孙煜[1]2003年在《建立盐藻遗传转化系统的研究》文中指出盐藻(Dunaliella salina)是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻,可以用作研究植物细胞对胁迫反应的模式生物,也具有重要的生物工程应用价值。盐藻的遗传转化是对盐藻进行分子遗传学研究的必需技术。本论文介绍了解决这一问题的主要研究工作:(1)、研究盐藻电击转化中电场强度对细胞存活和外源DNA导入效率的影响,确定了盐藻电击转化的基本参数;把含有ble基因的质粒通过电击转化导入盐藻细胞,检测到ble基因在72小时内能够滞留和转录表达;随后在含有抗生素Zeocin的培养基上得到了抗性转化子,Southern分析表明在6个月的传代培养后在细胞中仍然能够检测到转化质粒,但随着进一步传代培养逐渐丢失。(2)、从盐藻cDNA文库和基因组文库中筛选得到硝酸还原酶cDNA及其基因,序列分析表明与其它真核藻类中硝酸还原酶基因同源性达到75%,相似性达到89%;Northern分析表明该基因的转录表达受到硝酸盐诱导,在诱导后6小时达到最高表达;构建含有盐藻硝酸还原酶cDNA片段的转化载体,在硝酸还原酶基因缺陷的莱茵衣藻中得到了互补表达。(3)、利用亚硝基胍诱变、氯酸盐富集的方法筛选得到39株稳定的硝酸还原表型缺陷的盐藻突变体;Southern分析显示突变体B14有明显的基因片段缺失,PCR和序列测定显示该突变体缺失了1314bp基因组片断,包含有223bp编码区序列;利用野生型硝酸还原酶基因互补转化突变体B14,得到了表型互补的转化子,但没有发现转化基因插入现象。以上的工作明确了盐藻电击转化的主要条件,并分离鉴定了建立互补转化系统的供体和受体,将有助于对盐藻的遗传转化进行更深入的研究。
李克锦[2]2007年在《杜氏盐藻外源基因转化系统的建立》文中进行了进一步梳理本文以杜氏盐藻(Dunaliella salina)为研究对象，建立了杜氏盐藻外源基因的转化系统，为下一步杜氏盐藻转化植酸酶基因的研究奠定了基础。本文主要的研究内容及结果如下：本文从盐藻培养液中分离到5种菌，选择了卡那霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、头孢霉素、氯霉素、链霉素、新霉素7种常用的抗生素对其进行敏感性实验，筛选出链霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、头孢霉素，氯霉素5种菌较敏感的抗生素，并通过实验得出这几种抗生素之间的作用是累加的。考察了不同浓度的链霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、头孢霉素，氯霉素对盐藻生长状况的影响，结果表明氯霉素对盐藻的生长有很大的抑制作用，盐藻对于氯霉素最为敏感，而其它4种抗生素浓度达到1600μg／mL，培养10天时，藻的生长状态仍较好；选用链霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、头孢霉素进行联合除菌，结果显示当每种抗生素的浓度均为800μg／mL、处理3次后，用平板法分离纯化盐藻可得到无菌的盐藻。选择了氯霉素、G418、潮霉素3种抗生素做盐藻基因工程选择标记实验。结果表明氯霉素可以作为盐藻基因工程的筛选抗生素，CAT基因为其阳性筛选标记基因，固体培养基筛选浓度为80μg／mL。优化了无菌盐藻的培养条件。对C、N、P叁种大量元素和维生素进行了优化。在单因素实验的基础上做了四因素叁水平正交实验，得到优化组合为NaNO_3和NaH_2PO_4为f／2培养基的10倍、NaHCO_30.4g/L、V_(B1)100μg／L、V_(B12)1.0μg/L，其他营养盐按f／2培养基添加。利用电击法将GFP基因转入到无菌杜氏盐藻细胞中，研究了电击转化条件、藻的生长状态对转化率的影响，结果得出培养7天的盐藻细胞在3KV的脉冲电压、3ms的脉冲时间下可获得较高的转化率，为转化的最优条件。
