马军[1]2002年在《大鼠骨髓细胞向肝细胞转化的体内外实验研究》文中提出不管是急性肝衰竭还是慢性肝衰竭，尚无哪一种治疗方法能够达到满意的疗效。人工肝、原位肝移植、肝细胞移植等治疗方法已经用于临床很长时间，但由于种种因素限制了它们的应用，如费用高、供体来源缺乏、长期服用免疫抑制剂等。这种状况迫使人们去寻找更为有效和经济的新方法。 90年代，造血干细胞的临床应用逐渐开展起来，如地中海性贫血、白血病、实体瘤大剂量化疗或／和放疗后的造血恢复。在造血干细胞的临床应用和研究中，人们发现骨髓干细胞具有多向分化潜能，在一定环境下，可以转化为其它类型的成熟细胞如神经细胞、骨骼肌细胞等，人们推测骨髓中的干细胞可能是一个复杂的群体，具有不同的分化潜能和方向。 1999年有人报道骨髓造血干细胞可以转化为肝细胞。如果能使患者自身骨髓干细胞增殖和向肝细胞选择性分化，我们便可以用自身骨髓干细胞分化和增殖来替代肝脏功能，同时又能解决异体移植的供体来源缺乏及免疫排斥的问题，具有广阔的应用前景。 有人在骨髓细胞中分离出一类β_2m~-／Thy-1~+细胞，具有肝细胞的一些表型如白蛋白mRNA表达，并在体外诱导分化，出现新的肝细胞表型如CAM5.2，因此这类β_2m~-／Thy-1~+细胞可能是骨髓中的“肝脏干细胞”，骨髓中肝脏干细胞还有那些肝细胞特征，有必要进一步研究。 在骨髓细胞向肝细胞的转化实验中，常用射线照射去除受体动物自身骨髓，使供体骨髓细胞能大量的在受体骨髓腔定居、增殖。在二乙酰 郑州大学2002届博士论文 骨髓细胞向肝细胞转化的体内外实验研究氨基拐（2－AAF）加 CCI。肝损伤模型中，己经发现移植的骨髓细胞可以转变为肝细胞和 AFP用 脏前体细胞，也有人用小剂量的全身照射，证明在无肝损伤的情况下，也有骨髓细胞向肝细胞的转化。虽然在体内研究中，骨髓细胞在肝脏中可以转化为肝细胞，但其机制尚未阐明，推测细胞因子和肝脏局部微环境起着重要作用。 本研究用3种动物模型进行交叉性别骨髓移植，探讨在不同条件下，骨髓细胞向肝细胞转化的情况，并分析2－AAF对骨髓细胞转化率的影响。 联合双向聚丙烯酚胺凝胶电泳 Q．PAGE）及质谱（MS）进行蛋臼质组研究是目前广泛应用的方法，这一技术可以比较不同的细胞或组织蛋白质组的差异，对于研究细胞的分化、肿瘤、衰老具有重要意义。为此，我们初步在本实验室建立ZD－PAGE实验技术，对2．AAF＋PH（部分肝切）模型肝切前后的肝组织的总蛋白进行分离，并找出肝切前后的差异蛋白质点，希望从中找到促使肝脏干细胞活化和骨髓干细胞向肝细胞转化的细胞因子。 材料 禾方法： 本实验用免疫组化、逆转录PCR和 Western blot方法，对骨髓细胞甲胎蛋自mRNA和蛋白的表达进行分析，以确定骨髓细胞中肝脏干细胞标志一甲胎蛋白的表达情况。用逆转录PCR、巢式PCR和基因序列测定检测骨髓细胞中白蛋白mKNA表达情况。 分离大鼠骨髓单个核细胞，分3组进行培养：l）单纯培养基对照组，（含胎牛血清15％人2）大鼠肝损伤血清组（用2－＊AF十＊H肝切模型大鼠肝切后；血清替代胎牛血清人 3）HGF组＊牛血清 1％，加肝细胞生长因子 20ng／mL人用免疫组化、逆转录 PCR和 Western blot方法，以观察大鼠肝损伤血清和 HGF对骨髓细胞转化的促进作用。 将雌性 SD大鼠随机分为 3组，每组 15只。l）R＋BMT（全身照射＋骨髓移植＼ 2）2－AAF＋R＋BMT；3）2．AAF＋PH＋BMT。2．AAF采用灌胃法。各组进行交叉性别骨髓细胞移植，将雄性骨髓移植入雌性受体内，以雄性性别诀定基因 sry作为细胞标记，用原位杂交和 FISH作为检测方 2 郑州大学2O02届博士论文 骨髓细胞向肝细胞转化的体内外实验研究 法进行骨髓细胞向肝细胞转化的分析。 用雌性SD大鼠6只，做2－AAF＋PH模型，进行肝切前后肝脏蛋白质 ZD．