彭佳蓓[1]2008年在《香菇多糖联合丙肝核酸疫苗诱导抗原特异性免疫反应的研究》文中研究说明第一部分丙型肝炎病毒非结构蛋白3(NS3)DNA疫苗的制备与鉴定目的:大量制备丙型肝炎病毒非结构蛋白3(NS3)DNA疫苗,并进行定量及定性分析,为进一步研究其免疫活性奠定基础。方法:将pcDNA3.1-HCV/NS3转化感受态大肠杆菌HB101,克隆后挑取单个菌落扩增,用超纯质粒大量快速提取试剂盒提取pcDNA3.1-HCV/NS3,提取物分别进行核酸定量检测和琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果:本试验成功的转化pcDNA3.1-HCV/NS于大肠杆菌中,铺平皿温育16h后有较多的单菌落生长。扩增提取产物经核酸定量检测,浓度在1.5μg/μl-2μg/μl范围内,纯度均接近1.8,因免疫小鼠所需要的DNA浓度为1μg/μl,所以提取的DNA在浓度和纯度上符合要求,另将扩增提取产物双酶切后经琼脂糖凝胶电泳证实扩增的质粒DNA包含目的基因NS3片段,分子量为1.8Kb。结论:本实验成功制备了用于免疫动物的HCV/ NS3 DNA疫苗,为进一步研究其免疫活性奠定了基础。第二部分香菇多糖作为免疫佐剂对丙肝病毒非结构蛋白3(NS3)体液免疫效果的影响目的:探讨中药香菇多糖(LNT)作为免疫佐剂对HCV/ NS3核酸疫苗体液免疫效果的影响。方法:HCV-NS3核酸疫苗肌注免疫BALB/c小鼠(100μg/只),10天后加强免疫一次,同时灌胃给予高(1mg/ml)、中(0.5mg/ml)、低(0.1mg/ml)三种剂量的香菇多糖,于末次免疫后第1、3、5周分别采集小鼠尾血,分离收集血清冻存。用HCV/NS3抗原多肽包被酶标板,采用间接酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测小鼠血清特异性IgG抗体水平。并采用ELISA方法检测血清中细胞因子IL-4和IFN-γ分泌水平。结果:二次免疫后1周各组免疫小鼠血清中均产生了不同水平的抗体,以中剂量LNT为佐剂的免疫组在各时间点产生的特异性IgG水平最为显著,而且随着时间的增加,中剂量LNT为佐剂的免疫组和单独免疫核酸疫苗组的特异性IgG水平呈现出上升的趋势,而以高剂量和低剂量的LNT为佐剂免疫组的抗体水平随时间变化不大;中剂量香菇多糖为佐剂免疫组产生的特异性抗体水平较单独免疫核酸疫苗组在各时间点均有显著性提高(P<0.05)。细胞因子分析显示以不同剂量香菇多糖作为佐剂的免疫组较之单独免疫核酸疫苗组IFN-γ的分泌增加,其中中剂量的香菇多糖联合HCV/NS3核酸疫苗组产生IFN-γ的水平较之单独使用核酸疫苗组,差异非常显著(P<0.01)。而IL-4水平各组间无明显差异(P>0.05)。结论:通过二次肌注免疫HCV/NS3核酸疫苗,小鼠体内产生了抗NS3抗原的特异性IgG抗体,而且随着时间的延长,特异性抗体水平也随之升高。中剂量的香菇多糖为佐剂能够增强HCV/NS3核酸疫苗诱导的特异性体液免疫反应。香菇多糖能够刺激Th1类细胞因子IFN-γ分泌,而对Th2类细胞因子IL-4的分泌未明显影响。第三部分香菇多糖作为佐剂对丙肝病毒非结构蛋白3(NS3)细胞免疫效果的影响目的:探讨中药香菇多糖(LNT)联合丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS3核酸疫苗诱导NS3抗原特异性细胞免疫作用。