王晶娟[1]2002年在《中药材及其复方DNA遗传标记鉴定方法研究》文中进行了进一步梳理DNA遗传标记鉴定方法是在中药四大鉴定方法及分子生物学发展的基础上衍生出来的一种新的鉴定法。本文围绕5种节肢动物及其复方小儿抽风散的DNA遗传标记鉴定，主要进行了5个有关方面的研究，即：商品药材总DNA的提取；5种动物药18SrRNA基因片段的序列研究；5种药材的特异性引物PCR鉴定；5种药材的基因酶切鉴定；5种药材在复方中的特异性鉴定。得出以下结论： (1)通过对药材中总DNA的提取研究，得到了一种能有效地从动物药材中提取出纯度较高的总DNA的方法。 (2)对5种动物药18S rRNA基因片段序列分析表明，5种动物间亲缘关系较近，从得到的序列可以设计5种动物的特异性引物。 (3)特异性引物PCR鉴定法表明：在合成的5对引物都能分别特异地将5种药材区别出来，达到了特异性鉴别的目的。 (4)通过对5种药材的EcoRⅡ酶切鉴定，证明基因酶切法可以用于中药材的品种鉴定，具有专属性。 (5)特异性引物鉴定法能够鉴定含部分或微量原中药的中药制剂，本方法具有准确性、科学性、可信度高等特点。 本文应用分子生物学原理，研究中药材及其复方基因鉴定的关键技术和方法，通过确立部分节肢类动物药的专属性基因鉴定的评价指标来控制中药品种和质量，并首次将基因鉴定方法引入中药复方的鉴别。
唐晓晶[2]2006年在《DNA分子标记在中药材鉴定中的应用研究》文中进行了进一步梳理中药品种的准确鉴定是中药质量控制的首要环节。现有的鉴别方法仍不能解决一些品种鉴定难的问题。如缺乏特征性理化成分的动物类药材、多来源药材、栽培后产生众多变异类型的药材等。 DNA分子标记方法的逐步成熟,使得中药材以客观指标为依托的现代质量评价方法得到了有益的补充,提供了解决上述难题的可能性。针对上述难点,本文探索使用多重位点特异引物PCR和ISSR-PCR方法鉴定中药材近缘混淆品种及多来源品种,并对各种PCR反应体系进行优化,建立了特异、稳定、快捷的中药材分子鉴定新方法。本论文主要分以下叁方面内容: 一、中药材DNA提取方法的探讨 本次研究选取具有代表性的含淀粉、多糖较多的人参、西洋参、半夏、天花粉药材,在常规CTAB法基础上加以改进,将提取缓冲液中NaCl浓度提高到2.5 mol·L~(-1),有效地去除了淀粉和其他多糖;延长温育时间至2h,不使用液氮研磨样品,提取缓冲液配方中省去巯基乙醇、PVP等成分;用高纯水溶解DNA沉淀;提取步骤为:温育、氯仿萃取、沉淀;使操作简化从而降低中药材DNA提取难度。 二、中药材位点特异性PCR方法鉴别 本文建立了多重位点特异性PCR方法鉴别中药材人参、西洋参。应用人参鉴别引物PgS481F和PgS712R和西洋参引物PgS481F和PqtK896F,对样品DNA进行PCR扩增,对反应体系优化,依据各自的特异条带进行鉴别。结果当退火温度为66℃时,出现249 bp条带的为人参,1049 bp条带的为西洋参。并使用20个不同来源的人参、西洋参样品进行验证实验。该法能在同一次PCR反应中准确地鉴别人参、西洋参。多重位点特异性PCR方法用于中药分子鉴定。使用该法经一次PCR反应成功地鉴别了人参与西洋参,半夏及其混淆品,虎掌南星及其混淆品,动物类药材虎骨、豹骨及其混淆品。 位点特异性PCR方法鉴别半夏及其混淆品。应用半夏鉴别引物PtITSF和PtITSR对半夏5个产地的新鲜样品、10个产地的药材以及5批虎掌、水半夏样品进行PCR检测。当退火温度为62℃时,只有半夏正品能够扩增395 bp条带,所有混淆品无扩增。 应用虎掌南星鉴别引物Pprpl148F和Pprpl480R,当退火温度为65℃时,仅有虎掌南星扩增351 bp条带,其它混淆品无扩增。 应用虎骨鉴别引物PtCytbF和PtCybR对4个虎骨、10个豹骨及各自的混淆品进行鉴定。当退火温度为52℃时,只有虎骨在326 bp扩增条带,混淆品无扩增。豹骨鉴别引物Pp3F和Pp3R对样品扩增,当退火温度为59℃时,只有豹骨出现374 bp条带,混淆品无扩增。 叁、多来源中药材ISSR-PCR方法鉴别 本次研究对药典多来源药材的鉴别做了初步的探索研究。应用简单重复序列间扩增方法鉴别叁来源甘草、两来源黄芪、叁来源大黄。实验中对ISSR-PCR反应体系和参数进行优化。经过对40个ISSR引物的筛选,当退火温度为55℃时,引物UBC826可以鉴别叁来源甘草;引物UBC866可以鉴别两来源黄芪;引物UBC818可对叁来源大黄进行鉴定。 通过本次研究得到如下结论:
庞启华[3]2010年在《高良姜（Alpinia officinarum Hance）的挥发油成分和遗传差异分析》文中研究指明高良姜(Alpinia officinarum Hance)是着名的十大南药之一,在医药、食品和化妆品加工以及蔬果保鲜上有广泛的应用。在高良姜药材长期的使用过程中,出现了替代品和混淆品,造成用药混乱,影响治疗效果。高良姜野生资源日益枯竭,种质资源丢失严重,栽培类型众多,但遗传多样性家底不清,药材的鉴定技术滞后,尤其是分子水平遗传多样性以及分子鉴定的研究仍为空白。本文以高良姜为研究对象,首次从形态表型、挥发油成分和DNA分子叁个不同层面较系统地研究了高良姜的理化特性及遗传多样性,探讨它们与地理分布之间的相关性以及和混淆品的亲缘关系,并建立有效的分子鉴定体系,为澄清其遗传背景和亲缘关系,进一步为种质资源保护、优良品种的选育和规范化种植提供参考,且为在优良种质筛选的基础上进行高良姜的细胞培养和借助发酵工程手段进一步开拓高良姜的应用前景打下基础,丰富高良姜的真伪鉴定和质量控制理论数据,研究结果具有较重要的理论与现实意义。主要的研究结果如下:1.采用水蒸气蒸馏法和经优化的超声波辅助石油醚提取法提取不同产地的高良姜及其混淆品大高良姜的挥发油,通过GC-MS检测其挥发油的化学成分,比较挥发油成分的差异,并根据欧几里得距离进行聚类分析。结果显示,不同产地高良姜的挥发油成分有差异,高良姜与大高良姜的挥发油成分差异更显着。广东产的高良姜样品先聚类,然后与海南的样品聚类,最后才与大高良姜聚类,表明高良姜挥发油成分与地理分布有相关性,而且从挥发油成分的差异可以鉴别高良姜的真伪。2.通过株高、每枝叶片数、叶长、叶宽、叶舌长、叶片质量、花序长、花冠裂片长和唇瓣长等形态表型数据分析各地不同群体高良姜的遗传变异,结果发现,高良姜群内和群间都存在差异,高良姜野生种类的叶片性状多样性程度大于栽培种类,高良姜的表型变异主要来源于群内的差异。聚类分析结果表明,高良姜的形态表型与地理分布没有明显的相关性。3.用改良的CTAB法提取各地高良姜不同群体及其混淆品山姜、华山姜、大高良姜等181个个体样品的基因组DNA,用优化的AFLP技术体系分析它们的遗传差异和亲缘关系。利用筛选出来的4对引物对各地不同群体的高良姜的个体样品进行选择性扩增,分析群内的多样性。结果表明,不同群体高良姜的群内多样性的程度有较大的差别,道地产地的高良姜群体的群内多样性程度均较小。用6对引物对各群体的个体混合模板DNA进行扩增,分析群体间的多样性,结果共检测出462个位点,其中418个是多态性位点,多态性百分率达90.5%,群体间呈现了很高的多样性。聚类分析结果显示道地药材产地龙塘镇的3个栽培群体Xj、Xn和XHn的遗传距离非常近,首先聚一起,体现了高良姜道地性的遗传本质,然后与其他产地的群体聚成一类,混淆品华山姜和山姜聚为一类,大高良姜为一类。在AFLP变性聚丙烯酰胺凝胶电泳指纹图谱和毛细管电泳指纹图谱上都能分辨出高良姜与混淆品大高良姜的特征性条带或特征峰组合,对鉴别高良姜的真伪有明显的鉴别效果。4.运用PCR直接测序法测定了不同产地高良姜及山姜、华山姜、大高良姜等混淆品的rDNA ITS序列,获得高良姜rDNA ITS序列802bp,山姜和华山姜的序列皆为800bp,大高良的序列为810bp,其中包括18S和26S的部分序列,以及ITS1、5.8S和ITS2全部序列。除了杂合位点之外,各地高良姜样品的序列完全一致。高良姜与混淆品的rDNA ITS序列中有61个变异位点,其中60个是信息位点,同源性为96.32%。在这些r DNA ITS序列中有11个位点是高良姜和混淆品的鉴别位点。5.用PCR直接测序法测得的高良姜和混淆品的matK基因的部分序列皆为1212bp。不同产地的高良姜除广西的样品有两个变异位点外,其余的高良姜样品的序列完全相同,所有高良姜样品的同源性达99.97%。高良姜与山姜、华山姜、大高良姜等叁种混淆品的matK基因的部分序列的比对结果显示有24个变异位点,其中22个是信息位点,同源性为99%。高良姜与叁个混淆品之间有一个鉴别位点。6.基于AFLP、rDNA ITS序列和matK基因序列等叁种分子标记的系统树基本一致,反映出各地高良姜有很近的亲缘关系,高良姜与山姜和华山姜的亲缘关系比较近,与大高良姜的亲缘关系比较远。从研究结果可以得出以下结论:高良姜遗传背景复杂,存在复杂的引种迁移种植现象;高良姜的挥发油成分受地理分布的影响较大,形态表型次之,基因组DNA相对稳定;高良姜与其混淆品之间存在明显的差别,可以通过理化特性和DNA分子特征加以鉴别。