PAGE电泳，分析蛋白差异。 结果显示： 1．PCR移植效果初步分析可见，R＋BMT组门例中有 10例 PCR阳性； ZAAF＋PH＋BMT组门例中有 7例阳性，ZAAF＋R＋BMT组 10例中有 6例阳性。 2．sry原位杂交染色发现，第5大各组雌性受体肝索中均未见sry阳性的肝 细胞。 3．第 10大 R＋BMT组可见一例 Sry阳性的细胞位于肝细胞索，FISH染色可 见这一细胞白蛋白mKNA阳性。 4．第20天各组PCR阳性各例均可在肝索中检测到Sry阳性的细胞。FISH 染色可见白蛋白mRNA阳性。 5．经统计学分析第20大各组Sry阳性细胞数无明显差异（P＞0刀5人 6．AFP兔疫组化染色可见，新鲜骨髓细胞和单纯 IMDM／F培养基组呈阴 性；肝损伤血清组和 HGF组培养后 10． 20天，细胞爬片 AFP免疫组化 染色阳性。 7．AFP
罗建君[2]2006年在《左归丸含药血清促进大鼠骨髓间质细胞向肝细胞分化的研究》文中提出目的：研究左归丸含药血清对骨髓间质细胞分化为肝细胞的影响，探讨中医补肾生髓成肝的机制，为促进骨髓干细胞向肝细胞分化的研究奠定实验基础，为补肾治疗肝病的临床应用提供科学依据。 方法：体外培养Wister大鼠肝组织块，收集其培养上清即为条件培养液。取Wister大鼠，随机分组后分别用生理盐水、中药左归丸浓缩煎剂、中药八珍汤浓缩煎剂以10ml／kg的量灌胃，持续15天，第15天灌胃后2小时，颈动脉插管取血，离心后获得正常大鼠血清、左归丸含药血清、八珍汤含药血清。采用贴壁分离，连续传代培养的方法纯化Wister大鼠骨髓间质细胞，反复传代后分为6组。常规培养组始终使用常规培养液(DMEM培养液+体积分数20％胎牛血清+2mmol／L谷氨酸胺)进行培养；HGF诱导组以常规培养液+促肝细胞生长因子(HGF，25ng／ml)和地塞米松(10~(-7)M)进行培养；HGF加左归丸组以常规培养液+促肝细胞生长因子(HGF，25ng／ml)和地塞米松(10~(-7)／M)+10％的左归丸含药血清进行培养；条件培养液加对照血清组以常规培养液+50％的条件培养液+10％正常大鼠血清进行培养；条件培养液加八珍汤组以常规培养液+50％的条件培养液+10％八珍汤含药血清进行培养；条件培养液加左归丸组以常规培养液+50％的条件培养液+10％左归丸含药血清进行培养。培养时间持续28天，动态观察细胞形态变化并于培养第0、7、14、21、28天时留取细胞，免疫细胞化学方法检测肝细胞表面标记CK18、AFP、ALB的表达，PAS染色检测糖原的表达。各标本在统一放大倍数(400×)下，随机选取数个视野，数阳性与阴性细胞数，计算阳性细胞率，比较不同培养组之间差异，两样本间均数比较采用t检验。 结果：诱导后约3天左右即有少量细胞形态开始变化，表现为肝细胞样细胞形态；7～8天呈多边形，胞浆丰富，核大；10天左右与肝细胞体外贴壁形态几乎一样。随着诱导时间的延长，肝细胞样的细胞数量也渐增多。诱导后28天，肝细胞样的细胞仍存活。对照组的细胞仍然呈梭形，传代至15代时细胞开始变得宽大、扁平，逐渐脱壁死亡。左归丸含药血清能促进这一诱导作用，与对照组比较，在诱导后7、14、21、28天，肝细胞样的细胞数量有显着增加的同时，其形态更接近正常肝细胞。常规培养组细胞仅见极少数细胞表达AFP及ALB，各时间点比较阳性细胞率无显着差异。HGF诱导组、HGF加左归丸组、条件培养液加对照血清组、条件培养液加八珍汤组、条件培养液加左归丸组等实验组细胞0天时AFP、ALB仅极少数细胞表达，CK18及糖原未见表达；其总体趋势表现为，AFP在7天时表达明显升高，14、21天时表达又快速减弱，28天时仅少数细胞表达；CK18、ALB及糖原在7天时少量表达，14、21、28天时表达明显逐渐升高。