(P>0.05)。FCM测定细胞生长周期实验结果显示,转染PinX1基因的Eca109细胞的G_0/G_1期细胞数(%)为70.58±5.26,明显高于未转染或仅转染空载体的食管癌Eca109细胞的G_0/G_1期细胞数(%)(分别为53.14±4.83及47.27±3.73)(P<0.05)。说明转染PinX1基因后,细胞的增殖明显变慢,细胞生长阻滞于G_0/G_1期(Fig. 3-9)。FCM测定细胞凋亡实验结果显示,流式细胞仪检测细胞凋亡表明:转染PinX1基因的Eca109细胞的凋亡率(%)为23.28±5.73,明显高于未转染或仅转染空载体的食管癌Eca109细胞的凋亡率(%)(分别为0.27±0.18及3.40±1.09)(P<0.05)。说明转染入PinX1基因后,细胞发生早期凋亡改变。RT-PCR、Western-blot和FCM检测结果显示,Eca109/ PinX1细胞中PinX1 mRNA和蛋白表达水平较Eca109/pCDNA3.1、Eca109细胞显着升高(P <0.05)。细胞端粒酶活性的检测结果显示,转染PinX1基因后,细胞端粒酶活性明显降低(P<0.05)。转染前后Eca109中端粒酶活性表达与细胞增殖指数(PI)表达呈正相关性(rs=0.451,P=0.000)。结论:1端粒DNA长度在食管癌前细胞及癌细胞中明显缩短,并且随病变程度加重而递减。端粒酶hTERT、细胞内DNA含量和PI值在食管上皮癌变发生中明显递增,提示食管癌变与叁者密切相关。端粒DNA长度、端粒酶hTERT在食管癌前病变早期即出现变化,可以做为监测食管癌发生发展的参考指标。端粒酶hTERT与食管癌的临床病理特征无关,不能做为食管癌病人预后的指标。端粒缩短、端粒酶hTERT高表达都与食管癌变密切相关,有望以上述二者为靶点指导抗肿瘤的基因治疗。2食管癌及异型增生组织中存在端粒酶活性表达,并存在量的差异。端粒酶活性在异型增生即呈现高表达,随着病变的加重,端粒酶活性依次显着增高,提示端粒酶参与了食管癌的发生与发展,端粒酶的激活是食管癌的早期事件。端粒酶可望成为食管癌的病情监测及早期诊断的生物学指标。端粒酶活性A值与食管癌的组织学分级和淋结转移有关,提示食管癌端粒酶活性A值可作为判断疗效和评价预后的指标。PinX1在食管癌组织中表达显着低于食管正常组织,在食管正常组织、异型增生组织、癌组织之间呈现逐渐降低趋势。PinX1在食管癌中表达和病理分级呈负相关,分级越高,PinX1表达越低。浸润深度达到纤维膜者、有淋巴结转移者的PinX1表达要低于浸润深度未达到纤维膜者、无淋巴结转移者。认为PinX1是一种潜在的食管癌相关基因,检测PinX1的表达水平可能对评价食管癌恶性程度、转移潜能和预后评估有重要的临床价值。食管癌组织中端粒酶活性与PinX1表达呈显着负相关性,证实PinX1抑制端粒酶活性。3首次应用脂质体转染方法建立食管癌细胞株Eca109/PinX1,目前国内外文献尚未见相关报道。Eca109细胞转染PinX1基因后,细胞的增殖明显变慢,细胞生长阻滞于G_0/G_1期,细胞发生早期凋亡改变。Eca109细胞转染PinX1基因后,端粒酶活性明显降低,并且端粒活性与细胞增殖指数呈显着正相关,考虑在食管癌细胞中PinX1基因通过降低端粒的活性,减弱细胞的增殖,有望成为食管癌治疗的分子靶点。
葛莲英[2]2010年在《端粒酶与大肠癌相关性及RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的研究》文中认为在我国,消化道恶性肿瘤中大肠癌发病占有很高的比率。目前以手术治疗为主的综合治疗仍存在局限性,疗效不尽人意。因此,能否找到一个有效的分子治疗靶点,是丰富大肠癌治疗方法和最终应用于临床提高综合疗效的关键。有研究表明,大肠癌标本中端粒酶活性表达高达85%以上,而正常组织表达仅5%左右。端粒酶全酶由端粒酶RNA (hTR)、端粒酶相关蛋白(TPI)和端粒酶催化亚基(hTERT)叁部分组成。hTR和TPI在正常组织和肿瘤组织均有表达,与端粒酶活性无相关性。而hTERT与端粒酶的活性相一致,hTERT基因是合成端粒酶全酶的限速因素,与肿瘤的关系尤为密切,因此将端粒酶作为肿瘤分子靶点的研究是极有意义的研究领域。本研究从本院临床收集30例大肠癌组织、癌旁组织及正常大肠组织,通过对端粒酶活性的检测,探讨端粒酶与大肠癌的相关性,并进一步验证端粒酶催化亚基(hTERT)的表达是否与端粒酶活性一致。同时回顾性分析本院178例大肠癌患者病理标本中hTERT表达水平和临床病理学参数之间的相关性；通过临床随访资料分析,阐明影响大肠癌患者生存预后的风险因素,明确hTERT能否作为判断大肠癌预后的标志物及作为大肠癌治疗的分子靶点。通过RNAi沉默技术,观察hTERT沉默对大肠癌细胞生长增殖和凋亡的影响,最终阐明hTERT基因RNAi沉默技术对大肠癌靶向治疗的可行性。本研究将从细胞、分子和整体水平上,为开展大肠癌hTERT基因靶向治疗提供实验和临床依据。