课题来源黑龙江省卫生计生委科研课题（2016-458）
【摘要】目的：证明miR-let-7a与PKM2的信号通路有密切关系,miR-let-7a拮抗PKM2的表达会产生一定抗非IgA肾炎细胞增殖。方法：1.运用Real-time PCR检测miR-let-7a在非IgA肾炎细胞和正常肾脏组织、细胞中的表达情况；2.免疫组织化学方法、Real-time PCR和Western blot分别检测PKM2在非IgA肾炎细胞和正常肾脏组织、细胞中的表达情况；证实miR-let-7a与PKM2 mRNA、蛋白呈负相关性。结果：我们发现miR-let-7a在非IgA肾炎细胞表达减少, 然而, PKM2在非IgA肾炎细胞细胞表达增加(p < 0.001)。据统计,miR-let-7a、PKM2 mRNA和PKM2蛋白负相关(分别为p = 0.013,p = 0.013)。结论：我们的结果表明,miR-let-7a通过下调PKM2来抑制非IgA肾炎细胞。miR-let-7a / PKM2通路对非IgA肾炎细胞病人可能是一个新的治疗靶点。
【关键词】 miR-let-7a;PKM2; 非IgA肾炎细胞。
根据近年来报道, miRNAs在非IgA系膜增生性肾小球肾炎形成中发挥重要作用。miR-let-7a发挥功能是通过结合调节非IgA系膜增生性肾小球肾炎的靶向基因，调控靶向基因的信号通路，从而影响非IgA系膜增生性肾小球肾炎细胞的生物行为。丙酮酸激酶M2(PKM2)作为肾脏细胞依赖的糖酵解代谢中的关键酶，抑制PKM2的表达可以抑制肾脏细胞的生长和存活。有实验证明miR-let-7a与PKM2的信号通路有密切关系,miR-let-7a拮抗PKM2的表达会产生一定抗非IgA系膜增生性肾小球肾炎效应。
1.材料和方法
1.1道德声明
人类组织样本用于本研究得到病人或其家属的书面知情同意。本研究经伦理委员会的批准 黑龙江省农垦总局总医院。
1.2标本
非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织35例，正常肾脏组织12例，经过石蜡包埋并进行H&E染色的芯片。两位病理科医生进行病理检查明确诊断。
1.3细胞系
本实验所选用的正常肾脏组织是从肾活检中，排查出没有潜在的病理学疾病；样本收集前3个月，没有接受激素治疗。非IgA系膜增生性肾小球肾炎细胞系，购自美国标准培养物细胞库，将细胞常规培养在37℃，5%CO2下含有5%牛胚胎血清的DMEM中。
1.4方法
1.4.1 免疫组化 IHC检测PKM2抗体在非IgA系膜增生性肾小球肾炎及正常组织中的表达情况。
1.4.2细胞转染 本实验小干扰RNA（siRNA）进行转染，分别是miR-let-7a mimics ,miR-let-7a inhibitor和miR-let-7a NC对照组，参照 LipofectamineTM2000说明书。
1.4.3 Real-time RT-PCR 1）RNA的提取，2）cDNA第一链的合成，3）PCR扩增反应 ，4）PCR结果分析：实验所得数据采用2–Ct方法进行分析。
1.4.4 Western blot，1）蛋白的提取及浓度测定，配置蛋白提取液（细胞裂解液。2）配胶。3)电泳。4）孵育一抗
1.4.5统计学方法
本实验采用统计学软件包SPSS17.0，进行统计分析，所有数据结果均以x±s表示，P<0.05 被认为差异有显著意义。
2结果
2.1 miR-let-7a在非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织，SiHa和HeLa细胞系中表达减少
首先，我们使用定量RT-PCR分析研究了35对非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织中miR-let-7a的表达，与正常组织相比，疾病组织中miR-let-7a的表达显着降低。半定量RT-PCR分析显示，与正常组织相比，疾病中miR-let-7a的表达确实降低。与组织相一致，SiHa和HeLa细胞系与人正常细胞比较, miR-let-7a也显示明显的表达下调 (P <0.001）（图-1）。我们的研究结果表明miR-let-7a在非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织，SiHa和HeLa细胞系中表达减少。
图-1、miR-let-7a在人非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织和细胞系中的表达。（A）通过RT-PCR分析检测代表性的三个样品和细胞系中的相对miR-let-7a信使RNA表达水平，包括SiHa和HeLa。每个条代表三次独立实验的平均值。（B）35例非IgA系膜增生性肾小球肾炎和配对正常组织中miR-let-7a表达的实时PCR分析。除非另有说明，所有数据均表示为至少三次重复实验的平均值±SEM。*表示通过t检验， P <0.001的显着性。