方法:将不同剂量的香菇多糖与HCV/NS3质粒(100μg/只),采用初次加强免疫法联合免疫BALB/c小鼠。第二次免疫10天后取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,与NS3多肽抗原共同孵育作为效应细胞。另培养NS3抗原致敏的P815细胞作为靶细胞。采用MTT法分别检测NS3抗原特异性T细胞增殖反应和细胞毒T细胞特异性杀伤反应(CTL)。结果:研究发现中剂量和低剂量香菇多糖与NS3质粒联用明显增强NS3抗原特异性T细胞增殖反应(P<0.05)。高剂量及中剂量香菇多糖与HCV/NS3核酸疫苗联合应用,在效靶细胞比为50:1和25:1时,可诱导更强NS3抗原特异性CTL反应,与单独免疫NS3质粒相比有显著性差异(P<0.05)。而低剂量的香菇多糖佐剂免疫组的CTL杀伤率与单独使用核酸疫苗组相比没有明显差异。总的趋势是随着效靶细胞比值(E/T)的增大,效应细胞对靶细胞的杀伤力也增大。结论:采用初次加强免疫法将中剂量香菇多糖(0.5mg/ml)与HCV/ NS3核酸疫苗联合免疫BALB/c小鼠,可激发明显增强的抗原特异性T细胞增殖和CTL反应,并结合试验第二部分的细胞因子分析结果,提示香菇多糖作为丙肝病毒NS3核酸疫苗的免疫佐剂,可加强抗原特异性免疫应答效应。
陈佳玉[2]2008年在《丙型肝炎治疗的研究进展》文中研究指明丙型肝炎严重威胁着人类的健康,目前寻找一种有效的疗法至关重要。撰文对丙型肝炎的药物治疗、RNA干扰、病毒抗原编码基因的转基因表达、反义核酸技术及表位疫苗等项治疗方案予以综述,提出了包含有多个保守丙型肝炎病毒(HCV)抗原表位的多价融合抗原基因的DNA疫苗将成为今后丙型肝炎治疗的研究方向。该疫苗可以在不同个体中激起广泛而强烈的对不同HCV基因型有交叉反应性的T细胞免疫应答,并有望用于丙型肝炎人群的治疗。
杨江华[3]2006年在《慢性丙型肝炎患者CD4～+CD25～+调节性T细胞的检测及免疫学意义》文中提出丙型肝炎是一种世界范围内的疾病，全世界大约有2亿HCV感染者。目前发达国家的人群HCV感染率为1.9％，而有些国家高达22％。丙型肝炎病毒感染的显著临床特点是80％以上的急性患者转变为慢性持续性感染，慢性丙型肝炎又是肝硬化和原发性肝细胞癌的重要病因。目前，HCV感染慢性化的机理仍然不清楚。已有的研究表明，HCV病毒学特点和机体的免疫反应都可能与丙型肝炎的慢性化有关。统计表明，HCV基因型1b型较非1b型更易导致慢性化，其合并肝硬化和肝细胞癌的患者也更多。混合基因型感染者比单一基因型感染者，慢性化比例要明显增加。病毒变异，特别是高变区(HVR1)的基因突变也与HCV感染的慢性化有明显的联系。HCV的E区是免疫攻击的主要靶抗原基因区。由于该区变异较大，极易导致免疫逃避，造成宿主不能有效清除HCV。由于HCV基因型2型和3型等慢性化率低，对干扰素治疗有较好的治疗反应，因而多数学者认为HCV感染的慢性化是由于机体在复杂的免疫调控过程中，因病毒方面的某种影响因素影响了机体的免疫调控过程，使感染向慢性化发展。 研究表明，在HCV感染的急性阶段，如持续出现IgG2免疫球蛋白亚类，临床可表现为自限性经过；如出现IgG1为主亚类，不出现IgG2，则表现为慢性持续性感染。机体抗HCV感染免疫应答主要由细胞免疫所介导，因此宿主的细胞免疫应答能力强弱对控制HCV感染的慢性化具有重要的作用。CTLs能够直接识别那些位于被感染细胞表面与MHC-Ⅰ
