刘惠卿[1]2003年在《一氧化氮在脑缺血耐受诱导中的作用》文中提出脑缺血预处理（cerebral ischemic preconditioning，CIP）诱导的脑缺血耐受（brain ischemic tolerance，BIT）的产生涉及神经介质、受体及基因的表达等一系列过程。在BIT的诱导过程中，细胞在信号启动与转导，基因复制与转录，蛋白合成与修饰等环节发生相应的变化。在信号的启动环节，腺苷机制受到众多学者的重视。我室新近研究表明，BIT诱导过程中，腺苷受体的数量及亲和力均增加，进一步丰富了BIT诱导的腺苷机制的研究。但腺苷受体激动剂作为预处理对神经元所产生的保护作用较CIP所诱导的保护作用弱，说明还有其它机制参与这一过程。近年来，一氧化氮（NO）在缺血缺氧耐受诱导中的作用引起了人们的兴趣。离体研究表明，NO在神经元缺血缺氧预处理保护机制中发挥重要作用。如在离体大鼠海马脑片的研究发现，缺氧预处理可显着减少其后严重缺氧所引起的诱发电位波幅的下降，而一氧化氮合酶（NOS）阻断剂7-硝基吲哚（7-NI）可阻断CIP的这种作用，提示原生型NOS（cNOS）产生的NO参与了缺氧预处理对神经元的保护作用。近来有人应用培养神经细胞氧-葡萄糖剥夺（OGD）耐受模型，系统地研究了NO在神经元OGD耐受诱导中的作用，发现给与NOS抑制剂可阻断OGD耐受的诱导，给NO供体可替代OGD诱导耐受，表明NO的产生既是神经元OGD耐受形成的必要条件，又是充分条件。这些研究结果为研究整体状态下NO在BIT诱导中的作用提供了线索。 在新生鼠缺氧预处理模型中，应用非特异性NOS抑制剂L-NNA完全阻断了缺氧预处理对神经元的保护作用，而对神经元型NOS（nNOS）及诱生型NOS（iNOS）阻断剂7-NI和氨基胍则无效，提示<WP=5>由内皮型NOS（eNOS）产生的NO介导了保护作用。有学者对单纯全脑缺血3 min和6 min 以及6 min缺血前1天给予3 min CIP叁组大鼠海马CA1区锥体细胞NADPH-黄递酶活性的表达情况进行比较，发现叁种情况下NADPH-黄递酶表达的变化基本一致，即在损伤和未损伤的大鼠海马组织中均可见NADPH-黄递酶活性表达的增高，并且增高的时相也一致，说明NO的存在不一定与损伤相关联，但NO的升高是否参与整体状态下BIT的诱导，尚需进一步确定。本研究利用大鼠全脑BIT模型，观察BIT诱导过程中，NOS活性、NO生成以及NOS抑制剂L-NAME对BIT诱导的影响，在整体水平探讨NO在BIT诱导中的作用，并对NO参与BIT诱导的信号转导机制做了初步探讨。1. 全脑缺血耐受模型中缺血时间及性别对CIP保护效应的影响本实验通过观察CIP持续时间、CIP与后续损伤性缺血间隔时间、损伤性缺血持续时间及性别对CIP保护效应的影响，选择能使CIP发挥最大保护效应的时间参数建立理想的BIT模型。采用四血管闭塞法（4-vessel occlusion，4VO），制作大鼠全脑缺血耐受模型。永久凝闭椎动脉的Wistar大鼠108只，按动物性别分为两组进行实验。 1. 雄性大鼠组，分为4组：①Sham组（n=6）；只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流；②缺血3 min组（n=6）：挟闭双颈总动脉3 min；③损伤性缺血组（n=18）：根据阻断血流时间的不同，进一步分为6 min、10 min和15 min组（每组n=6），分别挟闭双颈总动脉6 min、10 min和15 min；④CIP＋损伤性缺血组（n=24）：根据CIP与损伤性缺血时间间隔以及损伤性缺血时间的不同，分为4个亚组，每组n=6，分别为3min-3d-6min（挟闭双颈总动脉3 min作为CIP，再灌注3 d后再挟闭6 min，下同）、3min-3d-10min、3min-3d-15min和3min-1d-10min组。