2.2 PKM2在非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织，SiHa和HeLa细胞系中表达升高
PKM2表达与miR-let-7a相关，因此我们利用RT-PCR，qRT-PCR和western blot方法探讨和分析了非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织和细胞系中PKM2的表达。与正常组织相比，我们证实PKM2 mRNA表达明显升高。与组织相一致，SiHa细胞和HeLa细胞系也显示，mRNA PKM2的表达，与人正常细胞比较显著升高（P <0.001）（图-2）。Western印迹分析进一步鉴定了PKM2蛋白的表达在非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织，SiHa细胞和HeLa细胞系显着升高，（P <0.001）（图-3）。
图-2.PKM2 mRNA在非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织和细胞系中，与正常组织和细胞相比，表达明显升高。定量分析定义为PKM2 mRNA与GAPDH的相对密度。GAPDH被用作内部控制。显示的结果是重复独立实验的平均值±SEM。
图-3.PKM2蛋白在非IgA系膜增生性肾小球肾炎组织、SiH和HeLa细胞系的表达，与人正常组织和细胞比较显著升高。使用western blot检测35例疾病组织，配对正常组织和细胞系（包括SiHa和HeLa）中PKM2蛋白的表达。平均PKM2表达标准化为β-肌动蛋白表达。除非另有说明，所有数据均表示为至少三次重复实验的平均值±SEM。*表示生P <0.001的显着性t检验。
结果：
我们发现miR-let-7a在非IgA肾炎细胞表达减少, 然而, PKM2在非IgA肾炎细胞细胞表达增加(p < 0.001)。据统计,miR-let-7a、PKM2 mRNA和PKM2蛋白负相关(分别为p = 0.013,p = 0.013)。我们的结果表明,miR-let-7a通过下调PKM2来抑制非IgA肾炎细胞。
讨论
MiRNA是一种短链的非编码核苷酸RNA，通过直接和间接影响mRNA的转录过程来调节相关基因的表达[6,7]。miRNA在非IgA肾炎发生、发展中，如细胞存活，增殖，凋亡等方面发挥重要作用[8]。
在本研究中，提供了miR-let-7a发挥生理作用的新途径，miR-let-7a特异性结合PKM2 mRNA的3'-UTR区，来影响影响非IgA肾炎的细胞增殖、迁移。总之,我们表明了miR-let-7a / PKM2通路在调节非IgA肾炎细胞增殖,凋亡。
参考文献
1. Liu Z, Zhou H, Wang W, Fu YX, Zhu M. A novel dendritic cell targeting HPV16 E7 synthetic vaccine in combination with PD-L1 blockade elicits therapeutic antitumor immunity in mice. Oncoimmunology. 2016;5:e1147641.
2. Li XL, Liu XX, Cao GS, Ju DD, Jiang H. Narrowing Resection of Parametrial Tissues Is Feasible in Low-Risk Cases of Stage IA2-IB1 Cervical Cancer. J Cancer. 2016;7:1481-6.
3. Sun L, Liu M, Sun GC, Yang X, Qian Q, Feng S, Mackey LV, Coy DH. Notch Signaling Activation in Cervical Cancer Cells Induces Cell Growth Arrest with the Involvement of the Nuclear Receptor NR4A2. J Cancer. 2016 Jun 30;7:1388-95.
论文作者: 赵新颖,
论文发表刊物:《中国结合医学》2019年第02期
论文发表时间:2019/4/8
标签：细胞论文; 细胞系论文; 组织论文; 肾炎论文; 肾小球肾炎论文; 蛋白论文; 肾脏论文; 《中国结合医学》2019年第02期论文;