贾战生, 马力, 韦三华, 姚志强[4]2011年在《丙型肝炎疫苗研究的新理念、挑战与策略》文中提出丙型肝炎病毒(HCV)感染是引起慢性肝病的主要原因之一,严重危害人类健康,目前抗病毒治疗的标准方案为聚乙二醇干扰素α(PEG-IFN-α)联合利巴韦林,其有效率仅为50%~70%,且疫苗研究进展缓慢,已成为严峻的公共卫生问题。近10多年来,对HCV感染发病机制、保护性免疫应答和病毒持续感染机制的认识取得了很大进展,中和抗体以及CD4+和CD8+T细胞在内的强烈的T细胞免疫应答已被证明与HCV的清除相关,这将是研制丙型肝炎疫苗的希望所在。当前HCV疫苗的研究主要集中在多肽疫苗、核酸疫苗、病毒载体疫苗、重组多表位疫苗、以抗原递呈细胞为载体的树突状细胞(DC)疫苗等,已有多种疫苗正在研制并进行进入临床试验前的测试。我们结合多年来对HCV的研究基础,通过与国内外同行交流,提出变"单纯预防"为"防治结合,以诱导持续免疫应答和维持病毒抑制状态为基本目标"的HCV疫苗研究新理念,发展以诱导细胞免疫为主的预防和治疗性疫苗,尤其是既能在体内有效激发HCV特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)反应,又能维持CD4+记忆T细胞功能的治疗性细胞疫苗。本文综述关于HCV保护性免疫应答及持续感染的机制,HCV疫苗研究新理念,目前面临的挑战以及研究策略。
陈佳玉[5]2006年在《丙型肝炎治疗性DNA疫苗的实验研究》文中进行了进一步梳理为了进行丙型肝炎(HCV)治疗性DNA疫苗的研制,本实验成功建造了HCV感染的细胞模型。以红色荧光蛋白(RFP)和绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,将其分别插入乙肝核心抗原基因(HBc)的e1 loop和e2 loop处,构建质粒pcDNA 3.1-HBc-GFP和pcDNA 3.1-HBc-GFP并在Hela细胞内表达。构建了含有HCV T细胞表位的真核表达质粒pcDNA3.1-HBc-T1T2,通过RFP和GFP表达情况的观察、质粒pcDNA 3.1-HBc-T1T2表达产物HBcAg-T1T2电镜下成颗粒性观察及融合蛋白HBcAg-T1T2三维构象展示,证实了HBc作为疫苗免疫载体的可行性。真核表达质粒pcDNA 3.1-HBc-T1T2肌肉注射免疫小鼠,适时进行了抑瘤实验、CTL细胞毒活性、HBcAb、脾淋巴细胞胞内细胞因子IL-4和IL-γ、血清中细胞因子IL-5、IL-10和IL-12、脾淋巴细胞刺激指数(SI)、血液和脾淋巴细胞亚群、IgG2α/IgG1及脾淋巴细胞培养上清中IL-2水平的检测,以对真核表达质粒pcDNA 3.1-HBc-T1T2的免疫原性进行分析。本研究结果揭示了,真核表达质粒pcDNA3.1-HBc-T1T2能够诱导出特异性的细胞免疫应答,可作为HCV治疗性DNA疫苗的候选,本实验为HCV的治疗奠定了基础。
张鹏, 周红超[6]1997年在《丙型肝炎疫苗的研究进展》文中研究说明丙型肝炎感染极易转为慢性化，可导致肝硬化或肝癌，严重危害人类的健康。丙型肝炎疫苗的研制迫在眉睫。而ＨＣＶ基因序列的高度变异性使丙型肝炎疫苗的研制面临重重困难，本文现就目前丙型肝炎疫苗研究的三个方面，即体液免疫中和抗体疫苗的研究、细胞免疫ＣＴＬ疫苗的研究以及基因疫苗的研究进行了探讨，试论述丙型肝炎疫苗研制的可能。