第一部分端粒酶与大肠癌相关性研究第一章端粒酶活性与大肠癌相关性研究目的探讨端粒酶与大肠癌相关性,进一步验证端粒酶催化亚基(hTERT)的表达是否与端粒酶活性一致。方法运用PCR-TRAP-ELISA及免疫组织化学方法对大肠癌组织及其癌旁组织、大肠正常组织各30例检测端粒酶活性、hTERT的表达水平,并研究端粒酶与临床病理学特征之间的关系。结果(1)端粒酶阳性检出率在大肠癌组织、癌旁组织、大肠正常组织分别为83.33%13.33%3.33%,癌组织中检出率明显高于其他组织(P<0.05)。(2)大肠癌组织端粒酶活性随组织分化程度变低而升高,低分化大肠癌组织中的端粒酶阳性表达率高于中分化及高分化大肠癌(P<0.05)。(3)通过用免疫组化检测hTERT的表达与PCR-TRAP-ELISA法检测得端粒酶活性相比较,显示端粒酶活性与hTERT表达具有一致性,两法检测无显着差异。结论(1)大肠癌组织端粒酶阳性率明显高于癌旁组织及正常大肠组织,大肠癌组织中hTERT表达高于癌旁组织及正常组织。(2) hTERT的表达与端粒酶活性一致。第二章端粒酶催化亚基与大肠癌预后因素分析目的通过对178例大肠癌患者的临床资料回顾性分析,阐明hTERT表达水平与大肠癌临床病理特征及预后的关系,为大肠癌患者的预后评估提供一定的理论指导。方法选取有完整临床资料的178例大肠癌石蜡包埋组织标本及60例癌旁组织标本作为实验组,30例大肠正常组织石蜡包埋标本作为对照组。采用免疫组化的方法检测大肠癌组织中hTERT蛋白表达水平。查阅病例获得相关临床参数资料及随访资料,分析hTERT表达水平与大肠癌进展及临床预后的关系。结果(1) hTERT蛋白在大肠癌组、癌旁组与大肠正常组中阳性率分别为94.4%、6.67%、3.33%,其差异有统计学意义(P<0.001);(2) hTERT在大肠癌组织中的表达与性别、年龄、淋巴结转移、肿瘤直径无关(P>0.05),与肿瘤分化程度、浸润深度、Dukes分期、临床分期及远处转移有关(P<0.05)。(3)经多因素Cox模型分析,不同浸润深度、远处转移、淋巴结转移、hTERT表达4项指标是影响大肠癌患者术后预后的独立危险因子；hTERT表达水平与患者术后无瘤生存时间呈负相关。结论hTERT在大肠癌组织中呈高表达。经多因素Cox分析,大肠癌浸润深度、远处转移、淋巴转移、hTERT表达与大肠癌患者预后存在显着性相关,是影响预后的危险因子。大肠癌组织中hTERT高表达者预后相对较差,低表达者预后相对较好。第二部分RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的实验研究第一章hTERT基因shRNA真核表达载体的构建目的构建人端粒酶催化亚基(hTERT)基因shRNA真核表达载体质粒,为大肠癌RNAi介导的基因治疗打下基础。方法化学合成3条hTERT基因siRNA,通过脂质体转染大肠癌细胞SW480,48h后采用RT-PCR方法筛选出一条对hTERT mRNA有明显沉默作用的siRNA。将筛选出的siRNA设计并合成shRNA寡核苷酸片段,退火形成双链后,插入到pGPU6/GFP/Neo真核表达载体中,并进行酶切和测序鉴定。结果酶切和DNA测序证实构建的ShRNA已插入载体中。结论成功构建的hTERT基因shRNA真核表达载体pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA,为进一步开展hTERT基因在人大肠癌细胞中的作用机制及体内外RNAi实验研究奠定了基础。第二章RNAi沉默hTERT基因对大肠癌SW480细胞生物学特性的影响目的观察hTERT基因对SW480细胞生物学特性的影响。方法将重组质粒pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA (hTERT-shRNA)用脂质体转染法导入SW480大肠癌细胞,含无效序列的pGPU6/GFP/Neo-NC shRNA (NC-shRNA)作为阴性对照,单纯SW480细胞作为空白对照,等量转染试剂脂质体作为脂质体对照组,分别于转染后24h、48h、72h,在荧光显微镜下观察重组质粒转染效率和细胞形态学变化。采用MTT法检测各组细胞的生长增殖情况,RT-PCR法检测不同转染时间细胞hTERT mRNA的表达水平,免疫细胞化学法检测hTERT特异性蛋白表达；PCR-TRAP-ELISA法检测转染后48小时端粒酶活性；流式细胞仪检测转染后细胞周期分布,TUNEL法和透射电镜观察转染后细胞凋亡变化及线粒体膜电位(MMP)的改变检测。结果(1) hTERT-shRNA质粒转染24h、48h及72h比较,转染48h其转染效率明显高于24h和72h的转染效率,质粒与脂质体比例为1：2.5时,其转染效率显着高于其它各组,转染率达59%。(2)MTT检测结果显示：hTERT-shRNA质粒转染组对SW480细胞的生长增殖有明显抑制作用,于转染后第2d达到峰值,增殖率减少达28.22%,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。