邵鹏柱, 卢日东[4]2013年在《中药材汤剂遗传标记研究》文中认为分子鉴定技术已成为鉴别中药材的常用手段,但普遍认为加工炮制过程会破坏药材DNA,所以不适用于汤剂和成药产品。这项研究,为探讨汤剂中会否存有药材的DNA,并建立多重聚合酶链式反应(Multiplex PCR)及DNA测序法以识别有关中药材。研究对象包括人参汤剂、西洋参汤剂,以及含人参的中药材复方汤剂。比较不同的药材粉末大小,DNA提取法,煮制时间,特异性引物长度,以确立PCR扩增的成功条件。结果表明,经长时间煮制,药汤内仍保留可用于鉴别的特异DNA。此项发现,首次表明DNA鉴定技术适用于中药材汤剂,对推广应用DNA鉴别中药材至为重要。
王义权, 徐珞珊, 徐国钧, 周开亚[5]1997年在《DNA分子遗传标记鉴别在生药鉴定中的应用前景》文中提出概述了ＤＮＡ分子遗传标记技术在生药鉴别中的理论依据，并综述了该技术在生药鉴定中的应用情况和实际应用中需注意的问题，展望了ＤＮＡ分子遗传标记鉴别在生药鉴定中的前景。
周日宝[6]2008年在《灰毡毛忍冬种质评价以及药材质量和银黄配伍与金银花的比较研究》文中认为湖南省盛产的灰毡毛忍冬种植面积达到了叁十多万亩,花蕾药材商品名“湘银花”,上世纪90年代末始产量一直占全国金银花市场份额的40%,产品销往全国各地。灰毡毛忍冬的种植历史也已经有了叁十多年了,经过叁十多年的人工选择和自然选择,已经形成了许多农家品种品系等种质资源,但优劣混杂,良莠难分,品名混乱,给栽培和管理带来了许多困难；同时,人工选育良种时主要目标一直集中在药材产量等经济性状和株型等农艺性状方面,从未考察有效成分含量等内在品质。目的：灰毡毛忍冬作为一种新资源,基础研究薄弱,该项研究,拟以山东、河南金银花道地药材作对照,开展灰毡毛忍冬的有效化学成分绿原酸,咖啡酸和挥发油含量以及抑菌、抗菌、解热等药理作用及其安全性比较研究,试图建立湘银花药材的质量标准体系；探讨灰毡毛忍冬与黄芩的药对配伍对主要有效成分的影响,研究并构建灰毡毛忍冬、金银花与黄芩药对配伍的HPLC指纹图谱；开展种质资源的遗传多样性和活性成分含量的比较研究,系统整理和科学评价灰毡毛忍冬种质资源、为良种选育和GAP种植提供科学依据。方法：采用HPLC法测定有效成分绿原酸,咖啡酸的含量；采用共水蒸馏法提取挥发油成分,GC-MS法分析挥发油成分；采用琼脂扩散法、试管稀释法研究体外抑菌、杀菌作用；用NIH小鼠研究体内抗菌作用并测定其半数致死量LD50；用大鼠致热模型研究解热作用；采用HPLC法分别测定单味药材灰毡毛忍冬、金银花和黄芩及其共煮液中绿原酸、黄芩苷的含量,SPSS13.0软件进行分析。采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004版》对指纹图谱进行相似性分析；采用ISSR标记研究灰毡毛忍冬种质资源的遗传多样性,并利用POPOGENE32软件对扩增片段数据进行聚类分析；采用HPLC法对灰毡毛忍冬种质资源的绿原酸、咖啡酸、木犀草素、芦丁和金丝桃苷等活性成分的含量比较研究,构建灰毡毛忍冬“湘蕾金银花”的指纹图谱。结果：1、采自湖南省隆回县,溆浦县,新宁县种植基地的灰毡毛忍冬及河南,山东金银花种植基地和山东药材市场市售的金银花中绿原酸含量分别为3.9±0.4537,2.6±0.1408,4.5±0.0182,2.4±0.1913,2.1±0.1684,2.5±0.0506；灰毡毛忍冬中绿原酸的含量高于金银花；灰毡毛忍冬中咖啡酸的含量接近或略高于金银花；灰毡毛忍冬和金银花挥发油中均含有效成分芳樟醇(Linaiool)、香叶醇(Geraniol)和α-松油醇(α-Terpineol)等10个相同成分,其中芳樟醇的百分含量最高。