<WP=6>2. 雌性大鼠组，分为5组：①Sham组（n=6）；只暴露双侧颈总动脉，不阻断血流；②缺血2.5 min组（n=6）：挟闭双颈总动脉2.5 min；③缺血3 min组（n=6）：挟闭双颈总动脉3 min；④（n=12）：根据阻断血流时间的不同进一步分为6 min、10 min组（每组n=6），分别挟闭双颈总动脉6 min、10 min；⑤CIP＋损伤性缺血组（n=24）：根据预缺血及损伤性缺血时间的不同，进一步分为4组（每组n=6），分别为2.5min-3d-6min（挟闭双颈总动脉2.5 min作为CIP，再灌注3 d后再挟闭6 min，下同）、3min-3d-6min、2.5min-3d-10min和3min-3d-10min组。椎动脉凝闭术后2天，在乙醚麻醉下分离双侧颈总动脉，待动物清醒后进行挟闭，阻断血流。挟闭双侧颈总动脉期间，可观察到大鼠瞳孔散大，脑电波频率变慢，波幅逐渐缩小甚至呈等电位线，翻正反射消失，证明产生脑缺血。所有大鼠在术后或末次缺血再灌后饲养7天，断头取脑，硫堇染色，在光学显微镜下观察海马组织形态并对其组织学改变进行分级（0级：无神经元死亡；1级：散在的神经元死亡；2级：成片的神经元死亡；3级：几乎全部的神经元死亡），取双侧平均等级作为统计值。高倍镜下计数海马CA1区每1mm区段内细胞膜完整、胞核饱满、核仁清晰的锥体细胞数目，每张切片双侧海马各计数7个区段取平均数为神经元密度（neuronal density, ND）。计算以下参数对CIP的保护效应作定量分析：①保护数（protection number，PN）：CIP+损伤性缺血组与损伤性缺血组的ND值之差；②保护指数（protection index，PI）：保护数与sham组ND值之比；③增长指数（growth index，GI）：保护数与损伤性缺血组ND值之比。结果显示，雄性大鼠中， Sham组?
刘珂舟[2]2009年在《脑缺血及再灌注过程中大鼠海马区一氧化氮动态变化的在体研究》文中提出缺血性脑损伤是一个复杂的病理生理过程，其主要病理变化是缺血性神经元损伤。以往对缺血性脑损伤的研究认为，脑血流中断后，脑细胞能量供应不足而导致脑细胞死亡。近年来研究发现脑血流中断和再灌注使脑组织细胞产生损伤级联反应，至少涉及4个不同的机制：能量障碍和兴奋性氨基酸毒性、梗死周围去极化、炎症及程序性细胞死亡。大量动物实验及临床研究表明，脑缺血及再灌注期间发生着复杂的病理生理变化。一方面，脑缺血再灌注既可以挽救濒临梗死的细胞，另一方面加重细胞损伤，导致细胞死亡。而在这个复杂的过程中，一氧化氮(Nitric Oxide，NO)起着十分重要的作用。其作为一种新型信使分子，同时具有神经介质和神经毒性作用。尤其在脑部的组织中的双重作用更是近年来研究的重点。一方面它能够增加皮层供血量，缩小梗死面积；另一方面它能够与缺血产生的氧自由基协同造成神经细胞损伤。本论文通过在体检测脑缺血及再灌注过程中大鼠脑海马内NO的释放情况，真实反应了该过程中NO的释放变化情况，为进一步研究NO的神经介质作用和神经毒性作用奠定基础。并以培养的大鼠海马神经细胞的缺氧缺糖(OGD)为离体脑缺血／再灌注模型(即对培养的海马神经细胞进行缺氧缺糖复氧复糖)，利用荧光标记和激光共聚焦实时扫描技术，对海马神经细胞内释放的NO变化进行了检测，从而完成了对脑缺血／再灌注过程中NO的动态变化过程的整体与细胞两个层面的研究。最新的关于脑缺血及再灌注损伤的治疗方法的研究是通过对再灌注过程的干预(post-conditioning)来减少脑部梗死面积，但该过程中NO的变化情况、具体的作用机理及究竟哪种干预方法更有效均未见报道。