(3)半定量RT-PCR结果显示,转染48小时的hTERT-shRNA组的hTERT mRNA表达量明显低于转染24h和72h组的表达量。转染48小时的hTERT-shRNA组和空白对照组、脂质体对照组、NC-shRNA组比较,其抑制率分别是39.20%,33.28%,27.95%。(4)免疫细胞化学结果示：hTERT-shRNA组染色阳性细胞明显少于对照组。经病理图像分析软件进行灰度测量后比较发现,转染48h的hTERT-shRNA组较空白对照组灰度值下降约30.2%,同时和脂质体对照组和NC-shRNA组相比,差异均有明显统计学意义(P<0.01)。(5)PCR-TRAP-ELISA端粒酶活性检测显示：较空白对照组相比,hTERT-shRNA转染组细胞端粒酶活性下降了18.7%,与较其它叁组之间差别均有显着性意义(P<0.05)。(6)流式细胞术检测：与对照组比较,hTERT-shRNA组G0/G1期细胞显着增加。与NC-shRNA组比较,hTERT-shRNA组增殖指数(PI)下降14.2%,差别有显着学意义(P<0.05)。(7) TUNEL法检测：hTERT-shRNA组凋亡细胞数显着多于对照组,因而其凋亡指数较其它组也明显增高,hTERT-shRNA组较空白对照组AI增高20%。(8)转染48h后透射电镜观察：可见凋亡细胞体积明显缩小,表面突起和微绒毛减少,甚至消失,染色质不均匀地地沿核膜下聚集。部分可见细胞核新月体,空泡形成增多。(9)与空白对照组相比,转染48h后线粒体跨膜电位(MMP)显示：hTERT-shRNA组线粒体Rhodamine123荧光强度明显增强(增加约24.2%),MMP显着下降,与对照组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。结论RNAi沉默hTERT基因能有效抑抑制SW480肿瘤细胞生长和增殖,并降低端粒酶活性,诱导肿瘤细胞凋亡。第叁章RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌移植瘤的动物实验研究目的探讨重组pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA质粒对SW480细胞裸鼠移植瘤的生长抑制作用。方法(1)经皮下接种SW480细胞株(1×107个细胞/只)建立裸鼠人大肠癌细胞移植瘤模型。(2)24只裸鼠随机地分为3组,每组8只。以瘤内接种pGPU6/GFP/Neo-hTERT shRNA简称hTERT-shRNA)质粒组为实验组,以瘤内注射pGPU6/GFP/Neo-NC shRNANC (简称NC-shRNA)作为阴性对照,以瘤内注射生理盐水作为空白对照组。(3)观察各组裸鼠皮下肿瘤生长情况,绘制肿瘤生长曲线,计算肿瘤抑制率。(4)治疗结束后取标本进行病理学检查、hTERT mRNA及hTERT蛋白表达分析,端粒酶活性及组织凋亡检测。结果(1)所有裸鼠均于7天后可见皮下肿瘤形成。(2) hTERT-shRNA组裸鼠肿瘤生长较慢,生理盐水对照组和NC-shRNA阴性对照组裸鼠肿瘤仍较快增大。(3)hTERT-shRNA组肿瘤组织切片HE染色,部分肿瘤可见大片坏死区,细胞结构消失。生理盐水组和NC-shRNA组肿瘤生长良好,细胞形态不规则,可见病理性核分裂相。(4)半定量RT-PCR检测hTERT mRNA水平,发现hTERT-shRNA组较生理盐水对照组和NC-shRNA阴性对照组分别下降52.1%和48.3%,差异具有显着性意义(P<0.01)。(5)免疫组化结果表明：hTERT-shRNA组肿瘤组织中hTERT阳性细胞明显减少,蛋白表达下调。hTERT蛋白平均灰度较生理盐水组和NC-shRNA组分别降低19.9%和14%。(6)端粒酶活性检测表明,pGPU6/GFP/Neo-hTERT组较生理盐水组和NC-shRNA组端粒酶活性明显降低,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。端粒酶活性抑制率分别为48.5%和53.0%。(7)TUNEL法检测发现,hTERT-shRNA组肿瘤细胞凋亡明显多于对照组,AI(凋亡指数)较生理盐水组和NC-shRNA组增加29.4%,31.1%,差异有统计学意义(P<0.01)。结论hTERT基因的shRNA瘤内注射能延缓大肠癌细胞SW480裸鼠皮下移植瘤的生长,其机理可能是通过抑制hTERT mRNA和蛋白的表达、抑制端粒酶的活性、促进肿瘤细胞凋亡而发挥作用。