诱导7天时，其AFP阳性细胞率HGF诱导组(63.2±2.6)、HGF加左归丸组(78.9±3.1)、条件培养液加八珍汤组(43.0±2.3)和条件培养液加左归丸组(82.5±3.0)，以上各含左归丸药物血清实验组与对照组比较，差异显着(P＜0.05)。诱导28天时，HGF诱导组其阳性细胞率(％)CK18(60.7±2.3)、ALB(61.3±2.6)、糖原(52.6±2.7)；HGF加左归丸组其阳性细胞率(％)CK18(72.6±2.7)，ALB(78.8±3.4)、糖原(69.2±2.8)；条件培养液加八珍汤组其阳性细胞率(％)CK18(62.8±2.3)，ALB(60.5±2.3)、糖原(59.8±2.4)；条件培
陈建锋[3]2006年在《人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的体内外实验研究》文中指出研究背景 肝脏疾患是影响人类生活质量和生命健康的重要疾病之一。不管其病因如何，这些疾病都将逐渐发展，演变为肝纤维化或肝硬化，最终出现肝脏功能衰竭。对于各种类型的终末期肝病，肝移植在理论上应该为最理想的治疗选择。但由于供体缺乏及保存供体的时间限制的原因，很多病人在等待肝移植的过程中即死亡。 生物人工肝系统能使终末期肝病病人桥接肝移植。肝细胞具有强大的再生能力，临时应用生物人工肝系统也可以解决急性肝功能的失代偿，促进肝细胞再生，肝功能可以暂时恢复，争取到等待肝移植的时间。经过几十年的研究，生物人工肝系统已从非生物型、生物型人工肝系统发展到混合型人工肝系统，国内外已经有不少种类的人工肝系统应用于临床。肝细胞是生物人工肝系统的主要生物成分，生物人工肝系统的支持作用主要来源于肝细胞的生物代谢功能。然而肝细胞不易在体外培养生长，如何获得高质量、来源丰富的肝细胞是生物人工肝和干细胞移植面临的共同问题。 目前肝细胞来源主要是人源性肝细胞和动物源性肝细胞，但都各有不同的缺陷。最为理想的是能在体外培养且保持肝细胞特性和功能的肝细胞，这种细胞必须具有合成代谢、解毒和生物转化功能并能长期存活，可以大量扩增，解决
王豪勋[4]2005年在《同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗肝硬化的实验研究》文中指出背景与目的 肝硬化是我国常见疾病和主要死亡原因之一。其关键在于预防、早期诊断、针对病因的早期治疗,使病情缓解及延长代偿期。对失代偿期患者主要是对症治疗、改善肝功能和处理并发症。原位肝移植可以从“根本”上治疗失代偿期肝硬化,但供肝缺乏、费用昂贵、需长期服用免疫抑制剂等缺点限制了其在临床的广泛应用。虽然人工肝对改善终末期肝病患者症状有一定作用,但物理型人工肝的发展还不完善,无法替代肝脏的合成及生物转化功能,摆脱不了血液透析,并非真正意义上的人工肝,治疗效果不能达到期望的水平;生物型人工肝由于肝细胞来源匮乏而限制了其临床应用。肝细胞移植治疗也因肝细胞来源所限而停滞不前。目前急需找到一种治疗肝病的高效手段或者解决肝细胞的来源问题。 具有无限或较长期自我更新和多向分化潜能的干细胞及其横向分化特性的研究为各种疾病的治疗提供了一种新的手段。骨髓中含有两类干细胞,一类是造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs),另一类是间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)。MSCs源于中胚层,具有很强的自我更新能力和可塑性,在适当的条件下,可以跨胚层“横向分化”为不同胚层来源的细胞如成骨细胞、神经细胞、肝系细胞等。MSCs一方面因其来源广泛,取材方便,且对身体无害,另一方面MSCs无免疫排斥反应,所以成为近年来的研究热点。干细胞在生物医学领域取得的成就,为肝脏疾病的治疗提供了新的思路。国内外均已证明MSCs在体内、外均可转化为肝细胞样细胞,并能行使肝细胞的合成、分泌等功能。因此,本课题旨在利用大鼠肝硬化模型,进行性别交叉骨髓MSCs移植,探讨骨髓MSCs体内的整合和对肝硬化治疗的情况,为终末期肝病的治疗提供一种新的治疗手段或为生物型人工肝提供一种新的细胞来源。