2、灰毡毛忍冬或金银花对金葡菌、乙型链球菌、大肠杆菌等六种菌皆有抑制作用,其中对金葡菌和乙型链球菌的抑菌作用最强,并且对金黄色葡萄球菌等均有杀灭作用；药材的最低杀菌浓度明显高于最低抑菌浓度,水煎剂的抑菌作用比浸泡剂强；隆回产灰毡毛忍冬抑菌作用最强；灰毡毛忍冬和金银花对金葡菌感染的小鼠有一定的保护作用,以隆回产灰毡毛忍冬效果最好；灰毡毛忍冬和金银花的解热强度相当。药材的毒性皆较小,其中灰毡毛忍冬毒性最小。3、灰毡毛忍冬或金银花与黄芩配伍对其主要有效成分绿原酸、黄芩苷的含量均无影响。4、以绿原酸为参照峰,灰毡毛忍冬和黄芩水提物与金银花和黄芩水提物指纹图谱共有12个指纹峰,灰毡毛忍冬和黄芩水提物指纹图谱共有14个指纹峰,金银花和黄芩水提物指纹图谱共有13个指纹峰；同一药材不同批次的指纹图谱相似度都大于90%,十批灰毡毛忍冬和黄芩水提物指纹图谱与十批金银花和黄芩水提物指纹图谱的相似度基本上大于90%；灰毡毛忍冬水提物指纹图谱与金银花相比,多了4个峰,但峰面积很小,且与黄芩共煮后有两个峰消失。5、对灰毡毛忍冬总DNA提取方法和PCR反应体系进行了优化,建立了稳定可靠的品种鉴定方法,筛选出了15条有效引物,构建了灰毡毛忍冬的DNA指纹图谱库；绘制了灰毡毛忍冬聚类树状图。18个样品分为两大类,一大类为忍冬,一大类为灰毡毛忍冬,灰毡毛忍冬又被分为五类：岩背的常规单独为一类,太湖1号、2号为第二类,龙潭湘蕾6号与湘蕾王2号为第叁类,龙潭的常规为第四类,其余样品为第五类。6、灰毡毛忍冬不同种质间各组分含量相差悬殊,绿原酸含量0.012-6.66%,样品间相差55.5倍；除1、2、4、7、13号样品外,其它样品均超过2005版《中华人民共和国药典》的规定标准；木犀草素含量0.009-0.079%,样品间相差8.8倍,所有样品的含量均低于2005版《中华人民共和国药典》的规定标准；咖啡酸含量0.003-0.399%,样品间相差1 33倍；芦丁含量0.014-0457%,样品间相差32倍多；金丝桃苷含量0.007-0.096%,样品间相差13.7倍；常规品种具有良好的内在品质；太湖一号、太湖二号、湘蕾王一号、湘蕾王四号、白云一号和花王一号各有效活性成分的含量均普遍较高：绿原酸远远超出2005年版《中华人民共和国药典》的规定标准,适于推广；构建了湖南灰毡毛忍冬湘蕾系列药材的指纹图谱,指纹图谱的相似度很高。结论：1、灰毡毛忍冬内在品质和药理作用等优于金银花,完全可以代替金银花使用。2、灰毡毛忍冬种质资源丰富,不同种质间有效成分含量和内在品质相差悬殊。3、银黄配伍中灰毡毛忍冬优于金银花。
潘艳丽[7]2006年在《金莲花及其复方的化学表征研究》文中研究表明研究金莲花及其复方的药效组分指纹特征及其化学表征,探讨中药材与复方鉴定特征的相关性和质量综合评价新的方法学体系。采用X射线衍射、光谱、色谱以及色谱-质谱联用技术建立金莲花及复方制剂的指纹鉴定特征标准;在药效组分的叁个层次上进行指纹特征解析,辅助计算机建立药效组分品质评价数据库。以金莲花药典品种为基本材料,并对商品金莲花进行考察和比较鉴定;分别对金莲花及其复方样品的XRD、IR、HPLC、LC-MS的指纹特征进行测定,并对其化学表征进行解析,分析原料药和复方鉴定特征的相关性、鉴定方法的适用性、品质标准的可信性和科学性。研究结果:1商品金莲花主要为毛茛科植物Trollius chinensis Bunge的干燥花,即药典品种。2XRDF鉴定①内蒙古的野生金莲花样品有5个特有的衍射特征标记峰:8.17/14,7.19/15,5.42/21,3.57/20,2.781/21;黑龙江的野生金莲花样品有7个专属性衍射特征标记峰:10.05/15,5.13/38,4.94/19,3.43/24,3.11/18,2.644/27,2.479/20。而栽培品无d=3.22的标记峰。据此,可鉴定不同产地以及不同生态环境的金莲花。②复方金莲花XRDF特征标记峰有5个( 11.51/25,9.27/33,6.64/25,5.55/46,5.13/38),Px=22.73%; P=77.27%。原料配伍组分解析结果:金莲花(Flos Trollii Chinensis)专属性标记峰有3个(9.94/17,8.17/14,5.42/21),Px =17.65%;在复方中专属性晶体晶面间距变化区域为1.986~4.25。野菊花(Flos Chrysanthemi Indici)专属性标记峰1个(8.38/35), Px=3.57%;在复方中专属性晶体晶面间距变化区域为1.971~4.63;吻合晶面间距d=2.907A。