许政暟[3]2000年在《利用基因功能互补建立盐藻遗传转化系统》文中研究说明盐藻是一种无细胞壁的真核单细胞绿藻,有很强的抗逆能力,它可以在不同NaCl浓度(5mM-5M)的环境中生长,对强光、低温、重金属等也有较强的耐受性.在胁迫环境中,盐藻会产生大量甘油和β-胡萝卜素.鉴于盐藻对渗透胁迫的极端耐受性及其经济价值,长期以来它一直受到广泛注意.但是盐藻的分子遗传学研究进展一直不大,因而影响了人们对盐藻的开发利用.分析其主要原因可能是盐藻的遗传转化系统一直未能真正建立.经过各种试验后,我们采用了诱变技术筛选营养缺陷致死突变体盐藻,再
潘卫东[4]2003年在《杜氏盐藻（Dunaliella salina）叶绿体转化研究》文中提出近些年来，人们在转基因植物方面进行了大量的研究。与微生物发酵、动物细胞和转基因动物等生产系统相比，转基因植物不需要昂贵的设备和严格的培养条件，具有光合自养、成本较低，植物病毒不感染人类等优点，已成为一类比较廉价和安全的生物反应器。然而高等植物培养周期过长，生长受季节性限制，因此许多研究兴趣集中到生长迅速，培养易的单细胞绿藻上。 杜氏盐藻属绿藻门绿藻纲团藻目，除缺乏细胞壁外，其形态和结构特征与衣藻十分相似，是一种原生质裸露的嗜盐性浮游单细胞藻，长约6-15μm，呈椭圆形或梨形，有双鞭毛，能在水中游动。有一个大型杯状叶绿体约占细胞体积的48％左右。该藻的突出优点在于抗逆性极佳，可在0.05M-5M的盐水中生长，最佳生长繁殖盐度为2-3M，是目前已知最耐盐的真核生物。由于杜氏盐藻可在高渗盐溶液中生长，这是许多其它生物难以生存的环境，故其大规模培养不需昂贵的发酵罐或其他培养装置，可以直接采用开放式培养，大大降低生产成本。因此，杜氏盐藻是生产药用蛋白的良好宿主。 植物的细胞核转化技术已发展成熟并得到广泛应用，但核基因组的遗传转化仍存在一系列至今尚未解决的问题：例如由于核基因组大，背景复杂，外源基因的整合位点和整合的拷贝数难以人为控制，造成郑州大学2003年博士学位论文杜氏盐藻(Dunaliella salina)叶绿体转化研究外源基因表达效率低，容易出现基因失活、基因沉默、位置效应等现象;同时转入多个基因时操作步骤过于复杂，所表达的原核基因必须经过修饰改造，环境安全难以保证等。 叶绿体转化系统的出现为克服这些困难带来了希望。与核转化相比，叶绿体基因组小，遗传操作简单，外源基因是通过同源重组机制定点整合进叶绿体基因组。定点整合有利于人为控制外源基因的插入位点，可以将目的基因定位在适于表达的位点，能较好地解决“顺式失活”、“位置效应”等类的基因沉默问题。由于叶绿体中DNA分子有多个拷贝，同时叶绿体对表达产物的积累有较强的承受能力，保障了外源基因在叶绿体中的高效表达。另外，由于叶绿体基因组的原核性质，对来自原核生物的外源基因无需改造就可以在叶绿体内高效表达，而且可以将多个外源基因采取“多顺反子”的原核表达形式同时引入，并由共同的启动子控制，既方便操作又可避免由于存在多个相同启动子所带来的“共沉默”。这是核基因转化无法做到的。 为建立杜氏盐藻叶绿体转化体系，我们研究了杜氏盐藻对7种基因工程研究中常用的抗生素及除草剂的敏感性;利用绿色荧光蛋白(E血anced盯een nuoreseent protein，EJP)为报告基因，验证了莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中的生物活性，并构建载体转化盐藻，初步建立了杜氏盐藻叶绿体转化体系，为今后转基因盐藻生物反应器的建立和应用打下基础。 方法: 根据杜氏盐藻的近缘藻类的叶绿体基因组序列资料，在基因编码区的高度保守区域设计引物，克隆了杜氏盐藻叶绿体165识NA基因、咖L基因和ch】N基因，并分别以165识NA基因和chlN基因序列为同源片段，以CAT和bar基因为筛选标记基因构建了叁套杜氏盐藻叶绿体转化载体: 2郑州大学2003年博士学位论文杜氏盐藻(D~Iiella salina)叶绿体转化研究pDS 165一eAf、pTN1269一bar和psp72一5一bar一3，用基因枪法转化杜氏盐藻，初步建立起杜氏盐藻叶绿体转化体系。 