【摘 要】目的：对参芎葡萄糖注射液应用细菌内毒素检查法的可行性探讨。方法：依据《中国药典》2010年版二部附录细菌内毒素检查法，确定参芎葡萄糖注射液的有效稀释浓度和细菌内毒素限值。结果：参芎葡萄糖注射液经稀释6倍后对鲎试剂无干扰作用，细菌内毒素的限值为1.5EU/ml。结论：可用细菌内毒素检查法取代热原检查。
【关键词】细菌内毒素；鲎试剂；参芎葡萄糖注射液；干扰试验
【中图分类号】R927 【文献标识码】B 【文章编号】1674-8999（2015）6-0115-01
参芎葡萄糖注射液有抗血小板聚集,扩张冠状动脉,降低血液粘度,加速红细胞的流速,改善微循环,并具有抗心肌缺血和心肌梗死的作用，为临床常用药。作为重点检验项目之一的安全性评价，目前仍采用家兔法检查热原。细菌内毒素检查法具有快速、灵敏、操作简便、重现性好的特点，为此参考《中国药典》2010年版二部附录细菌内毒素检查法[1]，应用鲎试剂对参芎葡萄糖注射液进行细菌内毒素检查的可行性研究，提供更为科学的检测方法。
1 仪器与试药
XW-80A 旋涡混合器（上海医科大科仪器厂）；鲎试剂（湛江安度斯生物有限公司，批号：1310201，灵敏度0.25EU/ml；福州新北生化工业有限公司，批号：13121112，灵敏度0.25EU/ml），细菌内毒素检查用水（湛江安度斯生物有限公司，批号：1402070，内毒素含量≤0.003 EU/ml），细菌内毒素工作标准品（中国食品检定研究院批号：150601-201377，每支70 EU），参芎葡萄糖注射液（贵州景峰注射剂有限公司，批号：20131003、20131084、20131127）。
2 方法与结果
2.1 参芎葡萄糖注射液中细菌内毒素限值（L）确定
根据公式L＝K/M，其中，K为每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K＝5.0 EU/（kg?h），M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量[2]。根据参芎葡萄糖注射液批号为20131084的药品检报告质量标准项目中热原检查方法为家兔法，药品说明书得知：参芎葡萄糖注射液用量：静脉滴注100～200ml/次；参芎葡萄糖注射液临床最大用量成人为200ml，按成人体重60kg计算，代入公式计算参芎葡萄糖注射液的细菌内毒素限值，L=K/M=5.0／（200/60）=1.5EU/ml。
2.2 供试品的最大有效稀释倍数（MVD）
市售鲎试剂的灵敏度（λ）在0.5～0.03EU/ml之间，根据《中国药典》2010年版二部附录“细菌内毒素指导原则”，参芎葡萄糖注射液的有效稀释倍数为3～50倍，本试验采用灵敏度为0.25EU/ml的鲎试剂，MVD=L/λ=1×（1.5/0.25）=6倍。
2.3 供试品的干扰初筛试验
用BET水将参芎葡萄糖注射液分别稀释成3、6、12、24、50倍的系列浓度，以各稀释倍数的样品将WSE制成2λ、1λ、0.5λ、0.25λ系列浓度的供试品内毒素溶液，与鲎试剂混合进行抑制试验。结果显示，供试品原液和稀释3倍时对部分鲎试剂有抑制作用，当稀释至6倍时无干扰作用，2份样品结果均相同，见表1。
2.4 供试品的干扰试验
根据干扰初筛试验结果，最小不干扰浓度为6倍样品稀释液。为最终确认是否存在干扰因素的影响，本试验采用6倍样品稀释液进行正式干扰试验。用参芎葡萄糖注射液（BET水6倍稀释液）将WSE稀释制成2λ、1λ、0.5λ、0.25λ系列浓度的供试品内毒素溶液，每一浓度平行做4管，另取BET水和6倍样品稀释液各做4管阴性对照液，依法操作。结果表明，Es均在0.5λ～2.0λ范围内，且Et也均在0.5 Es～2.0Es范围内。说明样品稀释6倍后，对鲎试剂无干扰作用。见表2。
2.5 供试品溶液的细菌内毒素检测
根据干扰试验的结果和拟定的细菌内毒素浓度，取样品3批，分别用BET水稀释6倍后，采用两个厂家的鲎试剂进行检测，结果均符合规定，见表3。
3 讨论
3.1 采用两个厂家的鲎试剂对3个批次的样品进行干扰试验，从初筛试验可以看出，不同厂家的鲎试剂,其特异性各不相同,参芎葡萄糖注射液原液对鲎试剂有干扰作用，稀释3倍液对部分厂家鲎试剂有干扰作用，当样品稀释至6倍时，可以排除干扰。确定最小不干扰浓度为6倍样品稀释液，细菌内毒素的限值为1.5EU/ml。结论：可用细菌内毒素法检查取代热原检查，为确保试验结果的准确可靠，建议实际操作时将样品稀释6倍或采用更高灵敏度的鲎试剂。此试验说明，细菌内毒素检查法可以代替家兔法用于热原检查。
3.2 减少或排除参芎葡萄糖注射液生产带来的干扰因素：使用超滤法去除细菌内毒素等干扰因素[3]；根据实际样品干扰稀释倍数调整同批次生产总量；注意在原料生产、半成品、成品生产过程中，粗过滤纸、精过滤膜、滤器、管道等材料所带来的细菌内毒素、干扰因素，特别是粗过滤纸用量要适宜。生产过程严格按照操作规程，重视配制、分装等室的清洁、消毒。滤器、管道等用具清洁应使用洗涤剂加扫尘工具，彻底冲洗干净。室内消毒可采用紫外线+臭氧机等方法灭菌。不断提高药品质量，确保临床用药安全。
参考文献
[1] 国家药典委员会.中国药典[S].二部.北京:中国医药科技出版社,2010:附录99
[2] 张秀花. 丹红注射液中细菌内毒素的检测[J].中国医药导报.2011，8（29）：51-52
[3] 李淼，徐玉玲，宋娟，等. 热毒宁注射液生产过程中关键工序对细菌内毒素去除效果研究[J].中国中药杂志.2011，36（6）：663-665
论文作者:吕先明
论文发表刊物:《中医学报》2015年6月第30卷供稿
论文发表时间:2015/10/12
标签：内毒素论文; 注射液论文; 细菌论文; 葡萄糖论文; 干扰论文; 试剂论文; 样品论文; 《中医学报》2015年6月第30卷供稿论文;