金银花(FlosLoniceraJaponica )专属性标记峰2个(4.95/15,4.50/16), Px=9.09%;在复方中专属性晶体晶面间距变化区域为2.055 ~ 4.95;吻合晶面间距d_1=3.93A,d_2=3.05A。黄芩苷专属性标记峰9个(10.34/62,8.59/23,6.49/10,6.05/34,5.23/44,3.86/28, 2.713/20,1.881/10,1.752/10), Px =18.37%;在复方中专属性晶体晶面间距变化区域为2.016~4.44;吻合晶面间距d=2.910A。3FT-IR鉴定①金莲花红外光谱可以鉴别不同产地金莲花。内蒙古产金莲花具有1419cm~(-1)与760cm~(-1)吸收峰,黑龙江省产金莲花无760cm~(-1)峰,而河北省产金莲花则无1419cm~(-1)峰与760cm~(-1)吸收峰。二阶导数光谱可以鉴别金莲花的贮藏期,1737cm~(-1)峰的强度随着贮藏期的增加而增加;同时在1500~1 480cm~(-1)波数区间,贮藏期4年以下的金莲花体现1499cm~(-1)与1485cm~(-1)特征峰,但1485cm~(-1)的峰强度随着时间的增长而呈减弱趋势,所以贮藏期4年以上的金莲花仅表现1499cm~(-1)峰。②复方金莲花有15个红外特征指纹峰(νcm~(-1)),即3735,2931,1664,1614,1450,1408,1 360,1291,1191,1067,915,768,687,597,417;二阶导数光谱可以鉴别复方金莲花与其原料药,复方二阶导数光谱的表征峰是1416cm~(-1)。通过红外光谱可以鉴别复方的原料药与提取物。原料配伍组分解析结果(νcm~(-1)):金莲花标识特征峰为2926,1609;野菊花标识特征峰为1660,1609;金银花标识特征峰为767。药效组分表征峰(νcm~(-1)):金莲花提取物为1614,1360,1291,1191,687,597;野菊花提取物为915,768,417。4HPLC鉴定①金莲花HPLC指纹图谱有26个共有峰(n=20),确定了指纹谱中可标识的3个化学成分组分,即2′′-O-β-L-galactopyranosylorientin,orientin和vitexin。大鼠灌胃给药,可检出6个组分,峰保留时间均集中于30min前。不同产地金莲花HPLC指纹谱无显着性差异(RSD<1%)。②复方金莲花HPLC指纹图谱有12个共有峰(占总峰面积大于99%),2个非共有峰(占总峰面积小于1%),相似度(时间宽度0.25min,n=10)为0.996～1.000。原料药配伍组分解析:金莲花与复方对应的药效组分保留时间在15～38min和50～55min区段,共有8个色谱峰。野菊花与复方对应的药效组分保留时间在5～10min和25～40min两个区段,共有7个色谱峰。金银花与复方对应的药效组分保留时间在5～10min和23～38min两个区段,共有9个相对应色谱峰。化合物类别组分解析:黄酮类化合物保留时间位于15～50min。酚酸类化合物保留时间位于5～15min。化学单体解析:金莲花与复方金莲花对应的药效组分3个,2′′-O-β-L-galactopyranosylorientin(16.333min)、orientin(17.746min)和t_R=52.18min,其中2′′-O-β-L-galactopyranosylorientin和t_R=52.18min峰为金莲花药效组分特征峰,其峰面积比例为1:3。野菊花与复方对应的药效组分2个,cholorogenicacid(7.901min),caffeicacid(10.384min)。金银花与复方对应的药效组分2个,cholorogenicacid(7.901min),caffeicacid(10.384min)。baicalin(42.211min)。5 LC-MS鉴定通过质谱数据进行化学单体解析:①确认金莲花中的3个成分:2′′-O-β-L-galactopyranosylorientin t_R=11.927min,[M-H]~- 609;orientin t_R=13.949min,[M-H]~-447;vitexint_R=16.589min,[M-H] -431。