结果: 1.研究了杜氏盐藻对氯霉素、新霉素、链霉素、卡那霉素、G4 18、壮观霉素和除草剂草丁嶙(P hosphinotricin，PPT)等7种基因工程研究中常用的抗生素及除草剂的敏感性。实验结果表明，杜氏盐藻对卡那霉素、新霉素、G418和链霉素极不敏感，当这些抗生素用量高达600p创ml时，仍不能抑制杜氏盐藻的生长;壮观霉素对杜氏盐藻的生长有一定抑制作用，但用量较高，浓度为200、岁ml以上才能明显抑制杜氏盐藻的生长，并且即使用量高达600p留ml时仍不能完全杀死杜氏盐藻;杜氏盐藻对氯霉素敏感，50协留ml的氯霉素即可明显抑制杜氏盐藻的生长;100协留ml的氯霉素可杀死杜氏盐藻，200协留ml以上的氯霉素经10天左右即可杀死杜氏盐藻。此外，杜氏盐藻对除草剂草丁磷高度敏感，当培养液中草丁嶙浓度为1协留ml时，杜氏盐藻的生长就受到明显的抑制;草丁嶙浓度达到4协留ml时，培养3至5天即可明显观察到杜氏盐藻细胞的白化和死亡。 2.莱茵衣藻叶绿体吻A启动子在杜氏盐藻叶绿体中的生物活性 我们选取绿色荧光蛋白为报告基因，将报告基因插入殉A启动子与rbcL终止子之间，构建了质粒pSP71一atPA一EGFP，通过基因枪法转入杜氏盐藻，在荧光显微镜下观察到EGFP基因在杜氏盐藻叶绿体中得到了表达。 3.杜氏盐藻叶绿体165出NA基因的克隆和转化载体的构建 根据杜氏盐藻的近缘藻类的叶绿体基因组序列资料，克隆了杜氏盐藻叶绿体16SrRNA基因部分序列1100bp，并利用克隆的16SrRNA郑州大学2003年博士学位论文
蔡艺钦[5]2014年在《海洋球石藻（Emiliania huxleyi）遗传转化系统的建立及初步功能分析》文中研究指明海洋球石藻(Coccolithophores)是一类单细胞海洋微型浮游植物,广泛分布于世界范围的近海和大洋水域中,在地质学、生物地理学、古气候学、生态生理学、材料科学和医学等领域中具有重要的研究价值。作为大洋环境中重要的初级生产者,海洋球石藻能够产生丰富的次级代谢生物活性物质,在生物技术研究领域具有广阔的应用前景。球石藻细胞能够合成大量聚酮类化合物,具有良好的抗菌、抗虫、抗肿瘤等生物学活性。引人注目的是,球石藻中最重要的种类Emiliania huxleyi能被特异性病毒感染并随着宿主细胞的裂解释放出大量神经酰胺类(Ceramide)物质,这可能是由于病毒在某种程度上控制着宿主神经酰胺的代谢过程,并通过大量合成神经酰胺类物质诱导宿主细胞凋亡。神经酰胺是细胞中的一种信号传导物质,对细胞分化、增殖、免疫、凋亡及衰老等生命活动具有重要调节作用。作为一种新型的生物活性物质,神经酰胺特有的生理功能及药物功效使其成为一种附加值极高并具有巨大市场潜力的活性物质,在化工、医药、食品、特别是高档护肤品等领域中具有广阔的应用前景。神经酰胺在细胞中的含量甚微,一般在0.01?0.2%(干重)左右。海洋球石藻E.huxleyi在病毒感染条件下,其细胞中神经酰胺的含量可达到细胞干重的0.091%。尽管与其他生物相比,其细胞中神经酰胺相对含量并不是很高,但球石藻神经酰胺独特的结构特点使其生物学活性远远高于任何陆地生物来源的神经酰胺。微藻基因工程是一种复杂而快速发展的生物技术,可作为操纵微藻代谢通路的强有力工具。通过微藻基因工程技术可以改造海洋球石藻鞘脂类合成代谢途径的关键环节,使其有利于高效合成并积累神经酰胺,从而有效提高细胞中神经酰胺的产量。目前有关海洋球石藻遗传转化系统及其应用研究国内外尚未见报道。本论文以海洋球石藻E.huxleyi(EhBOF92)及其特异性裂解病毒EhV-99B1为研究对象,构建海洋球石藻真核表达载体、建立其遗传转化方法,在此基础上将病毒基因组中神经酰胺合成第一限速酶丝氨酸棕榈酰转移酶(SPT)催化亚基LCB2基因亚克隆入表达载体并转化宿主藻细胞,检测LCB2基因表达水平及其对宿主细胞神经酰胺合成的影响。