黄丽霞1 龚业莉1 郭培中2(通讯作者)
（1江汉大学医学院免疫学教研室 湖北 武汉 430056）
（2武汉市中西医结合医院肿瘤科 湖北 武汉 430022）
【摘要】 目的：探讨接骨木（Sambucus）对癫痫大鼠脑内γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和谷氨酸(Glutamate，Glu)表达的影响。方法：利用印防已毒素（PTX）腹腔注射制造大鼠癫痫模型。40只SD大鼠随机分为4组，空白对照组，模型组，苯妥英钠组，接骨木组，每组10只。连续给药8天后，氨基酸分析仪检测各组大鼠海马内GABA及Glu表达的变化，同时观察大鼠的行为学表现。结果：接骨木可明显提高癫痫大鼠脑内GABA含量(P<0.05)，并可降低癫痫大鼠脑内Glu含量(P<0.05)。结论：接骨木可通过调节脑内兴奋性氨基酸和抑制性氨基酸的动态平衡发挥神经保护作用。
【关键词】 接骨木；γ-氨基丁酸；谷氨酸
【中图分类号】R3 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2016）11-0368-02
Effccts of sambucus on the expression of GABA and Glu in epileptic rats Huang Lixia 1 Gong Yeli1 Guo Peizhong2
1 Department of Immunology, Medical School of JiangHan University 430056, 2 Department of Oncology, Wuhan Integrated TCM & Western Medicine Hospital 430022,* Corresponding author: Guo Peizhong
【Abstract】Objective To study the effccts of sambucus on the expression of γ-aminobutyric acid (GABA) and Glutamate (Glu) in epileptic rats.Methods Epilepsy model were made with picrotoxin methods.40 SD rats were divided into 4 groups:the blank control group,the epilepsy model control group,the phenytoin group,the sambucus group.The content of GABA and Glu were detected at the 8th day,and the behavioral changes were observed as well.Results Sambucus could siginificantly up-regulate the expression of GABA and suppress Glu content(P<0.05). Conclusion Sambucus had protective effects on hippocampal neurons by influencing the expression of GABA and Glu in central nervous system.
【Key words】 Sambucus; γ-aminobutyric acid; Glutamate
癫痫，俗称“羊癫风”，主要由大脑神经元突发的异常性放电，从而导致短暂大脑功能障碍的一种慢性疾病，临床特征为长期反复癫痫发作，且伴有不同的脑电图和临床表现。大脑神经元异常放电导致癫痫发作，其兴奋性递质γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和抑制性递质谷氨酸（Glutamate，Glu）与癫痫的发作关系密切[1]。接骨木（Sambucus）是我国民间常用中草药，已研究表明，接骨木具有消炎、镇痛、抗氧化、抗肿瘤等诸多功效且作用广泛[2]。然而，中药接骨木对癫痫发作的研究目前鲜有研究，本实验创新性的将中药接骨木与癫痫发作结合起来，探讨接骨木对癫痫发作的影响及相关机制。
本实验通过采用印防己毒素(PTX)大鼠腹腔注射制作大鼠癫痫模型，通过检测癫痫发作期GABA、Glu的表达以及其生物学行为表现，探讨中药接骨木对癫痫发作的影响及相关机制。
1.材料和方法
1.1 药物和试剂
接骨木提取液、苯妥英钠、印防已毒素（sigma，美国），氨基酸自动分析仪（Cecil，英国）。印防已毒素（PTX）溶于0.9%NaCl，配制成0.01% PTX溶液待用。
1.2 实验动物及分组
SD大鼠40只，雄性，200～250g，由华中科技大学实验动物中心提供。40只大鼠随机分为4组，每组10只，空白对照组，癫痫模型，苯妥英钠组，接骨木组，空白对照组不制造癫痫模型，模型组制备癫痫后给予生理盐水(NS)干预组，苯妥英钠组制备癫痫后给予5.4mg/kg[3]，作为阳性对照组，接骨木组制备癫痫后给予25mg/kg接骨木提取液干预作为实验组。8d后进行相应处理。
1.3 大鼠癫痫模型的制备
大鼠腹腔内注射PTX(2mg/kg)，每日同时间段注射一次，连续注射8d。参照文献[4]的方法进行操作。
1.4 行为学评分
造模后将大鼠放于观察箱中摄像观察大鼠行为学改变并进行评分，观察时间为60min，参照Racine分级标准，分为0级至V级。根据Racine分级，Ⅲ级及其以上标准既认为癫痫模型建立成功。
1.4 GABA及Glu含量的检测
第8天后将大鼠脱颈椎法处死，迅速取出大鼠脑组织，蒸馏水洗净脑组织，置于干燥培养皿中，切取洗净的脑组织迅速将其放人预先盛10%磺基水杨酸5ml的玻璃匀浆器内，2mL/l00mg蛋白定容并匀浆5min，再以2.0×104g冷冻离心10min，所有操作均在冰块上进行。氨基酸自动分析仪20μL进行测定。