对金莲花中所含的化学组分质量推测8个色谱峰的归属: Orientin-2′′-O-β-D-pyranxyloside t_R=12.935min , [M-H] - 579 ;2′′-O-β-L-galactopyranosyl vitexin t_R=13.791min , [M-H] - 593 ;2′′-O-(3′′′,4′′′dimethoxylbenzoyl) vitexin t_R=14.723min , [M-H] - 595 ; isoswertisint_R=26.382min,[M-H]~- 447;2′′-O-(2′′′methylbutyryl)orientint_R=30.729min,[M-H]~- 531;quercetin t_R=34.332min,[M-H]~- 301;2′′-O-(2′′′methylbutyryl)vitexin t_R=35.315min,[M-H] -515;2′′-O-(2′′′methylbutyryl)isoswertisin t_R=43.583min,[M-H] -529。②确认野菊花中的5个成分: acacetin t_R=57.54min,[M-H]~- 283;lianarin t_R=31.50min,[M-H]~- 591;luteolin t_R=33.21min,[M-H] -285;caffeicacidt_R=10.16min,[M-H]~- 179;cholorogenicacid t_R=7.41min,[M-H]~- 393。通过对野菊花中所含的化学组分质量分析色谱峰的归属推测3个成分:isoquercitrint_R=18.59min,[M-H]~- 463; cosmosiint_R=22.67min,[M-H]~-431;luteolin-7-O-glu t_R=18.16,[M-H] -~447。③确认金银花中的4个成分:hyperint_R=17.98min,[M-H]~- 463;luteolint_R=33.08min,[M-H]~- 285; caffeicacidt_R=9.95min,[M-H]~- 179;cholorogenic acid t_R=7.39min,[M-H]~- 393。通过对金银花中所含的化学组分质量分析色谱峰的归属推测1个成分:luteolin-7-O-glu t_R=18.08min,[M-H] -447。④确认复方中8个成分:cholorogenic acid t_R=7.47min,cafeeic acid t_R=10.027min,2′′-O-β-L-galactopyranosyl orientin t_R=12.38min , orientin t_R=13.763min , vitexint_R=16.431min,hyperin t_R=18.991min,baicalin t_R=28.83min,acacetin(t_R=57.77min)。并指认了3个色谱峰的归属。金莲花及其复方的指纹谱均能表述其相应的专属性,其中XRD指纹谱可用于成药及其原料配伍组分鉴定,并可用于不同产地和不同生态环境的同品种金莲花鉴别;能从原料药配伍组分上对复方进行品质评价。IR指纹法可用于同品种不同产地金莲花的鉴定;二阶导数红外光谱法可用于不同贮藏期的金莲花及其复方的品质鉴定;即IR可从原料药配伍组分及化学单体组分二个层面进行复方品质评价。XRD与IR可以在没有对照品的情况下,借助金莲花及复方金莲花的整体组分表征进行品质评价。同时通过对复方的表征分析,可以鉴定复方的组方中药。HPLC指纹谱可用于评价金莲花及其复方的品质,并可对主要药效组分的变化规律进行跟踪,建立依据药效组分为主要指标的质量标准;HPLC从原料药配伍组分、化合物类别组分及化学单体组分叁个层面进行复方品质评价,评价方式最为全面。LC—MS质谱联用可以将液相色谱指纹峰与质谱数据相关联,对其化学表征给予更多的解析,为金莲花及其复方品质评价提供更多的信息;LC-MS从化学单体组分对复方进行品质评价。该论文创新点在于:首次建立了金莲花及其复方药效组分品质评价的4种指纹鉴定特征。提出了中药化学药效组分特征的叁个层次,即原料药配伍组分、化合物类别组分和化学单体组分;并建立了对药效组分化学表征进行定位的基本方法。