张静[3]2003年在《恶性肿瘤组织中端粒酶活性表达的临床意义》文中研究说明本研究应用改良的TRAP—银染法检测了多种人类良、恶性肿瘤和血液病患者的端粒酶活性，试图从分子水平揭示肿瘤的发生机制及端粒酶在肿瘤发生发展中的作用，探讨端粒酶活性检测对于肿瘤的早期诊断、鉴别诊断以及对疗效预后评价的意义，分析端粒酶作为良好的肿瘤检测指标的可能；并以此为基础分析和探讨以端粒酶为靶点治疗肿瘤的途径。 本研究检测了226例不同组织(包括147例恶性肿瘤组织、79例良性及癌旁正常组织)的端粒酶活性，对96例血液病及51例胸腔积液的端粒酶活性进行了研究分析。比较分析了端粒酶活性与肿瘤生物学行为及临床资料的相关性；对比研究了化疗前后的乳腺癌端粒酶活性表达情况。此方法简便实用，对肿瘤诊断的灵敏度83％，特异性88.6％，阳性准确率达96.8％，足以满足临床标本的检测要求，为医生和肿瘤患者提供诊断治疗的依据。 结果表明：1)恶性肿瘤组织147例中122例端粒酶表达呈阳性，其中肺癌端粒酶活性阳性率86.84％，食管癌94.74％，肾癌88.88％，乳腺癌和直肠癌分别为72.13％和87.50％，甲状腺瘤、黑色素瘤及宫颈癌组织端粒酶活性均呈阳性表达。35例癌旁正常组织端粒酶活性表达阳性率11.43％(4／35)，非恶性肿瘤组织阳性率11.37％(5／44)。63例白血病端粒酶活性表达51例阳性(80.95％)，其他33例血液病端粒酶活性阳性率仅15.15％。2)伴淋巴结转移的恶性肿瘤组织的端粒酶活性(95.83％)与淋巴结未转移组(86.67％)无显着性差异。我们注意到69例男性及78例女性肿瘤病人的端粒酶活性表达阳性率分别为82.61％和83.33％，差别无显着性。3)乳腺癌化疗前端粒酶活性阳性率94.12％(32／34)，化疗后仅为44.44％，差别有显着性意义。4)恶性胸水的端粒酶活性表达阳性率为80.00％，且比传统细胞学检查灵敏度高，而非恶性胸腔积液阳性率仅为8.33％(3／36)，两者间存在极显着性差异。 以上结果表明：1)恶性肿瘤组织端粒酶活性明显高于良性肿瘤及癌旁组织(P＜0.01)，而良性肿瘤与正常组织无明显差别(P＞0.05)；肺癌、食管癌、乳腺纂硕士学位论文入IA凡T〔R’5 Tfl[515癌、甲状腺瘤，黑色素瘤、宫颈癌、直肠癌及肾癌均有很高的端粒酶检出率和活性:白血病细胞也显示了高于正常白细胞的端粒酶活性(P<0.01)。结果显示端粒酶活性与恶性肿瘤密切相关，且这种相关性有较好的特异性和广谱性;对恶性肿瘤的诊断及鉴别诊断有着重要的参考价值。2)本研究表明端粒酶活性与肿瘤病人的年龄、性别及肿瘤的部位、淋巴结转移情况无相关性:提示端粒酶的激活持续存在于肿瘤的全过程，端粒酶活性可以作为肿瘤早期诊断及预测肿瘤复发的标志物。3)由于胸腔积液等脱落细胞学检查检出率较低，胸腔积液的诊断及鉴别分类比较困难;而端粒酶活性检测有较高的特异性与灵敏性，可作为一个胸腔积液鉴别诊断方法和筛查指标。4)化疗药物对细胞端粒酶活性的影响可以作为化疗敏感性指标以指导临床用药;化疗前后的端粒酶活性的差别可用来评价疗效及预后。进一步提示通过抑制端粒酶活性表达以治疗癌症的可能。
李芳[4]2016年在《端粒酶及VEGF-A与宫颈癌浸润的分子机制研究》文中研究指明子宫颈癌(Cervical cancer)是女性生殖系统最常见恶性肿瘤之一,全世界每年新发病例约为50万,80%以上在发展中国家,已成为发展中国家女性的主要致死性疾病。临床上尚无子宫颈癌高效特异、预后良好的治疗手段。特别是子宫颈癌组织浸润、远处转移等问题严重阻碍了患者的手术治疗,也是后期患者肿瘤复发、预后差的主要原因,严重地降低了患者的存活率。因此,深入研究子宫颈癌浸润、转移的高危因素,探索宫颈癌细胞侵润的分子机制,将有助于子宫颈癌特效治疗手段的研发。现有研究已发现,部分生物学因素与子宫颈癌的发生发展有关。HPV感染与宫颈癌的发病率存在很强的关联性,但不是所有病毒感染人群都会进展为宫颈癌,提示其他因素也能影响宫颈病变的发展进程。人端粒酶是现阶段临床实验室检测肿瘤常用的肿瘤标志物;其由叁个部分组成,分别是人端粒酶逆转录酶(h TERT)、人端粒酶RNA组分(h TERC)和端粒酶协同蛋白(h Tpl);已经发现端粒酶h TERT m RNA的激活与宫颈癌病变的严重程度有明显相关性。同时,HPV持续感染引起人体组织的慢性炎症,分泌种类繁多、作用各异的炎症因子,包括但不限于COX-2、PGE2、IL-1、MMPs、VEGF,这些炎症因子会促使正常细胞的变性,最终可能导致肿瘤的发生。但这些生物学因素与宫颈癌浸润、转移是否有关尚未明确。基于此,本研究首先从子宫颈癌关系密切的临床高危因素出发,使用相关性分析探索与细胞浸润密切相关的生物学因素,包括HPV病毒、端粒酶以及炎症因子等,试图从大体上明确影响宫颈癌浸润的高危因素;然后,进一步使用分子生物学手段确定这些相关因素与宫颈癌浸润之间的相互作用关系;最终明确导致宫颈癌浸润、转移的生物学因素,加深对宫颈癌发生发展机制的理解,为子宫颈癌特效治疗手段的研发奠定基础。具体研究分为下列叁个部分:第一部分子宫颈癌浸润与HPV感染、端粒酶、炎症因子等相关高风险因素的相关性分析目的:探索与子宫颈癌浸润密切相关的生物学因素。方法:收集正常宫颈组织(NCE)20例,宫颈上皮内瘤样病变II以上(CIN II或III)20例及宫颈鳞癌组织(SCC)20例。PCR法检测上述各种组织中HPV的感染情况;TRAP-PCR法检测组织中端粒酶活性水平;ELISA法检测宫颈鳞癌和正常宫颈组织中炎症因子(VEGF-A、IL-6、MMP-9、TNF-α、BCL-2及IL-1β)的表达情况。