(1.武警河南省总队医院肿瘤科 河南郑州 450000)
(2.郑州大学第五附属医院病理科 河南郑州 450000)
【摘要】目的：研究BCSG1-siRNA质粒对乳腺癌特异性基因BCSG1表达的影响及其对放疗敏感性的影响，分析各种治疗方案的效果。方法：选取人体乳腺癌种植瘤模型和MCF-7乳癌细胞种植瘤模型建立成功的小鼠各30只，分别随机分为A、B、C、D、E、F 6组。分别给予BCSG1-siRNA纳米粒治疗、高低剂量X线放疗，设对照组。所有小鼠于治疗结束后一周进行样本采集，将各组裸鼠处死，完整剥离肿瘤组织块。求出肿瘤近似体积（V），称取瘤重，计算肿瘤抑制率；通过RT-PCR实验检测BSCG1-mRNA表达定量；通过Western blot实验检测BSCG1蛋白表达水平；用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果：1.治疗结束后根据抑瘤率、BCSG1 - mRNA表达水平及蛋白表达量来评价治疗效果。两种种植瘤模型的治疗效果由大到小顺序均为A>B>E>C>D>F。2.人体乳腺癌种植瘤模型与MCF-7种植瘤模型的结果基本一致，同等条件下，MCF-7细胞种植瘤模型的效果要略微优于人体乳腺癌种植瘤模型。结论：加入BCSG1 - siRNA纳米粒治疗后进行放疗效果优于单独进行放疗，即BCSG1 - siRNA纳米粒可以提高乳腺癌放疗的敏感性。两种种植瘤模型的治疗效果不具有显著性差异，需进行进一步研究。
【关键词】乳腺癌；BCSG1；RNAi；种植瘤模型；放疗敏感性
The influence of siRNA plasmid to a breast cancer-specific gene, BCSG1 expression and its radiosensitivity
ZHENG Ruifeng1,LUO Junbo1,SHEN Peihong2*,WANG Yanwei1,WERN Haiying1,YANG Yang1(1. Department of oncology, Henan General Hospital of Armed Police Force;2. Department of Pathology, the Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, China.)
Abstract：Objective To study the influence of BCSG1-siRNA plasmid to a breast cancer-specific gene, BCSG1 expression and its radiosensitivity, and then analyze the effects of various treatment plan. Methods Select 30 mice respectively that are successfully built human breast cancer implanted tumor model and MCF-7, and divide randomly into 6 groups called group A,B,C,D,E,and F. The mice are given BCSG1-siRNA nanoparticle-based therapy and High and low dose X-ray radiation,meanwhile the control group was established. A week after tureatment,all specimen were collected after the mice were sacrificed. Get gross tumor volume and weigh, then calculate tumor control rate.monitor BCSG1-siRNA quantitative expression through RT-PCR test , BCSG1 protein expression level through Western blot test and cell apoptosis rate through flow cytometry. Results 1.The treatment effects of 6 groups are ABECDF in descending order.2.The results of human breast cancer implanted tumor model and MCF-7 are basically consistent. Under the same conditions, MCF-7 is slightly better .Conclusion Radiotherapy after BCSG1-siRNA plasmid treatment is of better effects than radiotherapy alone, that is to say, BCSG1-siRNA plasmid can increase sensitivity of radiotherapy for breast cancer. The treatment effects of human breast cancer implanted tumor model and MCF-7 has no significant difference and we need further researches.