揭示了中药品质评价的原料药和复方制剂、质量标准和药效组分的相关性问题,为中药品质的本质特征和建立与药效组分相关的质量标准提供了新的研究方法和思路。在XRD指纹鉴别特征研究方面,创立了中药共有特征专属标记峰和晶面间距的吻合峰值为综合指标的鉴定方法;在IR指纹鉴别特征研究方面,采用一维光谱鉴别不同产地药材和二阶导数光谱鉴定不同贮藏期药材;在HPLC指纹鉴别特征研究方面,从原料药配伍组分、化合物类别组分和化学单体3个层次上对指纹特征解析,提出了以液相色谱监测药效组分的分离及复方工艺的方法和以色谱指纹峰面积的比率进行中药品质评价的方法。获相关发明专利2项(主要发明人之一),专利已公开。
李力, 徐永莉, 张月云, 赵成坚[8]2009年在《DNA分子标记在中药鉴定中的应用及发展趋势分析》文中研究表明目的对DNA分子遗传标记技术在中药材鉴定领域的应用作一综述。方法通过查阅20世纪90年代以来发表的文献进行归纳分析。结果DNA分子遗传标记技术具有微量、快速、特异性强、准确可靠、对样本要求较低的特点;使用较多的方法主要有RAPD、ISSR、ITS标记以及rRNA基因序列分析技术。同时,DNA分子标记技术也存在着使用局限、对实验硬件和从业人员的技术要求高、成本较高、技术复杂度高、对不同部位入药的药材仍然难以区分以及无法用于成药、复方、提取液鉴定等弱点。结论DNA分子遗传标记作为中药材鉴定的方法还有待发展和完善。
刘旭朝[9]2017年在《水牛角、地龙药材DNA条形码鉴定研究及动物药材DNA提取方法优化研究》文中指出目的:本研究基于COI条形码序列对市售水牛角、地龙药材进行鉴定研究,对两种市售动物药材商品的真伪情况进行调查,为市场监管提供有力工具;同时对市售动物药材的DNA提取方法优化并鉴定,为中国药典动物药DNA分子鉴定研究提供技术支持。方法:首先收集水牛角、地龙及其易混伪品原动物样品,提取样品基因组DNA并获得样品COI序列,利用MEGA6.0软件分析序列特征,构建水牛角、地龙及其易混伪品DNA条形码数据库;其次利用构建的条形码数据库对在药材市场中收集的水牛角、地龙药材进行鉴定,调查市售商品真伪情况。基于SDS法DNA提取原理,比较裂解液中不同EDTA浓度(0.025 mol·L~(-1)、0.25mol·L~(-1)、0.5mol·L~(-1))、是否含Na Cl和Triton X-100,对不同用药部位动物药(全体类、角类、骨甲类、组织类、其他类)DNA提取质量的影响,筛选出最佳裂解液配方。结果:本研究通过对水牛角、地龙及其易混伪品原动物和药材样品DNA提取发现,绝大多数样品均可获得较高质量的DNA和COI序列;运用构建的DNA条形码数据库对市售水牛角、地龙鉴定发现:29%的市售水牛角药材样品为牦牛角,是水牛角药材伪品的主要来源;50%的市售地龙药材样品不是药典规定正品基原物种,且物种构成较为混乱。通过筛选得到最佳裂解液配方:1%SDS、0.03mol·L~(-1)Tris-HCl、0.25mol·L~(-1) EDTA、0.2mol·L~(-1) Na Cl,该裂解液配方中EDTA浓度为常规SDS裂解液配方中EDTA浓度的10倍,可实现对部分不同用药部位动物药的DNA提取。结论:DNA条形码鉴定技术为动物药材鉴定提供了准确、有效的鉴定方法,为动物药材的市场监管提供了工具,也为临床安全用药提供了保障;本研究建立的DNA提取方法所获得DNA满足动物药材鉴定后续实验要求,保障了动物药材分子鉴定的推广应用。
马梅[10]2014年在《中药广地龙高特异性PCR鉴别的研究》文中提出目的:建立一种经济实用、准确便捷的广地龙药材及其原动物的鉴定方法,解决广地龙药材因来源复杂等导致的难以准确鉴别的问题。同时,为今后药材质量控制及质量标准的制定等提供一个高效准确的鉴别方法,以保证药材的疗效及患者的用药安全。方法:1.赴上海、广州等地采集常见地龙物种,配置一系浓度的酒精,通过麻醉、固定及脱色制作成地龙标本,以利于后续样品基因组DNA的有效提取和长期保存。结合相关文献材料,在上海交通大学环节动物分类学专家邱江平研究员及其博士生蒋际宝的指导下,利用经典动物学分类法对所采集的地龙样本进行物种鉴定。2.