黄莺[7]2001年在《丙型肝炎核酸疫苗的构建及其诱导小鼠免疫效果的评价》文中指出目前有关丙型肝炎疫苗的研究主要集中在两方面，一是从基础研究着手，研究HCV多肽的体液免疫和细胞免疫位点，寻找高突变区以外的具有保护作用的保守序列；另一方面是采用小动物模型，进行整体HCV免疫保护实验。近年来，这两方面的研究都取得了显著进展，使人们逐渐增加了对成功研制HCV疫苗的信心。 核酸疫苗是将编码目的抗原的基因插入带有必要调控元件的真核表达载体中，免疫时只需把构建好的重组质粒接种于机体，机体细胞就会摄取质粒并表达目的抗原，诱导动物免疫系统对编码序列所表达的蛋白质发生免疫应答。免疫效果较好，在流感病毒、HIV及HBV等许多病毒感染性疾病的预防研究中已取得了肯定的结果。本研究是将核酸疫苗应用到丙型肝炎的研究中，选用一个真核高效表达载体，以EF-1α作为启动子，构建了一种能在体外细胞中稳定表达HCV C蛋白的核酸疫苗，将其免疫小鼠，从体液免疫和细胞免疫的角度观察能否诱导产生较高滴度的抗体以及针对HCV特异性的CTL反应，从而验证研制HCV核酸疫苗的可能性。方法：1．核酸疫菌的构建：PCR法从PQE HCVc191质粒扩增出HCV核心区的cDNA，经双酶切法将其定向插入真核表达载体pEF的SaL I和BamH第四罕医大学硕士论文 中文摘要I位点中，构建可在真核细胞中表达HCV C蛋白的核酸疫苗pEF－HCV，用PCR法和酶切法鉴定所构建的重组质粒。2．转染：用脂质体介导法将 pEF卫CV C重组质粒体外转染 BALB／c小鼠 SPZ／0细胞，用斑点杂交和免疫组化法检测 SPZ／0细胞内 HCV C蛋白的瞬时表达情况和稳定表达情况。3．免疫：根据不同的免疫次数、免疫处理方式将所构建的核酸疫苗接种于BALB七小鼠后腿内侧肌肉中，ELISA法检测免疫小鼠血清抗．HCV C水平。4．体外CTL活性检测：于末次免疫后两周，取出免疫小鼠脾脏，研磨制备效应细胞，用稳定转染 pEF－HCV C重组质粒的 SPZ川细胞作靶细胞，乳酸脱氢酶实验鉴定CTL活力。5．体内 CTL活性检测：在末次兔疫后四周，取经pEF－HCV C重组质粒稳定转染的SP2／0细胞，分多点双胁部皮下注射经核酸疫苗4次兔疫的小鼠，建立荷瘤小鼠模型，观察肿瘤出现时间、肿瘤大小、肿瘤数目、小鼠死亡时间各项指标，并设立对照组进行观察比较。结果：1．经酶切鉴定和 PCR鉴定，表明核酸疫苗的构建正确；将所构建的核酸疫苗转入SP2／0细胞后，可在转染细胞中检测到HCV C蛋白的稳定表达。二．以不同的免疫方式、处理方式免疫BALB／c小鼠，观察到HCV核酸疫苗可以诱导产生针对HCV的体液兔疫应答；早期滴度较低，随后抗体水平呈现上升的趋势；加强免疫可以提高血清中抗体滴度，处理实验组可以刺激产主更高的抗体滴度。 3第四军医大学项士论文 中文摘要3．用定量乳酸脱氢酶（LDH）法测定CTL活力，最适效靶比为150：1，该效靶比下各组 CTL反应平均值：对照组为 16．3％士 8．7％，实验组为 72．7％土 6．sl％，经 t检验两组 CTL活性有显著差别。4．荷瘤小鼠产生的肿瘤，在对照组较实验组出现早，前者肿瘤出现时间为 15士 4天，后者为 23士 6天；对照组肿瘤生长速度快，死亡时肿瘤一般＞3＊m：对照组小鼠存活时间较实验组短，两组的存活时间分别为4O土3天和的土6天，各项观察指标经亡检验均有显著差异。