Keywords：Mammary Cancer； BCSG1；RNAi；Implant tumor model；Radiation sensitivity
放射治疗在癌症治疗中起到十分重要的作用，尤其是在乳腺癌的治疗中[1]。研究表明，对于中晚期乳腺癌患者来说，放射治疗可以提高其远期生存率，并降低其术后的复发风险[2]。放射治疗是指通过放射线的辐射导致肿瘤细胞DNA损伤，促使肿瘤细胞凋亡和抑制其恶性生长的一种手段。
肿瘤放射治疗抗拒是目前困扰肿瘤放射学界的难题，由于一些肿瘤细胞在发展演化过程中获得某些基因分子的变异，得以很快逃脱放疗引发的DNA双链断裂导致的细胞凋亡，使得放疗效果在一些肿瘤的治疗上很受影响。MCF-7细胞是被广泛应用以研究乳腺癌的一株模式细胞，在我们早期研究的放射治疗联合化疗下MCF-7 细胞凋亡及细胞周期的变化中已经证实MCF-7细胞是一类对X射线及化疗药物敏感的细胞株，同时其对放疗后DNA损伤的修复能力较强，完全适合本研究的要求，该细胞拥有BCSG1基因，BCSG1是否影响细胞的辐射敏感性，是我们研究的重点。 BCSG1的异常表达已被证实可导致乳腺癌对化疗药物失敏感耐受[3-5]，特异性下调BCSG1或拮抗其活性可以大幅度重新恢复癌细胞对化疗的敏感性。虽然目前尚无研究报道揭示BCSG1与放疗敏感之间的关系，但根据BCSG1在乳腺癌中的特殊地位，以及根据已有的关于其在化疗失敏感机制的研究结果，我们高度怀疑BCSG1也是造成乳腺癌对放疗失敏感的一个重要原因。本研究通过对两种乳腺癌种植瘤模型分组进行系统的BCSG1 -siRNA质粒治疗和放射治疗，分析BCSG1-siRNA质粒对乳腺癌特异性基因BCSG1表达的影响以及对乳腺癌放疗敏感性的关系，以期对提高乳腺癌放疗效果可以提出优化治疗方案，更好地提高乳腺癌病人生存率和生活质量。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂和仪器 人乳腺癌细胞为新鲜手术切除的中晚期乳腺癌组织，无菌生理盐水保存。人乳腺癌MCF-7细胞株购自中科院上海细胞库。1%戊巴比妥钠液、0.2%胰蛋白酶、纤维蛋白原及凝血酶均购自购自Sigma公司。RIPA裂解液、PMSF、BCA蛋白定量试剂盒、高分子量预染蛋白Marker购自北京鼎国昌盛生物公司，PVDF转印膜购自PALL公司，ECL化学发光试剂盒购自PIERCE公司，无菌操作台购自苏州江东精密仪器有限公司；外科显微镜购自日本尼康公司。直线加速器采用德国西门子公司的Primus 型。
1.1.2 实验动物 实验用裸鼠为SPF级BALB/C雄性裸小鼠，购于上海斯莱克实验动物有限责任公司(即中国科学院上海实验动物中心)。4～6 周龄，体重10～20 g，雌雄各半，共30只。各裸小鼠皮肤红润，活动积极，生活状况良好。饲养于上海吉凯基因化学技术有限公司实验动物中心SPF级词养室，高压灭菌饮用水和伺料定期喂养，动物房温度保持在23℃-25℃，湿度保持在40%~60%。实验进行前，首先将裸鼠在郑州大学动物中心裸鼠饲养室内适应性饲养1周。
1.2 实验方法
1.2.1 实验动物分组 将两种种植瘤模型的小鼠随机分为6组，每组5只，见表1，按以下治疗方案进行治疗。
表1 各组小鼠治疗方案
1.2.2 纳米粒治疗 肿瘤种植成功后开始治疗。所有治疗及对照组均采取小鼠尾静脉注射途径。每周给药两次，所有实验组以同剂量溶剂、同时间、同次数注射。