主要研究结果如下:(1)抗生素抗性基因的筛选及其克隆:选择氨苄青霉素、卡那霉素、G418、氯霉素、链霉素、新生霉素及嘌呤霉素等7种常用抗生素和除草剂草铵膦,以球石藻生长率为指标,从上述化学物质中筛选适宜的抗生素。结果表明,海洋球石藻对氨苄青霉素、卡那霉素和链霉素等不敏感,对氯霉素和新生霉素较敏感,而对G418、嘌呤霉素和草铵膦则高度敏感。综合分析最终选择G418作为球石藻基因工程藻株的选择性抗生素,其对应的抗性基因neo作为构建海洋球石藻真核表达载体的选择标记基因。从pSELECT载体中PCR扩增获得neo基因并通过测序验证。(2)启动子及报告基因的选择:从pGFP载体中PCR扩增获得绿色荧光蛋白基因gfp作为报告基因并通过测序验证;采用生物信息学方法筛选启动子,并对启动子序列进行综合分析。本文选择球石藻内源性fcp(岩藻黄素叶绿素a/c结合蛋白启动子)启动子,从基因组中PCR扩增该基因并利用PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/)和Plant CARE(http://bioniformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)数据库对其序列中的顺式作用元件、增强子和阻遏因子等进行预测和分析。结果表明,fcp启动子序列包含大量的顺式作用元件,具有潜在的强启动子活性。(3)表达载体的构建及其转化方法的建立:以pUC18为基础载体,成功构建了双元重组表达载体pUC18-gfp-fcp和pUC18-fcp-neo,利用电击法共转化海洋球石藻。转化条件的优化结果为:选择对数中期细胞,质粒DNA浓度为10μg/mL(高纯度),电击缓冲液为0.080 mol/L KCl、0.005 mol/L CaCl2、0.2 mol/L甘露醇、0.2 mol/L山梨醇、0.01 mol/L Hepes、pH 7.2,电场强度为2000 V/cm,电击时间为2 ms/次、电击2次。荧光显微镜及实时荧光定量PCR验证结果表明:成功获得转化的藻细胞,转化效率为0.07%。fcp启动子能够在球石藻细胞中启动gfp基因和neo基因的相对高效的表达。(4)球石藻病毒SPT对宿主神经酰胺合成的影响:从病毒基因组中克隆SPT(EC2.3.1.50)的催化亚基LCB2基因片段,构建了含有EhV99B1-LCB2基因的重组表达质粒pUC18-fcp-neo-LCB2,采用电击转化法将其与重组质粒pUC18-gfp-fcp进行共转化导入球石藻细胞中,经PCR验证获得含有病毒LCB2基因的球石藻基因工程藻株。通过高效液相色谱(HPLC)法对藻细胞中神经酰胺含量进行检测。结果表明:球石藻转化组细胞中神经酰胺含量达到45.25 fg/cell,是对照组的1.2倍,说明EhV99B1-LCB2一定程度上能够促进宿主细胞神经酰胺的合成。本研究初步建立的海洋球石藻稳定的遗传转化系统将为进一步开发功能获得型突变藻株(如病毒基因组中能够促进宿主细胞神经酰胺合成的基因)或基因敲除突变体藻株(如敲除神经酰胺水解酶基因)提供技术工具,为实现新型神经酰胺类物质产业化奠定基础。
檀琮萍[6]2006年在《两种真核微藻类胡萝卜素代谢工程的初步研究》文中进行了进一步梳理类胡萝卜素在生物体内具有重要的生理功能,其中虾青素的抗氧化活性、提高动物的免疫能力,预防癌症等生理功能更为显着。类胡萝卜素的代谢工程在大肠杆菌、酵母和高等植物中已取得了较大的进展。本文对真核微藻类胡萝卜素代谢工程进行了初步的探索。1.克隆雨生红球藻β-胡萝卜素羟化酶基因crtR-B,基因枪法转入衣藻叶绿体,经强光处理转化子,HPLC分析表明细胞的叶黄素库(V+A+Z)量较野生型增加,表明是外源的β-胡萝卜素羟化酶将β-胡萝卜素生成玉米黄素。