1川北医学院病理生理学教研室；2南充市食品药品检验所 四川南充 637000
【摘 要】目的：研究和分析壳聚糖对5种细菌生物膜的体外抑制效果和作用。方法：选择大肠杆菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、变形杆菌作为本实验供试菌种，使用XTT减低法检测壳聚糖对5种细菌生物膜的体外抑制效果，分析不同浓度下对 各种细菌抑制率，得出结论。结果：壳聚糖对大肠杆菌、表皮葡萄球菌、变形杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的生物膜形成均有一定的抑制作用，对细菌不同阶段的抑制作用不同。结论：随着壳聚糖浓度的增加，对5种细菌生物膜的抑制作用也增加，随着细菌成熟度的增加，壳聚糖的抑制效应减弱。
【关键词】壳聚糖、5种细菌生物膜、体外抑制效果
1前言
壳聚糖主要是经过几丁质乙酰作用而得到的，其化学名称为：聚葡萄糖胺（1–4）–2–氨基–B–D葡萄糖，它具有强烈的微生物降解性，安全性、生物官能性和血液相溶性。目前，在诸多领域中，都广泛用到了壳聚糖。而在医药方面，壳聚糖具有很好的降血脂、血糖作用。它还可以改变细胞膜的流动性和通透性，因此具有一定的抗菌作用。
细菌生物膜也称之为生物被膜，指的是附着在有生命或者无生命物体表面被细菌胞外大分子包裹的有组织性的细菌群体。生物膜内的细菌具有极强的耐药性和抵抗机体免疫系统作用的能力 ，临床上还缺乏对抗它的安全高效方法。本文主要分析壳聚糖对五种条件致病菌生物膜的体外抑制作用。
2实验材料
2.1供试菌种
本研究壳聚糖对5种细菌生物膜的体外抑制效果，选择的菌种有变形杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌。
2.2供试壳聚糖
供试壳聚糖为山东省莱州市海力生物制品有限公司生产，其规格为95g，纯度为100％。在本次实验中，研究四种不同浓度的壳聚糖对于5种细菌生物膜的抑制作用。实验前，使用高压蒸汽灭菌法对沙堡琼脂培养基消毒。
2.3实验设备
本次实验采取XTT减低法，主要仪器设备如下：由美国sigma公司生产的XTT，经过0.5g/L的林格液稀释往滤器过滤消毒杀菌。
3实验方法分析
实验方法主要包括四个大步骤：5种细菌菌液的制备、生物膜的制备、不同壳聚糖浓度对5种细菌生物膜的体外抑制效应、在5种细菌不同阶段下壳聚糖对其生物膜的体外抑制效应分析。①5种细菌菌液的制备：将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、变形杆菌、表皮葡萄球菌、绿脓杆菌等标准株分别接种于沙堡琼脂培养基上，在37℃的温度下培养过夜，并从各个培养基中分别挑取单个菌落，将各个不同菌落加入到酵母蛋白胨葡萄糖液基1ml中，在30℃条件下培养24h。然后，取出经过活化后的菌液10ml，加入YEPD培养基1ml，在30℃条件下进行摇床培养，培养10h。最后收集菌体，配制成菌悬液。②生物膜的制备：取出上述不同菌液100ml，分别接种于96孔细胞培养板当中，在37℃下培养2h后脱离培养基，并用PBS清洗3次，然后加入100uLRPMI1640培养基当中，并将其作为培养的0点，在37℃条件下继续培养，每经过24h更换一次培养基。③分析不同壳聚糖浓度对5种细菌生物膜的体外抑制效果，取100ml五种菌液于96孔细胞培养板上，在培养0点加入倍比稀释的壳聚糖溶液，并分别设置五个空白对照组，空白对照组当中加入培养基。37℃培养，48h之后脱离培养基，用PBS清洗三次，每个孔加入XTT100uL，并使得培养基的终点浓度为1umoL/L。对于五个实验，分别设置三个平行实验进行对比分析。④分析处于不同阶段的细菌生物膜在壳聚糖下的抑制效果：同样的，取100ml不同菌液于96孔细胞培养板上，并分别培养生物膜0h、4h、8h、12h等，弃去培养基，加入0.16mg/ml壳聚糖溶液，分别设置空白对照组，加入培养基。设置三个平行实验。
4实验效果分析
壳聚糖浓度对5种细菌生物膜体外抑制作用，金黄色葡萄球菌用编号1表示，大肠杆菌、表皮葡萄球菌、变形杆菌、绿脓杆菌分别用2、3、4、5表示。
根据上述数据分析，壳聚糖的浓度增大时，对于5种细菌的体外生物膜抑制作用也加强。经过上述实验，当细菌处于不同阶段时，壳聚糖的抑制作用也不一样。
5讨论
壳聚糖对5种细菌生物膜的体外抑制作用大致相同，随着壳聚糖浓度增加，对生物膜的抑制作用加强，培养细菌的时间越久，壳聚糖对生物膜的体外抑制作用减弱。其作用机制可能是改变细菌生物膜的渗透性，导致营养物质无法向细胞内运输，或者细胞内容物渗出，致使细菌溶解死亡。因此进一步研究其抗细菌生物膜机制可为安全新型抗细菌生物膜医用材料研究提供重要线索。
参考文献：
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注明：基金项目：南充市科技局研究项目
论文作者:唐晓晏,杜雄心
论文发表刊物:《中国医学人文》(学术版)2017年5月第10期
论文发表时间:2017/10/13
标签：细菌论文; 生物论文; 壳聚糖论文; 抑制论文; 培养基论文; 体外论文; 作用论文; 《中国医学人文》(学术版)2017年5月第10期论文;