赵继学[5]2008年在《骨髓间充质干细胞移植对小鼠急性肝功能衰竭治疗作用的实验研究》文中指出本实验采用密度梯度离心联合贴壁培养法分离、纯化及扩增昆明小骨髓MSCs,流式细胞仪进行细胞周期分析和检测P3代MSCs表面标志。建立CCl4灌胃诱导的昆明小鼠急性肝功能衰竭动物模型。将骨髓MSCs经尾静脉移植于急性肝衰竭小鼠体内,移植后通过观察血清学、病理学和生存率的变化,来检测骨髓MSCs移植对急性肝衰竭的治疗效果,探讨骨髓MSCs移植治疗急性肝衰竭的可行性。将MSCs用荧光染料DAPI标记后,经尾静脉移植于肝衰竭小鼠体内,检测DAPI标记细胞在小鼠肝脏内的迁徙定居情况;同时检测MSCs移植后肝脏内TGF-β1和ALB的表达情况。探讨MSCs移植治疗急性肝衰竭的可能机制。结果显示:分离培养的MSCs,75.27%的细胞处于G0-G1期,表明MSCs具有强大的分化增殖能力,P3代MSCs强表达CD44,基本不表达造血谱系标记CD34。MSCs经尾静脉移植于急性肝衰竭小鼠体内,明显改善了受损肝脏的功能,显着提高了肝衰竭小鼠的生存率,MSCs移植对急性肝衰竭有明显治疗作用。MSCs移植后,迁徙并定居于受损肝脏,肝脏内TGF-β1的表达明显减低,ALB的表达明显增高。骨髓MSCs移植治疗急性肝衰竭的可能机制:(1)骨髓MSCs迁徙并定居于受损肝脏内,在肝内转化成有功能的肝细胞。(2)抑制TGF-β1的表达,抑制TGF-β信号通路激活,减弱TGF-β抑制肝细胞生长的作用,促进肝再生。
周一鸣[6]2005年在《干细胞分化及其对急性肝衰竭大鼠治疗的实验研究》文中研究表明肝功能衰竭严重威胁人类健康。原位肝移植是目前最好的治疗手段,但治疗费用高且受肝源限制,迄今仍难以作为终末期肝病患者的常用治疗方法。作为肝移植的替代治疗,有研究证实肝细胞移植有助于肝损伤的恢复。但由于肝细胞同样来源受限,而且分离的肝细胞寿命很短,冻存后活性差等原因,严重阻碍了其临床应用。肝脏卵圆细胞是成体肝脏干细胞,在严重肝损伤或肝细胞再生受到抑制时,则卵圆细胞增殖进而分化,来完成肝组织的再生。探讨卵圆细胞的增殖与分化特性,了解调控卵圆细胞生长和分化的细胞因子及其之间的相互关系,对肝损伤的修复具有重要意义。现已证实成体骨髓干细胞可以分化为肝实质细胞。目前骨髓干细胞的提取及其体外培养体系不一致, 诱导方法、诱导因子以及诱导时间等问题的研究还不充分。因此,很有必要对骨髓干细胞体外诱导分化进行探讨。有关骨髓干细胞移植治疗肝功能衰竭的研究已取得可喜的成果。细胞移植后是否可分化为肝细胞以及移植后受体的肝功能恢复问题,目前仍有争议。另外关于移植细胞如何进入肝实质?移植途径与移植细胞的转归是否有关?移植细胞在受体体内的分布等问题仍然不清楚。为此,本研究分以下几部分进行:1、以大鼠肝干细胞系WB F-344 细胞为细胞模型,对多种细胞因子在体外对其生长分化的影响进行探讨;2、提取成年小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs),对其体外分化体系进行优化;3、制造急性肝衰竭大鼠模型,并进行同种异体骨髓间充质干细胞移植,观察其治疗作用,了解移植细胞的体内分布。通过上述研究,旨在1、初步了解肝脏卵圆细胞的分化特性及其机理;2、寻找骨髓间充质干细胞体外诱导分化为肝细胞的更佳条件;3、探讨骨髓间充质干细胞移植的更佳途径,了解骨髓间充质干细胞移植治疗急性肝衰竭的可行性。