讨论： 我们的研究结果说明构建的丙型肝炎核酸疫苗免疫接种BALB儿小鼠后，能诱导产生针对该表达抗原的体液免疫应答和细胞免疫应答，这种免疫应答随着免疫次数的增加而加强。在观察稳定转染重组质粒的小鼠SP2／0细胞对免疫小鼠成瘤性研究中，发现DNA疫苗可以降低成瘤率，抑制肿瘤生长，延长小鼠存活期和提高小鼠存活率。另外，体外杀伤实验证实，DNA疫苗可以明显提高小鼠脾细胞的HCV特异性CTL杀伤率，具有很强的细胞兔疫原性，可以诱导宿主产生明显的CTLS反应。这些结果证实了DNA疫苗的免疫原性及其对体内病毒感染的预防和治疗作用，为HCV的核酸疫苗研究提供一些基础资料。
洪忻[8]2006年在《江苏汉族人群HLA-DQA1、DQB1基因多态性及与慢性丙型肝炎相关性的研究》文中提出由丙型肝炎病毒(HCV)感染所引起的丙型肝炎呈全球分布。据WHO估计，目前全世界约有1.8亿HCV感染者，且呈增长趋势。HCV感染的显著特点是极易慢性化，约有15％～25％的HCV感染者可被宿主的的免疫反应自限清除体内的病毒；而绝大多数患者呈慢性持续感染，并最终进展为肝硬化和肝细胞癌。HCV被机体清除的机制目前尚不明了，涉及到HCV的生物学特点、宿主免疫、遗传背景和环境因素之间的作用，相互关系十分复杂。本课题以江苏省宜兴市为研究现场，开展了以人群为基础的分子流行病学研究。 第一部分：应用PCR-SBT方法研究江苏汉族 人群HLA-DQA1和DQB1基因多态性分布 人类白细胞抗原(HLA)是迄今所知最复杂的免疫遗传多态性系统，在器官移植，亲子鉴定，抗原的加工、递呈，免疫应答调控等方面发挥重要作用。不同种族、群体、地域HLA等位基因的分布存在差异，国内外已报道在不同人群中其分布的差异与某些疾病的遗传易感性或抵抗性密切相关。本研究采用聚合酶链反应-测序分型法(PCR-SBT)对DQA1和DQB1基因多态性进行探讨。主要结果如下： 1．HLA-DQA1、DQB1基因座Hardy-Weinberg平衡检验HLA-DQA1、DQB1基因座杂合基因型期望值和观察值的吻合度检验，P值分别为0.668和0.071，符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，表明该人群两个基因座中的基因型频率基本处于平衡状态，具有群体代表性。
郭泰林[9]2003年在《HCV E2基因在大肠杆菌及动物细胞中的表达和E2蛋白诱导的CTL应答研究》文中研究指明HCV是引起丙型肝炎的病原体。70％以上患者可转变成慢性肝炎，其中约25％的慢性丙肝病人可转变成肝硬化或肝癌。目前还没有理想的治疗药物，研究和发展有效的疫苗用以预防HCV感染是一个迫切需要解决的问题。HCV的E2包膜糖蛋白一直是国际上HCV疫苗研究的重点目标。我们以前的研究已证实E2 DNA疫苗能够诱导动物的体液免疫。能否有效地诱导产生中和性保护抗体和诱导细胞免疫，产生特异性CTL反应以清除体内病毒，是评价疫苗的重要指标。本论文研究HCV E2工程蛋白诱导的CTL反应。 