实验结果及其他临床高危因素分别与宫颈癌发展浸润程度进行相关性分析。结果:CIN和SCC组织均为高危HPV(HPV-16和18)阳性,部分正常组织也为高危HPV阳性。端粒酶活性及h TERT m RNA在宫颈癌、CINⅡ以上病变中明显异常扩增,但是在正常宫颈组织中几乎不出现异常扩增;且h TERT m RNA异常表达水平与宫颈病变的严重程度呈显着正相关(p<0.0001)。在六个代表性的炎症因子中,VEGF-A及其m RNA表达水平与宫颈病变程度正相关(p<0.001)。而且VEGF-A与端粒酶水平见存在正相关。结论:癌症组织端粒酶及炎症因子VEGF-A分别与宫颈癌浸润程度高度正相关。第二部分VEGF对子宫颈癌Hela细胞株的细胞动力学的影响目的:研究VEGF-A对子宫颈癌Hela细胞株的细胞动力学的影响。方法:选取体外培养宫颈癌Hela细胞株,依据RNAi原理,获得针对VEGF-A基因的si RNA,并转染体外培养的Hela细胞。观察其能否特异、高效的抑制细胞中VEGF-A基因及蛋白的表达,及其对Hela细胞增殖能力的影响。结果:利用si RNA技术成功的抑制了Hela细胞株中VEGF-A基因及蛋白的表达,同时Hela细胞在生长、增殖能力有明显的抑制。结论:VEGF-A参与了宫颈癌Hela细胞株的生长增殖。第叁部分端粒酶对宫颈癌hela细胞VEGF-A分泌的影响及其机制研究目的:本实验通过体外实验研究端粒酶h TERT与VEGF在人乳头状瘤病毒阳性宫颈癌细胞的关联性,了解宫颈癌侵润发展的潜在分子机制。方法:分别采用q RT-PCR、ELISA和TRAP-ELISA检测多种宫颈癌细胞系端粒酶和端粒酶h TERT(端粒酶的限速基因),VEGF m RNA和其蛋白的表达水平。为了探寻端粒酶对宫颈癌细胞VEGF-A分泌的作用,分别构建h TERT sh RNA质粒和过表达质粒用于He La细胞端粒酶的抑制和过表达实验。同时研究HPV E6和E7在端粒酶影响VEGF表达中的作用。结果:Hela细胞的端粒酶和VEGF表达水平都很高,且两者间存在正相关,可用于后续实验。抑制h TERT表达下调Hela细胞VEGF的表达,而h TERT的过表达则上调HPV-18阳性细胞VEGF的表达。此外,HPV E7癌基因蛋白在端粒酶上调VEGF过程是一个必要条件。结论:端粒酶不直接影响宫颈癌细胞的浸润和转移;但它可通过HPV E7蛋白影响VEGF的表达,间接促进宫颈癌细胞浸润。本研究探索了宫颈癌浸润与转移的发生机制,进一步明确了宫颈癌的发病机制,同时为宫颈癌的干预治疗奠定了理论基础。
李永胜[5]2004年在《脑胶质瘤端粒酶活性表达及其亚单位基因表达的研究》文中进行了进一步梳理目的:探讨端粒酶及其亚单位(hTERT、TP1、hTR)在胶质瘤发生和发展中的作用,研究端粒酶活性与各亚单位表达的相关性,及端粒酶活性与胶质瘤临床病理因素的相关性。方法:应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术检测48例胶质瘤及8例正常脑组织端粒酶不同亚单位基因的表达情况,应用端粒重复序列扩增技术(telomerase repeat amplification protocol,TRAP)检测48例胶质瘤及8例正常脑组织端粒酶活性。结果:①Ⅲ Ⅳ级胶质瘤组织中端粒酶阳性检出率分别为70.59%、77.78%,两组间无显着性差异(P>0.05),而与Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤之间和正常脑组织之间端粒酶表达之间有显着差异(P<0.001);②RT-PCR定性检测发现hTR和TP1mRNA在检测的各组组织中均有表达,而hTERTmRNA主要在高度恶性的胶质瘤中表达,与低度恶性胶质瘤及正常组织hTERT表达差异有统计学意义;③端粒酶活性与hTERT亚单位表达明显相关(P<0.001),而与hTR和TP1亚单位表达无明显相关性(P>0.05)。④端粒酶的表达与肿瘤的复发有明显相关性,而与其他临床病理因素无明显相关性。结论:端粒酶与胶质瘤发生发展、恶性程度以及预后密切相关;hTERT表达与端粒酶活性密切相关,并可能参与端粒酶的活性调节,hTERT的表达有望成为胶质瘤的诊断指标。