1.2.3 X线放疗 X线放疗为清醒状态下进行。照射条件:吸收剂量率：1Gy/min；源皮距(SSD)：100cm；照射野：4cm×4cm；屏蔽防护：自制低熔点铅屏蔽盒，铅厚度为8cm；组织补偿：加1cm厚蜡块。裸鼠对放射线的耐受性，连续进行三天照射，每天一次。
1.2.4 标本采集 按照表的治疗方案进行治疗完毕后，实验结束。将各组裸鼠颈椎脱臼处死，迅速剪开皮肤，完整剥离肿瘤肿块；用游标卡尺测量瘤体的长径（a）、短径（b），按公式V=1/2ab2求出肿瘤近似体积（V），称取瘤重；进行统计学处理，计算出P值；，一半组织以液氮速冻处理后于-80℃低温保存，用于分子生物学检测，由RT-PCR荧光定量试验测得BSCG1-mRNA表达定量分析；细胞免疫组化实验Western blot测出BSCG1蛋白表达水平，应用流式细胞仪检测细胞凋亡率；一半石蜡包埋，与肿瘤组织一同摘取的小鼠内脏，淋巴结进行肿瘤细胞组织学检查。如发现肿瘤转移灶，则进行病灶计数。
2 结果
2.1 瘤体体积及重量 治疗结束后，将各组标本进行体积及重量测量。按公式V=1/2ab2求出肿瘤近似体积（V）；按照公式肿瘤抑制率=(对照组瘤重-实验组瘤重)/对照组瘤重×100% 计算肿瘤抑制率结果，如表2所示。
表2 治疗结束后瘤体体积及重量
2.3 流式细胞术检测细胞凋亡率 流式细胞术检测细胞的凋亡率结果如下图1-6和表4所示。
图1 A组结果
图2 B组结果
图4 D组结果
图6 F组结果
表4 各组肿瘤组织细胞凋亡率
2.4 肿瘤细胞转移情况 经组织学检查，各组小鼠均无肿瘤细胞向其他组织转移的情况。
3 讨论
本研究主要对人乳腺癌种植瘤模型和MCF-7细胞种植瘤模型进行了BCSG1-siRNA纳米粒治疗及X-线放疗的实验。在本实验中，分别将两种种植瘤小鼠分为6组，分别进行质粒治疗和不同剂量的X线放疗方案，以期对BCSG1-siRNA治疗是否影响放疗敏感性进行分析研究。具体为对A组进行为期两周的BCSG1 - siRNA纳米粒治疗，而后进行为期三天的2Gy/次/天 X线放疗；对B组进行为期两周的BCSG1 - siRNA纳米粒治疗，而后进行为期三天的5Gy/次/天 X线放疗；对C组进行为期两周的BCSG1 - siRNA纳米粒治疗；对D组进行为期三天的2Gy/次/天 X线放疗；对E进行为期三天的5Gy/次/天 X线放疗；对F组不做任何治疗作为对照组。治疗结束后结果可见，不管是人乳腺癌种植瘤组，还是MCF-7细胞种植瘤组，小鼠瘤体体积及重量由小到大排序均为A<B<E<C<D<F，同样可见，各组BCSG1 - mRNA表达水平及蛋白表达量均基本符合A>B>E>C>D>F的顺序，也就是说，各组的治疗效果可以评价为A>B>E>C>D>F，即BCSG1 - siRNA纳米粒治疗+高剂量射线放疗的治疗效果最明显，其次为BCSG1 - siRNA纳米粒治疗+低剂量射线放疗组、单独高剂量放疗组、单独BCSG1 - siRNA纳米粒治疗组、单独低剂量放疗组。由此可见，加入BCSG1 - siRNA纳米粒治疗后进行放疗的效果要优于单独进行放疗，即BCSG1 - siRNA纳米粒可以提高放疗的敏感性。