2.克隆雨生红球藻β-胡萝卜素酮化酶基因bkt,基因枪法转入衣藻叶绿体,RT-PCR及RT-PCR Southern blot分析表明外源基因具有转录活性,但未检测到转化子中积累虾青素。3.根据盐生杜氏藻大量积累β-胡萝卜素的特点,对其遗传转化体系进行了研究。发现20μg/ml草丁膦Basta,能够完全抑制1.0×10~6个/ml细胞生长;通过GUS报告基因在细胞内的瞬时表达,确立了轰击压力450 psi、距离6 cm为基因枪法转化盐生杜氏藻的最佳条件;将bar基因转入细胞,得到稳定的转化子,初步建立了盐生杜氏藻稳定遗传转化体系。克隆了盐生杜氏藻八氢番茄红素合成酶基因psy的cDNA序列、基因组序列及psy基因上游459 bp片段。本文首次开展了衣藻类胡萝卜素代谢工程研究,发现在强光处理下,衣藻crtR-B转化子外源的羟化酶作用使叶黄素库量增加,实现了对衣藻类胡萝卜素代谢途径的修饰。确立了bar基因为选择标记、Basta为筛选试剂的基因枪转化盐生杜氏藻的遗传转化体系,并克隆了其内源的psy基因5'上游序列,为通过基因工程手段在盐生杜氏藻细胞内积累虾青素奠定了基础。
李丁[7]2013年在《以潮霉素为筛选标记的水稻叶绿体转化体系的建立》文中提出在植物细胞中,DNA遗传物质不仅存在于细胞核内,也存在于叶绿体中。传统的细胞核遗传工程存在诸如基因沉默、失活、位置效应、多基因同时转化困难、花粉漂移等弊端,而作为新型转基因途径的叶绿体转化技术可有效克服常规核转化中的诸多不足。利用同源重组机制,叶绿体转化技术可将外源基因定点整合到叶绿体基因组中,有效地避免位置效应等基因沉默难题。叶绿体基因组自身的原核结构、高拷贝数和母系遗传等特点,为外源基因获得高效表达提供了平台,而且外源基因不会随花粉扩散造成环境污染。目前,双子叶植物尤其是烟草的叶绿体转化技术已经非常成熟,并且在生物反应器方面具有重要的应用价值。但在单子叶植物水稻中,该技术尚未得到有效应用。水稻(Oryza sativa L.)作为全球最重要的谷物之一,与人类的生活密不可分。叶绿体转化技术这一新兴的育种手段在水稻中的建立,将为实现农业的可持续发展提供帮助。本文开展了水稻的叶绿体遗传转化研究,尝试建立水稻叶绿体转化的标准程序,主要内容如下：1.利用6种常用的基因工程试剂测试水稻愈伤组织的敏感性,确定了以潮霉素、氯霉素和草丁膦为筛选压力,其抗性基因hpt、CAT和bar基因为选择标记基因,来构建水稻叶绿体遗传转化系统。2.以水稻9311叶绿体基因组序列trnl-trnA为同源重组序列,烟草叶绿体调控元件5'16SrRNA为启动子,烟草叶绿体3'psbA为终止子,以增强型绿色荧光蛋白基因(EGFP)为报告基因,构建水稻叶绿体荧光表达载体。其中,在EGFP基因的上游5'端设置了一系列不同的Leader序列(其mRNA可与核糖体结合)。在大肠杆菌原核系统中,分析了这一系列不同的Leader调控序列对EGFP基因表达的影响。结果表明,Prrn启动子需在Leader序列的辅助下才能使EGFP基因得到表达,而单独的Prrn启动子不能启动EGFP基因的表达。通过测量大肠杆菌的荧光值,发现Prrn启动子在T7g10Leader序列配合下获得的荧光值最高。荧光强弱顺序为：Prrn+T7g10Leader> Prrn+rbcL Leader>Prrn+atpB Leader>Prrn+psbA Leader>Prrn+RBS>Prrn。选择在大肠杆菌中荧光表达最强的水稻叶绿体荧光载体pUIPEBA7(trnI-Prrn-T7g101-EGFP-TpsbA-trnA),对洋葱表皮细胞和杜氏盐藻细胞进行基因枪轰击,报告基因EGFP在洋葱表皮细胞和杜氏盐藻叶绿体中得到瞬时表达,证实了该载体上的调控元件和基因枪转化方法的适用性。3.在水稻叶绿体荧光载体pUIPEBA7的基础上,分别加入了hpt基因、CAT基因、bar基因3个标记基因,分别得到3个水稻叶绿体遗传转化载体pCTE04, pCTE05和pCTE06,并对4个水稻品种的幼胚和愈伤分别进行基因枪轰击。