通过使用本论文中的在体检测NO方法，实时、连续地记录了该干预过程中NO的变化情况，从而阐明了NO确实参与了缺血后处理，提示NO通路有可能是该方法对脑缺血／再灌注损伤保护作用的一条途径。同时，利用TTC染色与流式细胞技术对比了不同后处理方法对于大脑的保护作用，为进一步优化该干预方法提供了一定的理论基础。所得结果如下：1．海马内NO释放减少，对血管的舒张作用降低，继而大鼠血压上升。这与理论“内皮依赖性舒张因子(endothelium-derived relaxing factor，EDRF)和一氧化氮同质”相符，进而验证了该在体检测NO技术的真实性和稳定性。同时得出结论，静脉注射一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)抑制剂L-NAME 20μL-30μL后，NO的释放量减少了4．5 nM-6nM。2．大鼠脑缺血／再灌注初期中，海马内NO的变化经历了四个阶段：在脑缺血的最初10min，由于大脑供血的迅速减少，NO的释放量也迅速下降，并达到最低点；之后稳定维持在一个低水平；在再灌注初期，由于血液的恢复，NO释放量迅速升高，并在10．15min内达到最高点；之后维持在一个稳定的高水平。同时通过拟合定标曲线，计算得出：在脑缺血过程中海马内NO释放的减少浓度为0．806±0．221μM，在再灌注初期NO释放量增加浓度为0．768±0．029μM。3．在不同的时间点分别静脉注射内皮型NOS (eNOS)／神经元型NOS(nNOS)和诱生型NOS(iNOS)的抑制剂，结果表明在再灌注初期eNOS／nNOS起主要作用，与iNOS没有关系，在这个过程中海马内释放的NO对受损脑组织起到了保护和损伤双重作用。4．在离体培养的大鼠海马神经元细胞实验上，通过共聚焦显微镜得到了NO在OGD／复氧复糖模型中的变化过程。该过程实验结果与在体大鼠实验结果相比，NO释放的变化过程显得较为简单。在OGD／复氧复糖过程中，NO的表达均有明显上升，并在再灌注10-12 min后达到稳定的平台期。5．利用在体检测NO技术，实验发现缺血后处理(post-conditioning)能够使大鼠海马内NO的释放缓慢增加，从而进一步增加脑内血流量。我们认为，脑缺血后处理所引起的NO缓慢而大量的释放能够抑制NO的毒性作用而进一步加大NO对于脑血流的积极增加作用，从而减少脑缺血／再灌注损伤。不同后处理方法对于脑内NO释放的影响不同。6．对比6组不同的后处理方法(即改变缺血和再灌注的时间长短及交替的次数)，实验发现缺血后处理都可以一定程度上减少脑部梗死面积，提高大鼠海马内神经细胞的存活率。但其中3次30s／30s的再灌注／缺血循环能够最有效的减少大脑损伤。我们认为该方法可能能够最大程度的激发脑内NO的缓慢大量释放，说明NO很有可能是post-conditioning改善脑损伤的一条作用途径。本论文采用实时、连续、在体检测NO结合荧光标记与激光共聚焦实时扫描技术的方法，分别从整体与细胞两个层次上对脑缺血／再灌注过程中大鼠海马内NO浓度进行了检测，全面的阐述了该过程中NO的变化情况以及对脑组织的双重作用。另一方面，利用NO的在体检测技术，首次检测了在缺血后处理过程中NO的变化情况，揭示了NO可能是该干预方法作用的一个途径，并通过对比多种缺血后处理方法对于缺血／再灌注损伤的保护作用，进一步对该干预方法进行优化。NO在脑缺血／再灌注疾病中发挥着重要的作用，清楚了解NO在脑缺血／再灌注过程中的变化及其作用机制对于防治中风药物的开发与筛选以及临床上治疗中风引起的神经损伤都具有重要的指导意义。