孙嫣[7]2004年在《体外诱导人骨髓间充质干细胞及其亚群HLA-DR～-C-Kit～-细胞向肝系细胞分化的实验研究》文中提出对于各种终末期肝病，临床上主要采取基础疗法和对症治疗，肝移植作为治疗急、慢性肝衰竭的有效手段，由于供肝缺乏、费用昂贵、免疫排斥等问题，使其临床应用受限。虽然生物人工肝对改善终末期肝病患者症状、延缓预后有一定作用，但由于肝细胞来源匮乏，限制了其临床应用，肝细胞移植治疗也因肝细胞来源所限而停滞不前。目前迫切需要找到一种高效治疗肝病的措施，或解决肝细胞的来源问题。干细胞研究的进展为利用干细胞移植和／或干细胞工程生产肝细胞来治疗各种肝病提供了可能性。 目前干细胞研究领域中最受重视的是对骨髓干细胞的研究。骨髓中有两类干细胞，一类是造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)，另一类是间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)。骨髓MSCs来源于中胚层，具有很强的自我复制能力，能产生具有各种表型的子代细胞，在特定的诱导条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞、成肌细胞和神经细胞等。骨髓MSCs一方面因其取材方便对身体健康损害小，另一方面用自体干细胞诱导构建的组织不存在MHC限制，所以日益受到重视。最近通过细胞移植显示，在体内骨髓MSCs也有形成肝细胞的能力。因此，本课题旨在体外培养人骨髓间充质干细胞及其亚型HLA-DR~-C-Kit~-细胞，观察HGF、FGF4以及两者联用对培养的人骨髓MSCs及HLA-DR~-C-Kit~-细胞的作用，寻找影响和调节这两类细胞向肝细胞样细胞定向分化的最佳条件，探讨体外诱导培养获取具有表型和功能特征的肝细胞样细胞的可能性，如果诱导成功，可为现代细胞工程学提供新的细胞来源，为临床上终末期肝病的治疗带来新的希望。郑州大学2004年硕士研究生毕业论丈体外诱导人甘髓间充质干细胞及其亚群lILA~DRC一kif细胞向肝系细胞分化的实验研究材料和方法 骨髓细胞来源于健康志愿者的胸骨，年龄2一35岁。本实验分两组:A组:骨髓间充质干细胞组;B组:HLA一DR一C一Kit一细胞组。A组细胞通过密度梯度离心(密度1.0779/ml)获得。在细胞达到对数生长期后传至第叁代时，用流式细胞仪检测骨髓间充质干细胞的纯度。B组细胞为第叁代的A组细胞用磁式分离仪分离获得。以上两组细胞在达到对数生长期之前用含10%胎牛血清的DMEM培养基(低糖)培养，在细胞达到对数生长期后开始诱导时，接种于预先铺有爬片的24孔培养板中，爬片预先用1林g/m1F’N (纤维连接素)处理，用含5%FBS、1 X ITS(胰岛素一转铁素一硒混合物)、lmg/m1BSA (牛血清白蛋白)、4.7林g/ml亚油酸、10一SM几地塞米松、10一树L抗坏血酸、loou/ml青霉素、100U/m1链霉素以及10ng/m1EGF的DF培养基培养，根据所加生长因子的不同又各分为四组:HGF(HePatoeyte即o，几h factor，肝细胞生长因子)组、FoF4(Fibroblastgrov改h factor一4，纤维母细胞生长因子一4)组、HGF+FGF4组以及无生长因子组，每组设12个复孔。 以上各组细胞接种密度为2 xl护/c mZ，分别留取新鲜分离的细胞及各组诱导培养后O天、7天、14天、21天、28天时的细胞，用免疫细胞化学方法检测肝系细胞的特异性标志:CK18、AFP、白蛋白以检测诱导后的细胞表型，用PAS法进行糖原染色检测诱导后的细胞功能，Rl，一PCR法检测新鲜分离的骨髓细胞中AFP、C一met(HGF受体)、FGFRZ(FGF4受体)的mRNA表达情况。 