结合GenBank数据库中有关蚯蚓的COI、16SrRNA和12SrRNA基因序列设计通用引物,优化PCR条件,对包括广地龙原动物参环毛蚓Pheretimaas pergilum(E Perrier)在内的10种蚯蚓的COI、16SrRNA以及12SrRNA基因序列进行PCR扩增,扩增产物纯化后送华大基因生物公司测序,测序结果利用DNAStar校对,采用CondonCode Aligner 进行序列拼接,并将结果进行 BLAST(Basic Local Alignment Search)相似性搜索,以验证COI、16SrRNA和12SrRNA基因片段的扩增和测序结果的准确和可靠。3.利用DNAMan软件对所得COI、16SrRNA和12SrRNA基因序列进行多重序列比对,分析正、混品间DNA序列差异,选择差异位点较多的基因序列设计出能特异性扩增广地龙原动物参环毛蚓Pheretimaas pergilum(EPerrier)的特异性鉴别引物数对,从中筛选出一对具有高特异性的鉴别引物,依此建立参环毛蚓Pheretimaas pergilum(E Perrier)高特异性PCR鉴别方法,并对该方法的稳定性及个体差异的影响进行研究。4.将所建立的方法应用于市售广地龙药材及混合粉末的鉴别中,检测该特异性鉴别引物的通用性和适用性。结果:1.经鉴定,本研究共采集到链胃蚓科杜拉蚓属、巨蚓科远盲蚓属等3科4属共10种地龙样品。2.经测序得到各样品大小约为700bp、350bp、320bp的COI、16SrRNA和12SrRNA基因序列,经BLAST(Basic Local Alignment Search)相似性搜索,结果表明COI、16SrRNA和12SrRNA基因片段的扩增和测序结果是准确和可靠的。3.利用DNAMan软件对所得C0I、16SrRNA和12SrRNA基因序列进行多重序列比对,分析正、混品间DNA序列差异,COI基因差异位点所占百分比为17.08%,16SrRNA和12SrRNA基因序列差异位点所占百分比分别为15.84%、45.43%,选择差异位点较多的12SrRNA基因序列设计3对能特异性扩增参环毛蚓的鉴别引物,通过实验筛选出参环毛蚓Pheretimaas pergilum(EPerrier)高特异性鉴别引物12st/12stf,依据该鉴别引物所建立的参环毛蚓Pheretimaas pergilum(E Perrier)高特异性PCR鉴别方法具有良好的稳定性且不会受到个体差异的影响。4.将所建立的方法应用于市售广地龙药材及混合粉末的鉴别中,结果准确且具有较高的稳定性。结论:本研究所建立的广地龙高特异性PCR鉴别方法成功实现了对广地龙原动物、市售广地龙药材及混合粉末的准确鉴定,该方法突破了传统经典鉴别方法的局限性,操作简单、方便快捷,不受个体差异(不同产地和不同居群)及实验环境的影响,表现出较高的可靠性和稳定性,具有较高的推广应用价值。
参考文献：
[1]. 中药材及其复方DNA遗传标记鉴定方法研究[D]. 王晶娟. 黑龙江中医药大学. 2002
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[3]. 高良姜（Alpinia officinarum Hance）的挥发油成分和遗传差异分析[D]. 庞启华. 华南理工大学. 2010
[4]. 中药材汤剂遗传标记研究[C]. 邵鹏柱, 卢日东. 中国遗传学会第九次全国会员代表大会暨学术研讨会论文摘要汇编（2009-2013）. 2013
[5]. DNA分子遗传标记鉴别在生药鉴定中的应用前景[J]. 王义权, 徐珞珊, 徐国钧, 周开亚. 中国中药杂志. 1997
[6]. 灰毡毛忍冬种质评价以及药材质量和银黄配伍与金银花的比较研究[D]. 周日宝. 湖南中医药大学. 2008
[7]. 金莲花及其复方的化学表征研究[D]. 潘艳丽. 北京中医药大学. 2006
[8]. DNA分子标记在中药鉴定中的应用及发展趋势分析[J]. 李力, 徐永莉, 张月云, 赵成坚. 时珍国医国药. 2009
[9]. 水牛角、地龙药材DNA条形码鉴定研究及动物药材DNA提取方法优化研究[D]. 刘旭朝. 山东中医药大学. 2017
[10]. 中药广地龙高特异性PCR鉴别的研究[D]. 马梅. 广州中医药大学. 2014
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