丁德光[3]2006年在《电针对脑缺血再灌注大鼠脑损伤保护作用及机制的研究》文中研究说明目的： 中风是常见病、多发病，病死率、致残率极高，而缺血性中风约占75％，且有逐年增加的趋势。因此预防和治疗缺血性中风，降低它的发病率和致残率，已成为当前迫切需要解决的问题。在既往的临床和实验研究中发现电针能明显改善脑梗塞的临床症状、体征及各种生化指标。因此本课题拟通过电针脑缺血再灌注大鼠水沟、内关(双)观察电针对模型大鼠缺血区皮质TNF-αmRNA、NF-κB、P53的表达和皮质TNF-α、NO含量及皮质神经元凋亡的影响来研究电针对缺血性脑损伤的保护作用机制，从而进一步研究针灸治疗缺血性脑血管病的机理，为临床针灸治疗缺血性脑血管病提供确切的理论依据。 方法： 健康成年SD大鼠，随机分为空白对照组、假手术组(分12h组、24h组、72h组)、模型组(分12h组、24h组、72h组)、针刺组(分12h组、24h组、72h组)。模型采用大脑中动脉线栓法(MACO)，缺血半小时再灌注。电针实验大鼠的水沟、内关。运用腿染色法观察实验大鼠皮质形态学变化，运用TUNEL法观察各组大鼠皮质神经细胞凋亡情况，运用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)法观察各组大鼠缺血区皮质TNF-αmRNA表达变化，分别运用放射免疫法和生化法观察各组大鼠缺血区皮质TNF-α、NO含量变化，运用免疫组化法观察各组大鼠缺血区皮质NF-κB、P53蛋白表达的变化。 结果： (1) 正常组和假手术组大鼠皮质组织切片中可见少量凋亡细胞，二者比较无统计学意义(P＞0.05)；模型组12、24、72小时组缺血侧大鼠皮质中均可见大量凋亡细胞，与正常组、假手术组相比有统计学意义(P＜0.01)；电针12、24、72小时组缺血侧大鼠皮质中均可见多量凋亡细胞，与模型组相比减少，有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)；同时电针可明显改善缺血大鼠缺血侧皮层形态学损伤。(2) 正常组与假手术组缺血侧大鼠皮质TNF-αmRNA的表达和TNF-α含量较低，二者相比无统计学意义(P＞0.05)；模型组12h、24h、72h缺血侧皮质TNF-αmRNA的表达和TNF-α含量均显著升高，与假手术组相比有统计学意义(P＜0.01)；电针12h组、24h组及72h组缺血皮质中TNF-αmRNA表达和TNF-α含量与模型组相比均降低，有统计学意义(P＜0.01)。(3) 正常组、假手术组大鼠缺血侧皮质组织切片中可见极少量NF-κB核反应阳性细胞，二者相比无统计学意义(P＞0.05)；模型12、24、72小时组缺血侧大鼠皮质中可见多量NF-κB核反应阳性细胞，与正常组、假手术组相比有统计学意义(P＜0.01)，电针12、24、72小时组大鼠缺血侧皮质中均可见多量NF-κB核反应阳性细胞，与模型组各时相相比表达降低，有统计学意义(P＜0.01)。(4) 正常组、假手术组缺血侧大鼠皮质组织切片中可见极少量P53阳性细胞，二者相比无统计学意义(P＞0.05)；模型12、24、72小时组缺血侧大鼠皮质中可见大量P53阳性细胞，与正常组、假手术组相比有非常显着差异(P＜0.01)；电针12、24、72小时组缺血侧大鼠皮质中均可见较多P53阳性细胞，与模型组各时相相比减少，有统计学意义(P＜0.01或P＜0.05)。(5) 正常组与假手术组缺血侧大鼠皮质NO含量较低，二者相比无统计学意义(P＞0.05)；模型组缺血侧大鼠皮质NO含量在缺血再灌注
参考文献：
[1]. 一氧化氮在脑缺血耐受诱导中的作用[D]. 刘惠卿. 河北医科大学. 2003
[2]. 脑缺血及再灌注过程中大鼠海马区一氧化氮动态变化的在体研究[D]. 刘珂舟. 浙江大学. 2009
[3]. 电针对脑缺血再灌注大鼠脑损伤保护作用及机制的研究[D]. 丁德光. 湖北中医学院. 2006
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