统计学分析:各指标的阳性表达情况在不同时间点、不同组、不同处理因素之间的比较，阳性率以无勺表示，以。=0.05为检验水准，用sPsslo.o软件分析，采用重复测量数据方差分析进行统计。结果 1密度梯度离心法分离的人骨髓细胞，大小均匀，透亮度好，台盼蓝染色细胞活率>95%。细胞达到对数生长期后传至第叁代后，用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29和CD44，表达率分别为90.6%和91 .5%，说明分离的人骨髓间充质干细胞纯度较高。 2磁式分离仪所得的HLA一DR一C一擞t一细胞，在倒置显微镜下观察，细胞透亮度好，台盼蓝染色细胞活率>95%。 3人骨髓MSCs24小时内贴壁，以后逐渐增多，细胞成克隆性生长，3天时可见郑州大学2004年硕士研究生毕业论文体外诱导人骨做间充质干细胞及其亚群HLA一D玄C一kif细胞向肝系细胞分化的实验研究到呈梭形的细胞，10天左右可达到对数生长期。进行磁式分离后，细胞24小时内迅速贴壁、伸展，增殖迅速，3一4天即可达对数生长期。 4在细胞培养过程中发现单用HGF诱导时细胞增殖速度慢，而单用FGF4及联用HGF和FGF4诱导时细胞增殖速度较快。 5新分离的细胞及两组细胞在诱导0天时均未检测到肝系细胞的标志，然而用RT一PCR法可在新分离的骨髓细胞中检测到AFP以及c一met和FGFRZ mRNA表达。 6两组细胞用含生长因子的培养基培养后均可检测到肝系细胞的标志，而不含生长因子的培养基培养后未检测到相应标志的表达。 7统计学分析显示，CK18、AFP、白蛋白以及糖原这四个指标的阳性率在两组之间均无明显差异沙0.05)，在单用HGF、单用FGF4或两者联用时也无明显差异印>0.05)，各指标的阳性率随培养时间的变化而有差异印<0.01)。结论 1密度梯度离心法适于分离人骨髓间充质干细胞，且活率和
何念海[8]2004年在《人胎儿间充质干细胞体外分离培养及诱导分化为类肝细胞的实验研究》文中研究指明背景近年来,干细胞因其作为生物医学组织工程技术和治疗性克隆技术的种子细胞,为实现人类健康长寿的梦想带来了新的希望,而成为生物医学领域研究的热点。根据干细胞的分化阶段,分为胚胎干细胞(embryo stem cells,ESCs)和成体干细胞(adult stem cells,ASCs)。目前异体来源的ESCs在临床应用上还需要攻克细胞分化机制、免疫排斥等问题,而治疗性克隆获得的ESCs虽可以解决免疫排斥问题,但其技术复杂、离分化完全的功能细胞距离较远。ASCs存在于成体组织中,具有来源丰富、可塑性强、离成熟细胞近和多向分化潜能等特点,而且可以实现个体化治疗,无免疫排斥问题,因此是最具有临床应用优势的种子细胞。目前已在成人骨髓、软骨、牙髓、血液、神经、肌肉、脂肪、皮肤、角膜缘、肝脏、胰岛等多种成体组织中发现了干细胞。现已证实成体干细胞有多向分化潜能,还可以横向分化为不同类型的特化细胞甚至发生逆分化为更原始的干细胞。骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MMSCs)作为ASCs中最易获得的细胞,具有向多种中胚层和神经外胚层甚至内胚层来源的组织细胞分化的能力,这些细胞包括肌细胞、成骨细胞、软骨细胞、成纤维细胞、皮肤细胞、神经细胞、脂肪细胞等。大量研究显示MMSCs或者造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSCs)可在人为诱发肝脏病变后实验鼠体内分化为肝细胞,重建肝脏,使病鼠肝脏功能恢复正常。同时多家研究者在体外利用小鼠骨髓细胞或来自骨髓的成体多潜能干细胞在不同条件下分化为类肝细胞。MSCs具有可反复多次采集和自体移植或应用而不出现免疫排斥反应的优势。