为了获得E2工程蛋白，我们应用PCR技术从HCV基因组cDNA克隆质粒中扩增获得不同长度的E2基因序列，构建了两个重组真核表达质粒：pCE2-1(422-661)，pCE2-2(383-661)和两个重组原核表达质粒：pQE2(417-661)，pET-HIS-E2(417-750)，分别在猴肾细胞COS-7和工程菌株JM109、BL21中表达，我们发现，以上的所有质粒，在对应宿主中，都表达产生了E2蛋白，Western-blot结果充分地证明表达出的E2蛋白能与E2单克隆抗体特异性反应。但表达水平不高，如何提高E2的表达水平有待进一步解决。 JM109 pQ-E2菌株诱导培养5-6小时后，收集细胞用超声波振荡裂解，用Ni-NTA-Superflow亲和层析柱从裂解液中提取和纯化E2蛋白作为抗原。抗原用脂质体包被，采用腹腔、皮下、肌肉注射的方式，在盐酸普鲁卡因及淀粉的辅助作用下，免疫BALB/c鼠后取鼠脾脏制备淋巴细胞，用IL一2、Con一A、PHA及肤段定向刺激扩增后做为效应细胞，与经过重组真核表达质粒pCEZ转染的PS巧细胞(靶细胞)发生作用，利用LDH释放试验检测作用效果。在效应细胞与靶细胞的细胞数之比为200:1的情况下，三种免疫方式免疫小鼠的脾细胞对靶细胞的杀伤率都超过30%。这些结果表明工程菌株表达的HCV EZ蛋白可以诱发免疫实验动物机体产生特异性CTL应答。由此我们认为EZ蛋白是发展HCV预防工程蛋白疫苗的合适候选者。
邵惠训[10]2011年在《未来的丙型肝炎疫苗》文中提出丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)是丙型肝炎的病原体,是导致输血后肝炎和非甲非乙型肝炎的主要致病因子。HCV感染常导致慢性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。HCV在细胞内和动物体内复制能力很差,没有理想的细胞模型和动物模型。丙型肝炎目前尚无疫苗,还有很多病人在等待治疗。研制预防性和治疗性疫苗,以控制HCV感染有着重要意义。经过几代科技工作者的努力和奉献,丙型肝炎疫苗研究取得了重大进展。用核酸疫苗作首次免疫,用多肽疫苗或树突状细胞疫苗作加强免疫,不但有预防作用,而且有治疗效果。核酸疫苗将为改善人类和动物健康作出巨大贡献。
参考文献：
[1]. 香菇多糖联合丙肝核酸疫苗诱导抗原特异性免疫反应的研究[D]. 彭佳蓓. 华中科技大学. 2008
[2]. 丙型肝炎治疗的研究进展[J]. 陈佳玉. 医学综述. 2008
[3]. 慢性丙型肝炎患者CD4～+CD25～+调节性T细胞的检测及免疫学意义[D]. 杨江华. 南京医科大学. 2006
[4]. 丙型肝炎疫苗研究的新理念、挑战与策略[J]. 贾战生, 马力, 韦三华, 姚志强. 临床肝胆病杂志. 2011
[5]. 丙型肝炎治疗性DNA疫苗的实验研究[D]. 陈佳玉. 吉林大学. 2006
[6]. 丙型肝炎疫苗的研究进展[J]. 张鹏, 周红超. 国外医学.病毒学分册. 1997
[7]. 丙型肝炎核酸疫苗的构建及其诱导小鼠免疫效果的评价[D]. 黄莺. 第四军医大学. 2001
[8]. 江苏汉族人群HLA-DQA1、DQB1基因多态性及与慢性丙型肝炎相关性的研究[D]. 洪忻. 南京医科大学. 2006
[9]. HCV E2基因在大肠杆菌及动物细胞中的表达和E2蛋白诱导的CTL应答研究[D]. 郭泰林. 武汉大学. 2003
[10]. 未来的丙型肝炎疫苗[J]. 邵惠训. 实验动物科学. 2011
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