对T0代转化植株进行分子检测,PCR和Southern blot结果证实pCTE04载体上的hpt和EGFP基因成功整合到水稻TP309叶绿体基因组的trnI-trnA位点。对T1代转化植株进行RT-PCR检测,表明hpt和EGFP基因在叶绿体中得到转录水平上的表达,共聚焦荧光扫描显微镜检测到EGFP基因在叶绿体中表达出绿色荧光。上述结果表明,以潮霉素作为筛选压力建立了水稻叶绿体遗传转化系统。4.尽管hpt和EGFP外源基因在叶绿体中得到表达,但是未能获得同质化植株,而且水稻的叶绿体转化效率很低。针对这一问题,我们在水稻核转化中,加入Co60γ射线辐照处理,探讨辐射对基因枪转化效率的影响。结果表明轰击后的愈伤经过适宜剂量的γ辐射处理,转化频率得到提高。其中,30Gy剂量处理后的愈伤转化效率比未辐射愈伤的转化效率高出2倍。在后期水稻叶绿体转化体系的优化中,将加入Co6γ辐射处理,以期能够提高叶绿体转化效率。
谢华[8]2004年在《杜氏盐藻（Dunaliella salina）硝酸盐还原酶基因的克隆、表达及功能鉴定》文中提出植物中的硝酸盐还原酶(nitrate reductase，NR)作为限速酶，催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，这一过程在氮代谢中处于关键地位，对植物生长发育、产量形成有重要影响。目前NR基因已经从一系列物种分离得到，尤其是人们发现氯酸盐对表达NR活性的细胞具有毒性作用，能够很容易的对有或无NR活性的细胞进行筛选之后，已经逐步在一些物种中利用NR基因作为选择标记进行转基因研究。目前利用NR基因作为选择标记在真菌和藻类(如衣藻等)应用较多，已有多种真菌和微藻利用NR基因作为选择标记进行了转基因的研究。但有关杜氏盐藻NR基因的克隆及NR基因选择标记的研究尚未见报道。 杜氏盐藻(Dunaliella salina，D．salina)属绿藻门团藻目多睫毛科，是一种生长在海水或盐湖的嗜盐性浮游单细胞真核生物，无细胞壁，呈梨形，胞内有一个大的杯状叶绿体，具双鞭毛，可在水中游动。其耐盐能力强，抗逆性极佳，可在0.05M-5M的盐水中生长，是迄今所发现的世界上最耐盐的植物之一，正越来越受到人们的关注。除了与光合作用以及抗盐性有关的研究外，最近有关盐藻作为生物反应器的研究也有报道。 盐藻作为生物反应器，具有繁殖速度快、培养简单、营养成分含量高、表达产物下游纯化过程简单等优越性。在利用盐藻生物反应器表达外源基因时，从大量未转化细胞背景中筛选并获得稳定转化子，必须依赖于选择标记基因。目前有关盐藻选择标记的研究较少，主要有除草剂、抗生素等的初步研究，这些选择标记在利用盐藻生物反应器大规模表达外源蛋白时有一定的缺陷，如除草剂本身可能造成一定的环境污染，除草剂抗性基因可能会由于基因漂移式扩散传递至杂草等而导致生态灾难；抗生素抗性基因一方面成本较高，同时可造成环境污染，也可引起人类对这些抗生素产生抗性等等。因此，在盐藻生物反应器的建立过程中，选择合适的选择标记进行转基因研究是迫切而必要的。郑州大学2004年博士论文杜氏盐藻(刀朋口Iiella:a枷a)硝酸盐还原酶基因的克隆、表达及鉴定 与上述盐藻选择标记相比，NR基因作为选择标记具有下列优越性:1.遗传上比较稳定，转化效率高;2.筛选简单:转化NR基因突变藻株后，在含硝酸盐的培养条件下，转化藻株能够抗氯酸盐毒性，而非转化藻株不能抗氯酸盐毒性，因此通过氯酸盐抗性进行筛选，可以较为容易的得到转化株;3.转化NR基因突变藻株后，非转化株在硝酸盐培养、氯酸盐压力筛选的条件下生长受到限制，因此未转化细胞背景低;4.NR基因为硝酸盐诱导型基因，便于遗传操作;5.硝酸盐本身为植物的氮素营养的主要来源，成本较低，对环境无污染。因此在转基因盐藻研究中，NR基因是更加适合盐藻自身的、安全的选择标记基因，对建立杜氏盐藻遗传转化系统，使外源目的基因在其中稳定表达、生产目的产品具有十分重要的意义。 