刘敏[6]2002年在《上皮性卵巢肿瘤端粒酶活性表达及其亚单位基因表达的研究》文中研究指明目的： 探讨端粒酶及其亚单位(hTERT、TP1、hTR)在卵巢癌发生和发展中的作用，研究端粒酶活性与各亚单位表达的相关性，及端粒酶活性与卵巢癌临床病理因素的相关性。方法：应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技术检测66例卵巢上皮性肿瘤及10例正常卵巢组织端粒酶不同亚单位基因的表达情况，应用端粒重复序列扩增技术(telomerase repeat amplification protocol，TRAP)检测其中45例卵巢上皮性肿瘤及9例正常卵巢组织端粒酶活性。结果：①恶性、交界性卵巢肿瘤组织中端粒酶阳性检出率分别为83.33％(25／30)、71.43％(5／7)，两组间无显着性差异(P＞0.05)，而良性上皮性卵巢肿瘤及正常卵巢上皮中未检测到端粒酶活性，与前两组之间均有显着差异(P＜0.001)；②RT-PCR定性检测发现hTR和TP1mRNA在检测的各组组织中均有表达，而hTERTmRNA主要在上皮性卵巢癌和交界性卵巢肿瘤中表达，二者间hTERTmRNA表达的差别无统计学意义(P＞0.05)，而与良性及正常组织hTERT表达有显着差异(P＜0.001)；③端粒酶活性与hTERT亚单位表达明显相关(P＜0.001)，而与hTR和TP1亚单位表达无明显相关性(P＞0.05)。④端粒酶的表达与各临床病理因素均无明显相关性(P＞0.05)。结论：端粒酶与卵巢癌发生发展过程密切相关；端粒酶的表达与卵巢癌各临床病理因素无明显相关性；hTERT表达与端粒酶活性密切相关，并可能参与端粒酶的活性 论文：上皮性卵巢肿瘤端粒酶活性表达及其亚单位基因表达的研究调节，hhRT的表达有望成为上皮性卵巢癌的诊断指标。
孙蓬明[7]2002年在《卵巢恶性肿瘤细胞端粒酶表达和hTERT基因、C-myc基因调控的研究》文中指出端粒(telomera,TLM)是染色体末端一种特殊的DNA-蛋白质结构，富含G链，在人类为(TTAGGG)n重复序列，长约2-15Kbp。它对染色体复制顺利进行、防止染色体末端融合和维护染色体结构稳定起重要作用。DNA线性复制造成细胞每次分裂时必将使其中的一条DNA链留有缺隙，端粒长度则随着细胞分裂而缩短，从而诱发细胞衰老和死亡。因此，端粒长度决定了DNA复制和细胞分裂的次数。端粒合成中至关重要的端粒酶(telomerase,TLMA)是一种具有逆转录酶功能的核糖核蛋白(ribonucleoprotein,RNP)，是依赖RNA的DNA聚合酶，包括一条RNA链和两条多肽链，即叁个主要成分：端粒酶RNA成分(human telomerase RNA,hTR)；端粒酶相关蛋白(telomerase associated protein,TP)；人端粒酶催化蛋白亚单位或人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)。端粒酶通过内在的RNA链逆转录合成端粒重复片段，从而维持端粒在一定的长度，保持染色体的动态平衡。现有研究表明端粒酶活性在正常体细胞中一般不表达，而在恶性肿瘤组织中或永生化细胞中表达率增高。近年的研究进一步证明了端粒酶激活与恶性肿瘤具有高度相关性，而编码hTERT的基因在端粒酶激活中可能起重要作用。同时原癌基因c-myc在癌变的发生中起到重要作用，该基因属核内转录因子基 名义压抖大学硕士学位论x因，其表达蛋白定位于细胞核内，属DNA结合蛋白，在细胞增殖扩增中起重要作用，促进与增殖相关的癌基因开放，其扩增与高表达不仅能促进细胞增殖与恶性化，而且还可以抑制细胞分化。卵巢恶性肿瘤是女性生殖系统叁大恶性肿瘤之一，其致死率在各种妇科恶性肿瘤中最高且预后最为不好。鉴于端粒酶、hTER基因、C－p C基因在肿瘤发生、发展中的重要作用，我们着重研究它们在卵巢恶性肿瘤中的表达和相互关系。 本研究内容包括下列叁个部分： l）采用PCR工LISA半定量方法研究端粒酶活性在卵巢恶性肿瘤、癌旁组织、交界性肿瘤、良性肿瘤、正常卵巢及卵巢肿瘤细胞株中的表达情况； 2）采用 RT－PCR方法检测 hTERT基因 mRNA和 c－myc基因mRNA在上述标本中的表达情况，分析端粒酶活性、hTERT基因、c－myc基因其间的关系： 3）在前述研究的基础上，用）lgh铂对卵巢肿瘤细胞株 HO七、COC；进行处理后同步检测hTERT和 c－myc基因 mRNA、端粒酶活性的表达情况，以分析hTERT和 c－myC基因 mRNA水平改变与端粒酶活性的相互影响。 本研究的主要研究结果： l）本研究中卵巢良性肿瘤组织与正常卵巢间端粒酶活性间端粒酶活性无差别①＞0刀5厂 正常卵巢的端粒酶活性 0二二 为上限 u二13州．070，97．5％可信区间）；而恶性卵巢肿瘤组织端粒酶活性表达率gi．30％，明显高于交界性卵巢肿瘤组织20刀0％o．of厂 良性乒巢肿瘤组织 7．13％（P＜0．of）和正常卵巢 0．00％（P t 0．of）。交界性 2 羽廷巴材大学刁士玖位用又卵巢肿瘤组织端粒酶表达率与后两者的端粒酶活性表达率也存在显着差异印＜0刀1八 端粒酶活性值在恶性卵巢肿瘤组织表达中临床分期Ill、IV期要明显高于I、11期0 刀5）；分化程度低者高于分化高者o刃刀5）；恶性卵巢肿瘤组织中端粒酶活性要明显高于癌旁组织 ① 刀5）；但端粒酶活性阳性表达率在临床分期、组织类型和组织起源上端粒酶表达率均无差异0川．05）。 2）对临床组织标本及肿瘤细胞株利用 RTPCR检测 hTERT基因的表达，发现20例 旧6．9％）的恶性卵巢肿瘤及两株肿瘤细胞有hTERT基因mRNA扩增，而在良性、交界性和正常卵巢组织中均未见表达；但仅有12例门2．