1.5 统计学方法
应用SPSS17.0统计软件分析。多样本均数问比较采用单因素方差分析，数据均用均数±标准差（x-±s）表示。
2.结果
2.1 行为学改变
模型组、苯妥英钠组及接骨木组在注射PTX后均出现癫痛发作，癫痛大鼠的行为改变结果显示：如图1所示，注射PTX后模型组大鼠癫痫发作，级别主要以重度为主（Ⅳ度为主），且发作潜伏期较短（潜伏期为10.8±1.3min）；而接骨木组治疗后大鼠癫痫发作级别主要以轻度为主（Ⅱ度为主），潜伏期延长（20.6±2.9min）。与模型组相比，接骨木组和苯妥英钠组大鼠癫痫发作程度及潜伏期均有显著差异(P<0.05)。提示接骨木能够降低大鼠癫痫发作程度，延长潜伏期，从而发挥抗癫痫作用。
图一 接骨木对大鼠癫痫发作程度和潜伏期的影响（*P<0.05，与模型组比较）
2.2接骨木对癫痫大鼠脑组织GABA与Glu含量的影响：如图2A所示，与空白对照组比较，模型组GABA含量降低（169.1±18.9μg/g），差异有统计学意义(P<0.05)，提示模型组（癫痫发作）抑制性神经递质GABA含量。而与模型组相比，接骨木组可明显增加大鼠脑内GABA的含量（190.8±17.8μg/g），差异有统计学意义(P<0.05)；而苯妥英钠组也可增加癫痫大鼠脑中GABA含量（198.5±20.7μg/g），与模型对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)，且苯妥英钠组增加GABA的含量大于接骨木组。
如图2B所示，与空白对照组相比，模型组Glu含量明显上调，差异有统计学意义(P<0.05)，提示模型组（癫痫发作）可增加兴奋性神经递质Glu含量（1558.5±132.3μg/g）；而与模型组相比，接骨木组可明显减少癫痫大鼠脑内Glu的含量（1298.3±118.6μg/g），差异有统计学意义(P<0.05)；与模型对照组比较，苯妥英钠组可显著减少癫痫大鼠脑组织中Glu含量（1346.7±117.8μg/g），差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果提示接骨木可通过提高PTX诱导癫痫大鼠脑组织内神经递质GABA含量，降低其兴奋性神经递质Glu含量，从而发挥抗癫痫作用。
图2.接骨木对癫痫大鼠脑组织GABA和Glu含量的影响（#P<0.05，与空白对照组比较*P<0.05，与模型组比较）
3.讨论
癫痫是常见的慢性神经系统疾病之一，目前癫痫发病机制尚未有统一的标准[5]。较一致的观点是，由中枢神经系统兴奋与抑制的不平衡导致的大脑神经元异常放电，这种兴奋与抑制间的失衡导致癫痫发作，主要与突触传递、离子通道及神经胶质细胞的改变有关[6]。有研究报道，癫痫动物或人脑组织内存在着中枢性氨基酸递质（Amino acid neurotransmitters）的变化，局部或者全身调节中枢性氨基酸的含量可诱发或抑制癫痫的发作，提示癫痫发病与氨基酸递质有着密切的相关性[7]。接骨木是我国民间常用中草药，是苗族、蒙古族、傣族等少数民族独具特色的传统中药。其具有抗炎、镇痛、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化等药理功效[8]。近年来，随着中草药的医药作用越来越引起人们的关注，人们对于药用植物的研究与开发也越来越多。
γ-氨基丁酸（GABA）是中枢神经系统内最主要的抑制性神经递质，其含量的变化引起中枢神经系统兴奋性和抑制失衡、神经细胞过度兴奋以及诱发同步放电，GABA含量的下降是产生癫痫发作的重要原因之一[9]。目前市场上很多抗癫痫药物是以GABA为靶点，通过调解中枢神经系统的兴奋与抑制平衡以达到治疗癫痫的作用。在实验动物癫痫发作时，中枢神经系统内GABA表达降低，而阻断中枢神经系统内GABA表达是很多抗癫痫药物的作用机理，提示中枢神经系统内GABA表达减少、含量降低，与癫痫的发生和发展有密切关系[10]。本实验通过研究发现，SD大鼠经印防已毒素腹腔注射后可诱导明显癫痫发作，GABA含量明显下降，而经接骨木处理后，GABA含量有所回升，与模型组比较，具有统计学差异。提示接骨木可通过提高脑组织内GABA含量发挥抗癫痫作用。
谷氨酸（Glu）是兴奋性氨基酸神经递质，其含量变化直接影响中枢神经系统兴奋性和神经毒性。谷氨酸受体有代谢型受体（mGluRs）和离子型受体（AM2PA，KA和NMDA），分别与G蛋白通道偶联和离子通道相关，进而发挥神经作用[11]。姚君茹等[12]通过实验发现，谷氨酸早期胞内合成增加，后期胞外大量释放可导致癫痫发作。已有多项研究结果表明，Glu与癫痫发作有关[1]。本实验通过研究发现，SD大鼠经印防已毒素腹腔注射后可诱导明显癫痫发作，提高了Glu的含量，而经接骨木处理后，Glu含量有所下调，与模型组比较，具有统计学差异。提示接骨木可通过抑制脑组织内Glu含量从而发挥抗癫痫作用。
癫痫的发生和发展受诸多因素影响[13]，本研究结果显示，给予接骨木预处理和治疗后，大鼠的癫痫发作潜伏期较模型组明显延长，发作等级亦得到减弱。说明接骨木能减弱大鼠的中枢兴奋性，然而不能完全阻止癫痫发作。从分子细胞学分析，接骨木可提高GABA表达，下调Glu含量，从而减弱了癫痫的发作和发展。
探索和发现癫痫的发病机制是寻找治疗癫痫药物的首要基础。中药接骨木对大鼠癫痫疗效虽值得肯定，但仍有潜在的副作用，在广泛应用临床之前，仍需要大量的实验研究，从而更好的为癫痫的治疗提高用药选择。
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论文作者:黄丽霞1,龚业莉1,郭培中2(通讯作者)
论文发表刊物:《医药前沿》2016年4月第11期
论文发表时间:2016/5/19
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