建立NR基因选择标记是通过克隆NR基因，并将该基因转化NR基因突变株，使突变株恢复野生型活性而建立选择体系。目前杜氏盐藻NR基因营养缺陷型突变藻株的制备及鉴定工作，本研究室正在建立。本论文主要完成杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因选择标记建立过程中NR基因的克隆、表达载体的构建、NR基因完整性的鉴定以及基因枪转化方法的研究，为进一步建立杜氏盐藻NR基因选择标记奠定基础。 实验方法 1.杜氏盐藻NR基因cDNA序列的克隆和序列分析 1.1利用简并引物扩增杜氏盐藻NR基因cDNA片段及序列分析 通过对GenBank上登陆的不同物种NR氨基酸序列进行比较，筛选出在其中具有高度保守性的序列，根据该氨基酸序列设计简并引物，利用PCR的方法扩增得到了杜氏盐藻NR基因部分cDNA片段，将其插入克隆载体pMD一18，转化大肠杆菌JM109，经氨节青霉素抗性和蓝白斑试验筛选阳性克隆，提质粒酶切鉴定重组质粒。对重组质粒进行基因序列测定，软件分析测序结果。 1.2利用5’RACE的方法扩增NR基因5’上游cDNA片段及序列分析 根据上述简并引物扩增出的杜氏盐藻NR基因部分cDNA片段，利用5’RACE的方法向5’上游扩增杜氏盐藻NR基因cDNA片段。由于简并引物扩增出的杜氏盐藻NR基因部分cDNA片段距5’末端较远，因而本研究共采用3次5’RACE方法，最终得到了杜氏盆藻NR基因cDNAS’端全序列。 每次所扩增的cDNA片段插入克隆载体pMD一18，经筛选和鉴定正确的质粒进行测序和序列分析。 1.3利用3’RACE的方法扩增硝酸盐还原酶基因3’下游cDNA片段及序列分析郑州大学2004年博士论文杜氏盐藻(Dunaliella，alina)硝酸盐还原酶基因的克隆、表达及鉴定测序和序列分析。 1.3利用3’RACE的方法扩增硝酸盐还原酶基因3’下游cDNA片段及序列分析 根据简并引物扩增得到的序列设计基因特异引物1(GsPI)和2(GsP2)，并设计01190(dT)一接头引物和相应的接头引物1和接头引物2。利用01190(dT)一接头引物逆转录mRNA，得到cDNA第一条链，然后利用接头引物1和GSPI进行第一轮PCR扩增，再利用GSPZ和接头引物2进行第二轮PCR扩增。将扩增得到的cDNA片段插入克隆载体pMD一18，转化大肠杆菌JM109，经筛选和鉴定正确的质粒进行测序和序列分析。 1.4杜氏?
武天祥[9]2016年在《杜氏盐藻PKC基因的克隆及表达分析》文中研究表明杜氏盐藻(Dunaliella salina)是已知最耐盐的单细胞真核绿藻,是研究植物适应高盐的模式生物。许多学者从耐盐相关基因和盐适应蛋白等方面进行了研究,取得了一些进展。但盐藻的耐盐性是由一系列相关基因、蛋白质等相互作用的结果,其分子机制十分复杂,到目前为止盐藻耐盐的分子机制和信号途径并不清楚。PKC可磷酸化多种底物蛋白如代谢途径的关键酶、离子通道及转录因子等,在调控细胞周期、生长发育、分裂分化及基因表达等方面具有重要作用。因此,深入探讨蛋白激酶C的性质及功能对于阐明盐藻耐盐的分子机制具有重要的科学意义。本研究的实验方法和结果如下:1.应用PCR技术扩增了盐藻PKC基因,成功构建了原核表达载体pET32a(+)-PKC,真核表达载体pMDCG-PKC和pRI 101-PKC,经测序验证读码框正确。2.将原核表达载体pET32a(+)-PKC导入E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导在E.coli BL21中成功表达。通过SDS-PAGE检测,融合蛋白在上清和包涵体中均有存在。将可溶性蛋白经过His柱纯化获得了高纯度的融合蛋白,Western blot结果表明,纯化的蛋白就是带有His标签的蛋白激酶C。活性分析结果表明,该蛋白激酶对Ca2+、甘油二酯辅助因子无依赖性,证明其属于非典型的PKC亚型。