如果能够利用易于获得的MSCs在体外诱导分化为成熟肝细胞,将为肝细胞移植及生物人工肝提供大量的细胞来源。中国肝病患者众多,对肝硬化、肝坏死或遗传性肝脏疾病的病变部位实行细胞替代或基因转移治疗是新发展起来并极有前景的肝脏病学治疗策略。适合肝脏疾病细胞治疗的供体细胞应具有以下特点:①易于获得、培养、增殖,或建立细胞系;②能定向分化国家高技术研究发展计划(863)资助项目(人肝细胞扩增分化及人源化血细胞研究,No.2001AA216161)<WP=18>为所需的肝细胞或胆管上皮细胞;③移植入体内能长期存活;④不诱导免疫排斥反应,对宿主无损害;⑤如果用于基因治疗,目的基因可高效转染供体细胞。MMSCs具备上述大部分条件,因此引起肝病研究者的高度关注。如果利用人自身骨髓间充质干细胞横向分化为肝细胞则为肝脏疾病的细胞治疗提供了另一个选择。虽然ASCs的研究已经取得较大进展,但在临床上应用还有许多问题,目前的多数实验结果来自动物体内实验,而且许多是群体细胞研究,并未在克隆细胞水平得到证实。人ASCs的特性是否与动物一致,体外结果是否与体内一致还不知道。更重要的是ASCs的分化潜能到底有多大及分化的分子机制还不十分清楚。ASCs在临床上应用还存在体外分离、扩增、诱导及体内移植后增殖调控等技术问题。MSCs体内移植尚不能达到大规模增殖,体外向肝细胞转化尚未见报道。ASCs的应用研究刚刚起步,但现代生物技术在ASCs相关研究中的应用必将加快其在临床移植修复治疗中的应用进程。因此我们尝试利用人胎儿MMSCs在体外向类肝细胞诱导,观察人胎儿MMSCs的特性,期望在成体干细胞横向分化中作一些基础研究工作。尝试为临床肝病治疗中肝细胞来源提供新的可行性途径。目的1. 建立人胎儿骨髓、脐带血和肝脏间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)的分离培养方法,观察细胞生物学特性和细胞表型,获得大量的人源性MSCs。2. 人胎儿MMSCs体外向类肝细胞诱导分化的条件建立及优化。3. 人胎儿MMSCs来源类肝细胞的分子生物学鉴定。4. 人胎儿MMSCs来源类肝细胞的功能和超微结构评估。方法1. 共收集12个人胎儿,平均孕周为18.5±4.6周,引产后4℃低温保存。收集15份脐带血。采用体外细胞培养技术,分离培养人胎儿骨髓、脐带血和肝非实质细中MSCs,并研究其增殖及生长特征。2. 采用体外分离培养的MMSCs为研究对象,设计不同的诱导分化条件进行体外诱导,观察细胞诱导分化过程中形态结构变化及细胞生物学特性,应用免疫组化检测肝细胞标志ALB和CK18的表达,建立人胎儿MMSCs向类肝细胞分化的优化条件。3. 收集诱导培养第4d、7d、14d、21d、28d时的细胞爬片,SABC免疫组化法DAB显色检测肝细胞早期标志AFP、CK19及早期转录因子GATA4,成熟肝细胞标志ALB、CK18、GST-π、肝细胞转录因子HNF1α;提取诱导分化第10d和第28d细胞RNA及蛋白质,设计AFP、CK19、ALB、CK18、CYP1B1、CYP2B6引物,进行RT-PCR,观<WP=19>察在mRNA水平肝细胞标志的表达,采用Western-Blot检测CK18、AFP、ALB的表达量。4. 以未诱导的MMSCs作对照,对诱导4d、7d、14d、21d、28d MMSCs采用ELISA法检测培养上清中人白蛋白水平,脲酶法检测合成尿素的能力,过碘酸希夫试验进行糖原染色,电镜观察细胞超微结构。结果1. 0.5～2h内尽快分离骨髓,24h换液后可获得约300±80个贴壁细胞,5个细胞以上的集落为15±6个;培养细胞在种植后1～3d为生长滞留期,第4d达到对数生长期,以后进入到平台期,细胞分裂指数曲线的趋势与生长曲线基本类似,在达到对数生长期后,分裂相?