2％）恶性卵巢肿瘤c－myc基因mRNA扩增。hTERT基因或c－myc基因阳性组端粒酶活性值显着高于相应的阴性组。 n两株细胞在顺铂浓度为lug／ml下连续培养，加药6H后端粒酶c－myc基因、hTERT基因InRNA表达出现降低，72H后c－myc基因表达几乎消夫，96H后hTERT基因mRNA表达几乎消失，TRAPELISA检测端粒酶活性，24H后端粒酶活性下降，120H后端粒酶活性完全消失。 结论： 端粒酶活化可以作为恶性肿瘤的分子生物学标志，并用于卵巢肿瘤的临床早期诊断、鉴别诊断、预后和疗效的判定。hTERT基因表达对端粒酶激活启重要作用，顺铂可以通过抑制hTERT基因表达下调端粒酶活性引起恶性肿瘤细胞凋亡。在hTERT基因调控端粒酶表达的过程中，c－myc基因起了正协同作用。
熊子云[8]2013年在《端粒酶蛋白催化亚基在兔颌面鳞癌细胞周期中的活性表达》文中认为目的：(1)在新西兰大白兔颌面部种植VX2瘤株,且结合CT表现和病理学切片检查,建立头颈部肿瘤的动物模型。(2)对新西兰大白兔颌面部肿瘤组织细胞端粒酶蛋白催化亚基(hTERT)的活性检测,探讨细胞周期指标在肿瘤组织中的生物学特性。方法：(1)实验分组：实验共分为2组,新西兰大白兔共30只,其中A组为实验组,共15只新西兰大白兔分别编号为A组：T1、T2---T14、T15；B组为对照组,共15只新西兰大白兔分别编号为B组：T1、T2---T14、T15；且每只均做好标记。(2)实验方法：将兔VX2瘤株细胞悬液接种到A组兔左侧颌面部咬肌中,建立左侧颌面部动物肿瘤模型,将生理盐水注射到B组兔左侧颌面部咬肌中,作为对照组。利用TRAP法(Telomeric Repeat Amplification Protocol)对兔肿瘤组织细胞端粒酶蛋白催化亚基(hTERT)的活性检测。其阳性结果在凝胶电泳上显示相隔6bp的梯状条带,条带的数量及深浅表示了端粒酶活性的大小。利用细胞内DNA能够和荧光染料(如碘化丙啶--PI)结合的特性,细胞DNA含量表达来检测兔颌面部肿瘤组织中细胞周期指标(SPF、PI和5cEx)的表达。(3)统计学分析：本实验采用SPSS13.0进行统计学分析,实验数据用均数±标准差表示,多组见比较用方差分析(F检验),方差齐则采用t检验进行两两比较,方差不齐则采用t’检验进行两两比较,以P<0.05为差异显着。结果：(1)头颈部肿瘤动物模型的建立：于VX2瘤细胞悬液接种兔A组和生理盐水注射兔B组第5周随机抽取,至长江大学附属第一医院行左侧颌面部CT扫描,A组左侧咬肌内可见肿块,边界清晰,B组未见肿块生成。于接种起第5周随机将将A组和B组左侧颌面部组织切除,行病理切片可见A组：取下的肿瘤组织行病理切片苏木精-伊红染色,病理证实为鳞癌,颌面部肿瘤组织与肌纤维交界,肌纤维肿瘤浸润及颌面部肿瘤组织,其可见病理性核分裂像；B组为正常左侧颌面部咬肌纤维。(2)TRAP-PCR法对兔肿瘤组织细胞端粒酶蛋白催化亚基(hTERT)的活性检测：端粒酶蛋白催化亚基(hTERT)阳性表达在电泳凝胶上呈现6bp的梯形条带图谱,而端粒酶阴性标本不出现此图谱,肿瘤组织细胞端粒酶活性表达呈现阳性,其中,第3条带是实验组A组T2细胞的端粒酶活性表现最强,且条带最为清晰,在实验中被用来做为阳性对照组,第1条带为分子量标记DNA Markers,片段显示清晰,第8条带为阴性对照,为裂解缓冲液对照无模板的自身阴性对照组,本次实验通过TRAP法检测实验组A组15例颌面部鳞状细胞癌组织中检测出的hTERT活性表达阳性为13例,阳性率为86.6%。B组15例颌面部正常咬肌组织中检测出的hTERT活性表达阳性为2例,阳性率为13.3%。本实验显示,在颌面部恶性肿瘤组织中端粒酶蛋白催化亚基(hTERT)活性明显高于正常组织(P<0.01),由此可以得出端粒酶活性的定量检测可以区分颌面部恶性肿瘤组织和正常组织,本研究进一步证实了端粒酶的活性表达与颌面部恶性肿瘤发生的相关性。(3)端粒酶蛋白催化亚基(hTERT)在实验兔颌面部肿瘤组织中细胞周期指标的检测：本次动物实验模型中A组15例为颌面部鳞状细胞癌,B组15例正常咬肌组织中均未异倍体出现,且SPI、PI和5cEx在实验兔A组的颌面部恶性肿瘤组的均值为：14.4%、19.58%和1.58%,相比较实验兔B组的正常颌面部咬肌组的均值：3.33%、4.13%和0.02%有很明显的升高,差异显着。且SPF和PI两组细胞周期指数提示A组颌面部恶性肿瘤部位的细胞增生程度高,与B组正常颌面部咬肌组织存在着明显的不同,表明颌面部恶性肿瘤异倍体与正常组织二倍体相比(P<0.01),恶性肿瘤组织与正常组织中5cEx存在的差异明显(P<0.05),且PI、SPF在二倍体肿瘤、异倍体肿瘤和正常咬肌组织相比,高出较明显(P<0.01)。结论：(1)通过采取注射兔VX2肿瘤组织细胞悬液而建立的兔颌面部恶性肿瘤模型,具有成瘤率高、肿瘤生长周期性短,稳定性高,操作简便等特点。(2)在兔颌面部恶性肿瘤组织中端粒酶蛋白催化亚基(hTERT)活性明显高于正常组织,端粒酶活性的定量检测可作为颌面部恶性肿瘤的诊断指标之一。(3)在兔颌面部恶性肿瘤组织中G1/S期细胞周期中可检测出端粒酶蛋白催化亚基(hTERT)活性表达,S期时hTERT活性表达最为显着,G2/M期中几乎检测不出时hTERT活性表达。