3.将真核表达载体pMDCG-PKC导入农杆菌GV3101感受态细胞中,通过农杆菌介导法浸染洋葱内表皮细胞,使盐藻PKC在洋葱表皮细胞中成功表达,在荧光显微镜下,发现PKC分布于细胞膜和细胞质。用0.5mol/L NaCl处理洋葱表皮细胞,观察到PKC从细胞质向细胞膜转移。4.通过冻融法将真核表达载体pRI 101-PKC转入农杆菌GV3101,采用叶盘法用农杆菌浸染烟草叶片,获得了转基因植株。以烟草叶片的总DNA为模板进行PCR扩增,结果从3棵植株中得到2000bp的特异性扩增条带,而未转化的植株中无该片段的产生,初步证明PKC基因已转入烟草。
郝敬云[10]2016年在《杜氏盐藻电转化体系的建立与外源VgDGAT1a基因的遗传转化》文中研究表明杜氏盐藻(Dunaliella salina)是单细胞真核绿藻,富含类胡萝卜素。培育富油杜氏盐藻是拓展其利用盐碱地及其水体资源生产优质生物燃油的关键。为此,本文以杜氏盐藻为试材,以来自高油植物斑鸠菊(Vernonia galamensis)编码高DGAT酶活性的VgDGAT1a基因为靶基因,通过遗传转化以期培育优异的高油杜氏盐藻株系。主要研究结果如下：(1)建立了盐藻纯化体系。对头孢霉素、氯霉素、链霉素和氨苄青霉素去除盐藻培养杂菌污染效果的测试表明,各抗生素除菌作用可累加,且4种抗生素两两组合的除菌效果更好。(2)杜氏盐藻对抗生素的耐受性实验表明,盐藻对氯霉素的耐受性差。在培养5天时,加入氯霉素的盐藻藻液颜色发黄,细胞分解,内容物流出。与对照组相比,高浓度的头孢霉素、链霉素和氨苄青霉素(1000μg/m L)对盐藻细胞的生长未产生影响。(3)建立了盐藻的电转化优化体系。当质粒为6μg/m L时,在0.4KV、4ms电击条件下,对培养7天的盐藻进行电转化,转化效率最高可达2.1‰,明显高于盐藻常规电转化方法转化效率。(4)尼罗红染色结果表明,与野生型盐藻相比,转基因盐藻细胞内油脂体的大小和数目发生了显着的变化,油脂体数目增多,油脂体的体积变大。(5)利用重量法测定盐藻细胞内总脂的含量,结果表明转基因盐藻细胞内的总脂占干重的百分比为37%,与野生型相比提高了21.7%。(6)利用凯式定氮仪和丙酮法对野生型和转基因盐藻分别测定蛋白和类胡萝卜素含量,结果表明转VgDGAT1a基因对盐藻细胞中蛋白和类胡萝卜素的积累没有产生显着影响。
参考文献：
[1]. 建立盐藻遗传转化系统的研究[D]. 孙煜. 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）. 2003
[2]. 杜氏盐藻外源基因转化系统的建立[D]. 李克锦. 大连理工大学. 2007
[3]. 利用基因功能互补建立盐藻遗传转化系统[C]. 许政暟. 西部大开发 科教先行与可持续发展——中国科协2000年学术年会文集. 2000
[4]. 杜氏盐藻（Dunaliella salina）叶绿体转化研究[D]. 潘卫东. 郑州大学. 2003
[5]. 海洋球石藻（Emiliania huxleyi）遗传转化系统的建立及初步功能分析[D]. 蔡艺钦. 集美大学. 2014
[6]. 两种真核微藻类胡萝卜素代谢工程的初步研究[D]. 檀琮萍. 中国科学院研究生院（海洋研究所）. 2006
[7]. 以潮霉素为筛选标记的水稻叶绿体转化体系的建立[D]. 李丁. 中南大学. 2013
[8]. 杜氏盐藻（Dunaliella salina）硝酸盐还原酶基因的克隆、表达及功能鉴定[D]. 谢华. 郑州大学. 2004
[9]. 杜氏盐藻PKC基因的克隆及表达分析[D]. 武天祥. 大连海洋大学. 2016
[10]. 杜氏盐藻电转化体系的建立与外源VgDGAT1a基因的遗传转化[D]. 郝敬云. 山西农业大学. 2016
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