另外，由实验结果可以看出，人体乳腺癌种植瘤模型与MCF-7种植瘤模型的结果基本一致，但是同等条件下，MCF-7细胞种植瘤模型的效果要略微优于人体乳腺癌种植瘤模型。从某种程度上来说，人体乳腺癌种植瘤模型是较为贴近人体乳腺癌组织的基因和生物学特性，因此可以推断，即使有些生物学实验在MCF-7细胞种植瘤模型上效果较好时，在实际人体组织中应用时的情况并不一定理想，即细胞系种植瘤模型与实际人体组织之间有一定差异性。当然，也可能有其他原因导致了人体乳腺癌细胞在小鼠体内的生物学特性产生了变化，具体原因尚需要临床工作者进行进一步的研究。
研究已经表明，放疗的作用机理主要是将射线直接作用于有机分子，根据大量放射线的能量，破坏细胞的染色体，阻值细胞的分裂。另外，由于射线导致人体组织液发生电离，产生自由基和大分子发生作用，引起DNA分子出现断裂、交叉等不可逆的损伤，从而干扰癌组织的恶性扩大。细胞对放射线的敏感性是在分裂期最高，在DNA合成期其敏感性最低，主要针对快速生长分裂的细胞，所以放射疗法不那么损伤周围正常组织，但放射治疗一般仍然只是进行局部治疗，因此只对肿瘤细胞及其周围组织产生作用，从本实验中对照组的细胞凋亡率显著低于实验组即可看出。已有大量文献报道了关于提高放疗敏感性的方法和手段[6-11]。在乳腺癌放疗中，也有大量学者进行了提高放疗敏感性的研究。艾秀青等[13]发现Survivin表达水平与放疗敏感性之间存在密切关系，可以作为预测乳腺癌放疗敏感性、疗效评价及预后的指标；贾谊君等[13]实验发现，在低氧环境下，对于乳腺癌组织放疗联合叶酸修饰稀土改性载氧碳纳米管组相比于单纯放疗组细胞克隆形成率有不同程度的降低。王晓红等[15]研究发现BCSG1分子和蛋白水平在三阴乳腺癌化疗后均明显降低，与新辅助化疗后疗效呈负相关(r=0.704，P=0.000)，提示BCSG1可作为三阴乳腺癌新辅助化疗疗效的预测因子。 因此可以看出，降低乳腺癌特异性基因的表达水平对于提高放疗的敏感性有着积极作用。本研究通过对两种乳腺癌种植瘤模型分组进行系统的BCSG1 - siRNA质粒治疗和放射治疗，分析BCSG1 - siRNA质粒对乳腺癌特异性基因BCSG1表达的影响以及对乳腺癌放疗敏感性的关系，以期对提高乳腺癌放疗效果可以提出优化治疗方案。
乳腺癌MCF-7细胞株是对X-线较为敏感的组织，且其对于DNA损伤后的修复功能较强。BCSG1是在该组织内高表达的特异性基因，因此，BCSG1是否在此DNA修复过程中发挥着至关重要的作用尚不得而知。经过本课题的实验研究，可以看出，通过RNAi手段下调BCSG1的表达后，对于乳腺癌组织的放疗敏感性得到了提高，BCSG1的表达水平显著降低，细胞的凋亡率增加。因此，可以推测，BCSG1基因在乳腺癌放射治疗中发挥了一定拮抗作用。BCSG1在促进乳腺癌发展的机制中，其中之一为增强细胞的抗凋亡能力，这与BCSG1促进雌激素与受体结合的功能有关。因此可以看出，常规放疗手段下，BCSG1发挥着抑制细胞凋亡的作用，拮抗放疗的效果；一旦采取手段如引入siRNA的RNA抑制BCSG1的表达，放疗的效果便得到了提高。这一结论可以为研究乳腺癌的临床工作者提供实验基础和理论依据，但BCSG1拮抗乳腺癌放疗敏感性的具体机制也需要进一步研究和确定。
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论文作者:郑瑞锋1,罗俊波1,申培红2*,王彦威1,文海英1
论文发表刊物:《中医杂志》2016年12月
论文发表时间:2017/6/1
标签：乳腺癌论文; 细胞论文; 敏感性论文; 肿瘤论文; 模型论文; 小鼠论文; 基因论文; 《中医杂志》2016年12月论文;