何忠杰[9]2006年在《大鼠骨髓间充质干细胞分化为类肝细胞的实验研究》文中研究表明研究背景 目前，肝炎、感染、创伤、肿瘤等引起的晚期终末肝衰竭的患者越来越多，对于肝衰竭或肝功能支持替代方法成为临床的一大难题。现在的临床治疗方法包括肝脏移植、肝细胞移植、肝脏干细胞移植。其中原位肝移植是治疗急性肝功能衰竭、终末期肝病、代谢性肝病最为有效的方法，但是由于其供体来源极其有限，技术要求高，经济费用大，很难满足众多患者需要，许多患者在痛苦的等待中死亡。肝细胞移植也开展了数十年，其操作简单，价格便宜，曾经颇为流行，但由于其供体缺乏和免疫排斥反应问题而影响到进一步的发展。肝脏干细胞是近几年研究的热点，由于其来源于自体而没有移植后的免疫排斥反应，是合适的肝脏损伤后肝衰竭的移植物并有望成为一种新的临床方法。但经过研究发现，肝脏本身干细胞的数量极其微少，并且其在体外增殖较为困难，限制了这个研究的发展前景。 骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)在一定条件下可以定向分化成为某种成体干细胞、成体细胞或者横向分化为多种组织细胞的潜力被证实了，因而备受人们关注，又有研究发现：它可能是肝脏干细胞的来源之一，也有证据表明MSCs在肝脏损伤的修复中起到非常重要的作用。在此过程中，MSCs的分离、培养和性质鉴定等方面的研究取得了一定进展。骨髓干细胞是成体干细胞中的主要来源部分，它主要由间充质干细胞与造血干细胞组成。造血干细胞在胚胎早期具有分化成内、中、外叁个胚层的潜能，以后
庞全海[10]2005年在《山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及体外分化潜能的研究》文中研究表明骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)是来自于骨髓的两种干细胞之一,在人、小鼠、大鼠、兔、猪等许多物种的研究证明了该类干细胞具有体外分化为多种细胞表型的能力,有望成为未来细胞/基因治疗、组织工程的主要种子细胞之一。但是,迄今未见关于山羊,特别是成年山羊骨髓间充质干细胞分离、培养、分化等方面的系统研究报道。本研究目的在于阐明山羊骨髓间充质干细胞的生物学性能及其分化潜能,以便未来利用该类细胞作为疾病细胞/基因治疗的模型,以及利用该类细胞作为细胞生物反应器体外生产生物活性物质,进而建立山羊骨髓间充质干细胞细胞系。为此,本试验利用成年关中奶山羊为对象,较为系统全面地研究了其骨髓间充质干细胞的分离、培养、扩增、形态学、生长特性、细胞表面标志,以及体外诱导分化能力。结果如下:1. 本试验应用贴壁分离法或密度梯度离心法成功分离获得关中奶山羊髂骨骨髓间充质干细胞,体外培养到第21 代,仍然保持其干细胞的特性,并已扩增到2.8×108细胞。2. 本试验所分离的关中奶山羊骨髓间充质干细胞呈多角形、叁角形或长梭形,类似于人和其他物种的间充质干细胞。3. 扫描电镜下,山羊骨髓间充质干细胞表面较为粗糙,有多个突起,并有较多微棘和丝突,当多个细胞同时存在时,这些丝突相互搭接成网状。透射电镜下,山羊骨髓间充质干细胞的结构与其他物种基本相似,即表现为细胞内有大量扩张的粗面内质网、线粒体,分泌功能旺盛,具有该类细胞的典型特征:细胞核质比大、胞浆中细胞器少、核仁明显处于功能静息期。4. 免疫细胞化学分析表明,山羊骨髓间充质干细胞能够表达间充质干细胞的表面标志CD29、CD44、CD105、CD106 以及CD166(阳性),而不表达造血干细胞的标志CD14、CD34、CD45、c-kit (阴性),和其他物种的骨髓间充质干细胞相似。这些标志的检测有助于鉴定间充质干细胞。但本试验还发现,山羊骨髓间充质干细胞也表达TGF-α,其意义需要进一步阐明。5. 山羊骨髓间充质干细胞可以在体外用5-氮胞苷诱导分化为心肌细胞表型,能够表达α-actin 抗原,呈PAS 染色阳性,并分泌糖原,从而为未来利用这种细胞进行心脏疾病细胞/基因治疗的模型研究提供了科学依据。同时,这也是和骨髓造血干细胞的区别之一。6. 用HGF 和尼克酰胺向胰岛β-细胞诱导后,山羊骨髓间充质干细胞能够变为较典
参考文献：
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[10]. 山羊骨髓间充质干细胞的分离培养及体外分化潜能的研究[D]. 庞全海. 西北农林科技大学. 2005
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