仇昊[9]2007年在《大肠癌组织中端粒酶活性、P53及nm23的表达和临床意义》文中提出目的和方法:本实验应用免疫组织化学技术检测P53、nm23在100例大肠癌组织中的表达情况,同时应用原位杂交技术检测其中30例大肠癌组织及其癌旁组织、正常粘膜组织中端粒酶活性的表达,并分析其与大肠癌的临床病理之间的关系,探讨大肠癌组织中端粒酶活性、P53表达与nm23之间的相关性,旨在探明端粒酶激活、P53基因突变、nm23基因缺失在大肠癌的发生、发展过程中的作用及相互关系,对大肠癌患者的早期诊断、预后评估的价值,并为其今后的分子生物学治疗探索提供理论依据。结果:(1)在30例大肠癌组织中,端粒酶mRNA的阳性表达率为90.0%,明显高于癌旁组织(距肿瘤3cm处)、正常粘膜组织(距肿瘤8cm处)(P<0.005),端粒酶活性的表达强度与肿瘤的浸润深度、临床分期及有无淋巴结转移显着性相关(P<0.05),与患者的性别、年龄及肿瘤的分化程度无相关性。(2)P53的阳性表达率为57.0%(57/100),其阳性表达及强度与肿瘤的分化程度、临床分期显着相关(P<0.05)。(3)nm23的表达率为53.0%(53/100),其阳性表达及强度与肿瘤的分化程度、浸润深度、临床分期及淋巴结转移均无明显相关性(P>0.05)。(4)P53表达与nm23低表达之间存在着一定的负相关性(r =-0.115),但两者与端粒酶活性之间无明显相关性。结论:端粒酶的激活、P53基因突变及nm23基因缺失在大肠癌的发生发展中有一定作用,联合检测端粒酶活性、P53、nm23的表达及强度对大肠癌的诊断、治疗及预后判断有意义,尤其P53与nm23同时检测更有价值。
冯旭[10]2005年在《Survivin mRNA、端粒酶活性在喉鳞癌中的表达及其临床相关性研究》文中研究表明[目的]通过检测23例喉鳞癌组织及喉部正常组织的Survivin mRNA和端粒酶活性,研究Survivin mRNA、端粒酶活性在喉鳞癌中的表达;探讨Survivin mRNA和端粒酶活性与喉鳞癌的临床分期、临床分型、病理分级、颈淋巴结转移,患者的性别、年龄之间的相关性;探讨喉鳞癌中Survivin mRNA表达与端粒酶活性之间的关系。[方法] 1.采用Taqman技术建立荧光实时定量FQ-PCR方法检测喉鳞癌组织及喉部正常组织的Survivin mRNA。2.应用TRAP-ELISA法测定喉鳞癌组织及喉正常组织的端粒酶活性。[结果] 1.喉鳞癌组织的Survivin mRNA的表达水平及端粒酶活性明显高于喉部正常组织。2.喉鳞癌组织的Survivin mRNA的表达水平及端粒酶活性与喉鳞癌的病理分级、临床分期以及颈淋巴结转移具有相关性,与喉鳞癌的临床分型,患者的年龄、性别无关。3.喉鳞癌的组织的Survivin mRNA的表达水平与端粒酶活性具有相关性。[结论] 1.荧光实时定量FQ-PCR和TRAP-ELISA技术是一种快速有效﹑灵敏度高﹑特异性好的定量检测Survivin mRNA和端粒酶活性的方法。2. Survivin mRNA及端粒酶活性可作为检测喉鳞癌的发生、发展,评价肿瘤恶性度,判断喉鳞癌病人淋巴结转移潜能和预后判断的指标。3.喉鳞癌组织中Survivin的表达与端粒酶活性有相关性,Survivin可能是使端粒酶活性增高的细胞因子。
参考文献：
[1]. 端粒酶和PinX1基因在食管癌中的表达及生物学意义[D]. 王大虎. 河北医科大学. 2011
[2]. 端粒酶与大肠癌相关性及RNAi沉默hTERT基因治疗大肠癌的研究[D]. 葛莲英. 广西医科大学. 2010
[3]. 恶性肿瘤组织中端粒酶活性表达的临床意义[D]. 张静. 华中师范大学. 2003
[4]. 端粒酶及VEGF-A与宫颈癌浸润的分子机制研究[D]. 李芳. 郑州大学. 2016
[5]. 脑胶质瘤端粒酶活性表达及其亚单位基因表达的研究[D]. 李永胜. 青岛大学. 2004
[6]. 上皮性卵巢肿瘤端粒酶活性表达及其亚单位基因表达的研究[D]. 刘敏. 青岛大学. 2002
[7]. 卵巢恶性肿瘤细胞端粒酶表达和hTERT基因、C-myc基因调控的研究[D]. 孙蓬明. 福建医科大学. 2002
[8]. 端粒酶蛋白催化亚基在兔颌面鳞癌细胞周期中的活性表达[D]. 熊子云. 长江大学. 2013
[9]. 大肠癌组织中端粒酶活性、P53及nm23的表达和临床意义[D]. 仇昊. 苏州大学. 2007
[10]. Survivin mRNA、端粒酶活性在喉鳞癌中的表达及其临床相关性研究[D]. 冯旭. 东南大学. 2005
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